基因工程复习提纲-微软雅黑v113.doc

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1、41基因工程复习提纲1. 什么是基因？基因：是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。种类：编码蛋白的基因、只转录而无翻译功能的基因（tRNA，rRNA）、不转录的基因。2. 基因工程的诞生l 基因工程诞生于1973年。 19731974年，美国科学家科恩等以大肠杆菌为材料，成功地进行了三次基因工程试验。试验结果证明，用基因工程可以打破不同物种间在亿万年中形成的天然屏障，任何不同种类生物的基因都有可能通过基因工程技术而组合到一起。人类进入了激动人心的基因工程时代。l 第一个实现DNA重组的人Berg1972年，Berg用E.coR切割SV40DNA和phage

2、DNA，经过连接组成重组的DNA分子。Berg是第一个实现DNA重组的人。l 第一个取得基因工程成功的人Cohen1973年，Cohen Group将E.coli的tetr质粒psclol和nersrR6-3质粒进行体外限制酶切割，并连接成一个新的质粒，转化E.coli，在含四环素和新霉素的平板上筛选出了tetrNer的转化子,实现了细菌遗传性状的转移。这是基因工程史上的第一个克隆并取得成功的例子，这一年被定为基因工程诞生的元年。Gohen Group第一次实现了细菌遗传性状转移示意图1、 理论上的三大发现（1）40年代发现了生物的遗传物质是DNA。 （2）50年代搞清楚了DNA的双螺旋结构和

3、半保留复制机理。 （3）60年代确定了遗传信息的传递方式。2、技术上的三大发明（1）限制性核酸内切酶（restriction enzymes）的发现l 20世纪4060年代，科学家们就为基因工程设计了美好的蓝图，但是面对庞大的dsDNA束手无策，无从下手把它切成单个基因片断。l 当时的酶学知识已有相当的发展，但是没有一个已发现的酶能完成这样的使命。l 1970年，Smith和Wilcox在流感嗜血杆菌（Haemophilus inffuenzae）分离纯化了Hind，取得了突破，打破了基因工程的禁锢，迎来了改造生物的春天，为基因工程奠定了最为重要的技术基础。（2）DNA连接酶（ligase）的

4、发现（3）基因工程载体（vector）的发现l 有了切割与缝合（ligase）基因DNA的工具，还得有一个“车子”将重组DNA送到宿主细胞中去。l 1946年起，Lederberg开展了细菌性因子（F因子）的研究。50-60年代相继发现了R因子（抗药因子），CoE(大肠杆菌因子)等质粒。l 直到1973年,Cohen开始将质粒作为基因工程载体使用（至今一直是基因工程最重要最广泛使用的载体）。这是基因工程的第二个技术准备。3. 基因工程的定义及三大基本元件。l 定义：基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（

5、即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。（基因工程的基本特点是，分子水平操作，细胞水平表达） （重组DNA技术又称为分子克隆技术，是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序。）l 供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。4. 基因工程的研究内容(1) 从生物有机体复杂的基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段； (2) 在体外，将带有目的基因的DNA片段连接到能够自我复制并具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子；

6、(3) 将重组DNA分子引入（转）到受体细胞(亦称宿主细胞或寄主细胞)；(4) 从大量的细胞繁殖菌落中，筛选出具有重组DNA分子的细胞克隆； (5) 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出所需要的物质。5. 基因工程的技术准备及技术支撑。核酸凝胶电泳技术；核酸分子连接技术；细菌转化技术；DNA序列分析技术；寡核苷酸合成技术；基因定点突变技术；聚合酶链式反应（PCR）技术。6. 基因工程的基本用途a分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源；b.大规模生产生物活性物质；c.设计、构建生物的新性状甚至新物种7. 核酸酶的分类核酸酶能够将核苷酸链的磷酸二酯键

7、切断的酶，属于水解酶。l 根据核酸底物分RNA酶（Rnase）；DNA酶（Dnase）；底物非专一性核酸酶l 根据作用方式分内切核酸酶；外切核酸酶l 根据对底物碱基专一性分碱基专一性核酸酶（切割部位的碱基序列高度专一性）；非碱基专一性核酸酶（切割部位的碱基序列随机性）8. 细菌中的防卫系统：限制与修饰现象。 限制-修饰系统 a.限制作用：是指一定类型的细菌可以通过限制性核酸内切酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制。 b.修饰作用：生物细胞(如宿主)自身DNA分子通过甲基化酶的作用，在碱基特定位置上发生了甲基化，可免遭自身限制性内切酶的破坏。

8、c.限制-修饰作用实际就是细菌中的限制性内切酶降解外源DNA，维护自身遗传稳定的保护机制。 细菌中的防卫系统：限制与修饰现象 （1）细菌在其感受态的生理条件下，很容易吸收外源DNA进入体内。这种感受态可以是人为的，也可以是在自然条件下发生的。如果细菌不加限制地接受所有的外源DNA，细菌本身就会很快发生遗传变异甚至死亡。 （2）限制性核酸内切酶：可以帮助细菌限制外来DNA的入侵。 （3）甲基化酶：对该特异位点的碱基进行甲基化修饰，被修饰的DNA就不再被相应的限制酶切割了。 （4）细菌自身的DNA受到甲基化修饰，得以保存。 （5）外源入侵的DNA未来得及甲基化，被降解 。图 核酸内切限制酶EcoR

9、及其修饰的甲基化酶MEcoR的限制与修饰作用EcoR识别序列经MEcoR甲基化后，就再不能使EcoR所切割9. 作为分子克隆宿主菌的大肠杆菌（如DH5）的必须条件分子克隆宿主菌（E. coli DH5），必须是 （1）rec基因缺陷型的菌株：保证不与外来DNA分子发生遗传重组。 （2）限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株：保证外来DNA分子不会受其限制酶的降解。10. 限制性核酸内切酶1) 最重要的是哪一类？型酶的作用方式在基因工程中具有十分重要的价值，是基因工程中常用的工具酶。2) 命名：属名 种名 株名Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株H i n d H

10、 i n d 同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶l H：细菌属名的头一个字母l in：细菌种名的头两个字母l Hin：表示了该菌的物种名称，用斜体l d：代表该菌菌株名称l III：表示该菌具有几个不同的限制与修饰体系，表示该酶是属于第三个限制修饰系统的酶3) II型限制性内切酶的基本特征：a.识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列b.大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧c.识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构d.切割DNA均产生含5磷酸和3羟基的末端e.错位切割产生粘端，沿对称轴切割产生平末端EcoR 的切割位点 EcoR的识别序列5 G C T GA A T T C G A

11、 G 33 C G A C T T A AG C T C 54) 回文结构：a.序列正读和反读是一样的，即有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方向读序列是完全一样的。b.在切割位点处，限制性核酸内切酶的作用下磷酸二酯键会发生水解效应，从而导致链的断裂。5) 限制性内切酶形成的末端结构：（具体粘性末端的写法在第二章ppt18页） 粘末端(sticky end)：两条链上的断裂位置是交错和对称围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘末端的DNA片段。包含5粘性末端和3粘性末端两种类型。 平末端(blant end)：两条链上的断裂位置是处在一个对称轴的中心，这样形式的断裂是形成具有平末端的D

12、NA片段。6) （位点偏爱（site preference）某些限制性内切酶对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率。（不同位点形成不同的二级结构，限制酶的活性。） 星号活性（star activity）又称星活性，一些限制性内切酶在某些反应条件变化时酶的专一性发生改变，如甘油浓度过高、反应液离子强度过低、pH改变、有机溶剂的影响等条件，酶切割位点专一性发生改变。7) 同裂酶有些来源不同的限制性核酸内切酶识别同样的核苷酸靶序列，切割位点可以相同，也可以不同。 图 同裂酶示例8) 同尾酶来源不同，识别的靶序列也各不相同，但都能产生相同的粘性末端，称为同尾酶。例如： BamH和Bgl是一组同

13、尾酶，它们切割DNA之后都形成由“-GATC-”4个核苷酸组成的粘性末端。9) 限制酶的识别序列与DNA的来源无关，不带有种的特征，对各种DNA都普遍适用。（因此，甲种生物的DNA与乙种生物的DNA用同一种限制酶作用后，所形成的限制片段带有同样的末端，能够通过碱基的互补配对而连接起来。这是重组DNA技术的重要基础之一。根据这一特性，可以将不同来源的DNA重组成一种新的重组体分子。）10) 因为识别序列中特定核苷酸的甲基化会强烈抑制限制酶的活性，所以在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌。11. DNA聚合酶（1）大肠杆菌DNA聚合酶I（DNA pol I）的用途：缺口平移 大肠杆菌DNA聚

14、合酶 I的基本性质53的DNA聚合酶活性；53的核酸外切酶活性；35的核酸外切酶活性 大肠杆菌DNA聚合酶 I 的基本用途a. 缺口平移（ Nick translation ）： 53的核酸外切酶和聚合酶活性协同作用，使缺口向前推进；b.制备32P标记的DNA探针图 DNA pol I 缺口平移（2）大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）的性质及用途：补平由核酸内切酶产生的5粘性末端 Klenow酶的来源：大肠杆菌DNA聚合酶经枯草杆菌蛋白酶处理，获得其N端三分之二的大肽段，即为Klenow酶。 Klenow酶的基本性质l 拥有53的DNA聚合酶活性l 拥有35的核酸外切酶活性l 丢失5

15、3的核酸外切酶活性 Klenow酶的基本用途 补平由核酸内切酶产生的5粘性末端 DNA片段的同位素末端标记 cDNA第二链的合成； 双脱氧末端终止法测定DNA序列（3）T4-DNA聚合酶：切平由核酸内切酶产生的3粘性末端 T4-DNA聚合酶的基本特性l 53的DNA聚合酶活性l 35的核酸外切酶活性l 不具有53核酸外切酶活性l 在无dNTP时，可以从任何3-OH端外切l 在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止l 在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位 T4-DNA聚合酶的基本用途I切平由核算内切酶产生的3粘性末端 T4-DNA聚合酶的基本用途IIDNA片段的同位素末端标记（4）

16、依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶） 反转录酶的基本特性I：以RNA为模板合成cDNA链反转录酶的基本特性II：双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链 反转录酶的基本用途l 将真核基因的mRNA转录成cDNA，构建cDNA文库l 对具有5突出端的DNA片段的3端进行补平和标记、制备探针l 代替Klenow片段，用于DNA序列测定12. DNA连接酶 能够催化2条DNA链间形成磷酸二酯键的酶。需要在一条DNA链的3末端具有一个游离的羟基(-OH)，另一条DNA链的5末端具有一个磷酸基团(-P)。只有在这种情况下，才能发挥其连接DNA分子的作用。（注意：DNA连接酶并不能连接两条单链DNA分子

17、或环化单链DNA分子，被连接的DNA链必须是双螺旋的一部分） 常用的两种DNA连接酶：大肠杆菌DNA连接酶、T4噬菌体T4 DNA连接酶 DNA连接酶的基本性质（1）修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键（2）修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键（3）连接平头双链DNA分子 粘性末端的连接l DNA连接酶最突出的特点是，它能够催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用，形成重组DNA分子。l 然而，利用DNA连接酶构建重组体DNA分子时，限制酶切割产生的具有粘性末端的载体DNA分子，在连接反应中会发生自我环化。l 为了克服这一缺点，现在的载体一般能提供多克隆位点，可采用双酶切以避免自我环

18、化。 平末端DNA片段的连接方法 直接用T4 DNA连接酶连接：T4 DNA连接酶能够封闭具有3-OH和5-P末端的双链DNA的单链缺口；在ATP和高浓度酶的条件下，它还能连接具有完全碱基配对的平末端DNA分子，但平末端连接效率不高，基因操作常不采用此法。 同聚物加尾连接平末端DNA片段：a.运用末端转移酶，能够将核苷酸加到DNA分子单链延伸末端的3-OH基团上，不需要模板链的存在，一个个加上核苷酸，构成由核苷酸组成的尾巴，长度可达100个核苷酸。b.连接分子的裂口可以通过大肠杆菌DNA聚合酶I来填补c.留下的单链缺口则可由DNA连接酶封闭。PS:上述这种连接DNA分子的方法叫作同聚物尾巴连接

19、法，简称同聚物加尾法。 用衔接物连接平末端DNA分子 a.所谓衔接物(linker)，是指用化学方法合成的一段由10-12个核苷酸组成的，具有一个或数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段。b.衔接物的5末端和待克隆的DNA片段5末端，用T4多核苷酸激酶处理使之磷酸化；然后再通过T4 DNA连接酶的作用使两者连接起来；接着用适当的限制酶消化具有衔接物的DNA分子和载体分子，使二者产生出彼此互补的粘性末端，以便后续的连接反应。图 应用互补的同聚物加尾法连接DNA片段图 用衔接物连接平末端DNA分子 DNA接头连接法 a.DNA adapter是一类人工合成的一头具有某种限制性内切酶粘末端，另一头为平末端

20、的特殊双链寡核苷酸片段。b.当DNA adapter的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，会使后者成为具粘末端的新DNA分子，从而易于连接重组。 13. 核酸酶（nuclease）1) 单链核酸内切酶S1核酸酶的的基本反应和用途 S1核酸酶的基本特性：来自米曲霉（Aspergillus oryzae） 降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍；Zn2+必需；最适pH范围：4.0-4.3；需要NaCl：10-300 mmol/L；降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍。 S1核酸酶的基本反应I：内切单链DNA或RNAS1核酸酶的基本反应II：内切带缺口或裂口的双链DNA或RNA

21、 S1核酸酶的重要用途a.去除DNA片段的单链突端，使之成为平端b.去除cDNA合成时形成的发夹结构c.通过S1核酸酶保护实验，分析转录产物d.成熟mRNA与基因组DNA杂交后，结合此酶水解，可定位内含子e.修整渐进性删除突变的末端2) 单链内切、双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶 Bal31核酸酶的基本特性：来自艾氏交替单胞菌（A. espejiana） 从双链DNA的两端（3和5）同时水解两条链；对两条链的水解速度不一定相等；结果是双链从两头缩短，彻底水解为5单核苷酸 Bal31核酸酶的基本用途：用于不同长度的删除突变克隆实验14. 核酸修饰酶（Nucleic Acid modificat

22、ion enzymes）1) 末端脱氧核苷酰转移酶（TdT） TdT的基本特性来自小牛胸腺，不需要模板的DNA聚合酶，在3端随机掺入dNTP。（一般在体系中只加一种dNTP，分别加互补的，将平末端变为粘性末端链接）2) T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP） 特性：催化ATP的-磷酸基团转移至DNA或 RNA的5-OH末端上 用途：用于探针的末端同位素标记3) 碱性磷酸单酯酶（CIP、BAP）：反应及目的 小牛胸腺碱性磷酸单酯酶（ CIP ）：68时失活大肠杆菌碱性磷酸单酯酶（ BAP）：68稳定，且耐酚抽提 反应：催化核酸分子脱掉5磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5-P末端转换成5-OH

23、末端，在分子克隆中的作用是防止粘性末端之间的自连。 使用碱性磷酸单酯酶可以达到的目的a.去除载体DNA5端磷酸，防止载体自身环化，提高重组率。b.去除DNA和RNA的5端磷酸基，然后在T4多聚核苷酸激酶作用下进行末端标记。15. 核酸凝胶电泳结果处理软件：quantity one（了解） 16. 基因克隆载体：1) 载体的概念、种类、功能及应具备的条件 载体的概念a.携带外源DNA进入宿主细胞的工具。b.能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞，具有自我复制能力，c.使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。c.实质：用来携带目的基因片段进入

24、受体细胞。 载体的种类质粒（plasmid）、噬菌体或病毒DNA、考斯质粒（cosmid）与噬菌粒、人造染色体载体 载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞；为外源基因提供复制能力或整合能力；为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 载体应具备的条件 可转移性：具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性。 具有与受体细胞相适应的复制位点（ori，origin of replication）或整合位点 。 具有较高的外源DNA的装载能力。 多克隆位点（multiple cloning site, MCS）：具有多种限制性内切酶的单一切点 。 具有合适的筛选标记（selection marker）。 安全，不含对

25、受体细胞有害的基因，不会任意转入受体细胞以外的其他生物细胞中。2) 质粒：天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA（定义：质粒是生物细胞内固有的、能独立于染色体而自主复制，并被稳定遗传的一类核酸分子。）3) 什么是质粒的不相容性及其机制？ 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成不相容性群。 质粒不相容的分子机制a.两种含有不同复制子结构的质粒，在复制时受各自的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。b.两种含有相似复制子结构的质粒，在

26、复制时受同一种拷贝数控制系统的控制而产生竞争，致使两种质粒的最终拷贝数不同。其中，拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势，并逐步将另一质粒“稀释”淘汰。4) 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型（严紧型复制控制的质粒：1 - 3 拷贝；松弛型复制控制的质粒：10 - 60 拷贝），其中氯霉素的作用是打破拷贝数规律：当细胞生长环境中存在蛋白质合成抑制剂（氯霉素、壮观霉素等）时，细胞的染色体DNA的复制受阻，而质粒仍可扩增，使其数量可达数千拷贝；根据是否可以在细胞间转移，质粒可以分为（接合型质粒、非接合型质粒）；5) 质粒的性质：自主复制性（质粒能利用寄主细胞的DN

27、A复制系统进行自主复制）；不相容性；可转移性；携带特殊的遗传标记。6) 一个合格质粒的组成要素 复制起始位点Ori：控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点；而真核生物DNA分子有多个复制起始位点 抗生素抗性基因：便于对目的基因的检测，如Ampr、Kanr 多克隆位点MCS：克隆携带外源基因的片段 P/E（Promoter/Enhancer）：启动子/增强子 T（Terminator）：终止信号 poly(A)加尾信号：稳定mRNA（质粒改造的策略：删除不必要的DNA区域，缩小分子量，提高外源DNA片段的装载量；灭活某些质粒的编码基因；加入易于识别的选择标记基因；选择标记基因

28、内引入内切酶的酶切位点序列-多克隆接头；加入特殊的基因表达调控元件）7) 如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。（1）Ampr水解内酰胺环，解除氨苄的毒性。（2）tetr可以阻止四环素进入细胞。（3）camr生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活（5）hygr使潮霉素失活。第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选

29、。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。第五步：是否含有表达系统元件，即启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用哪种载体，还是要以实验目的为准绳。启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号启动子促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。增强子

30、/沉默子为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子负增强子，负调控序列。核糖体结合位点/起始密码/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是AUG（起始密码）和SD序列。转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点downstream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。回答有人之前提出的一个问题：为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针，那其实是代表两

31、条DNA链，即质粒是环状双链DNA，它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上。8) 重要的大肠杆菌质粒载体：pBR322、pUC18/19 pBR322松弛型复制；氯霉素可扩增；拷贝数50-100/cell；用于基因克隆 pUC18/19拷贝数2000-3000/cell；多克隆位点（MCS）；正选择颜色标记lacZ：E.coli lacZ基因的5端序列，表达半乳糖苷酶的片段。LacZ的上游包括乳糖操纵子上的启动子Plac和操纵基因O；用于基因克隆和测序9) 蓝白斑筛选：互补效应（第二章ppt26页开始有图解）a. pUC18/19质粒上的LacZ基因包括一段-半乳糖苷酶的启动子

32、、编码肽链的区段、一个多克隆位点(MCS)。b. MCS位于编码肽链的区段中，是外源DNA的选择性插入位点，但其本身不影响载体编码肽链的功能活性。c. 当菌体中含有带lacz的质粒后，质粒lacz基因编码的肽链和菌株基因组表达的N端缺陷的-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整-半乳糖苷酶相同的作用，使X-gal生成蓝色物质，这种现象即-互补。d. 用这种质粒进行克隆时，如果外源基因破坏了LacZ的编码序列，所产生的蛋白产物就会丧失-互补能力，在含有X-gal和IPTG的平板下形成无色菌斑，可用于重组子的筛选。10) 碱裂解法制备质粒中溶液I、II、III的作用 溶液I：调节pH，悬浮菌体，抑制DN

33、ase的活性 溶液II：裂解细胞膜（主要是NaOH），临用前配制，SDS是为沉淀染色体DNA作准备 溶液III：中和NaOH，促进SDS沉淀蛋白质和基因组DNA17. （1）大肠杆菌的噬菌体DNA的两种状态溶原状态和溶菌状态a. 噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种状态称为溶原状态。b. 整合主要由-DNA上的cI和int两个基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶原状态，或处于溶菌状态。c. DNA重组技术一般需要噬菌体

34、进入溶菌状态。d. 噬菌体从溶原转为裂解是一种可诱导过程。 e. 诱导的因素可能很多，实验室常用的是热诱导: 某些噬菌体，在低温时（30）保持溶原状态，在高温（42）时进入溶菌状态。这些噬菌体的cl基因是温度敏感突变型的，称为c1st。 clts1857，可作为组件插入质粒DNA内。目的基因插在 clts1857下游，重组体的目的基因在30表达，42不表达。这种方法称为热诱导表达，使用的是温敏开关。（2）噬菌体DNA载体的主要类型（教材21页）（3）噬菌体装载容量：插入型载体、取代型载体 a.野生型-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb

35、时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。b.因此，构建-DNA载体时需要需要缩短野生型-DNA的长度，才能提高装载量。c.实际上，野生型-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解非必需的。在构建载体时，这些片段可以删除。d.根据切除的多少，可将-DNA分成两大类载体：插入型载体和取代型载体。 插入型载体通过特定的酶切位点允许外源 DNA 片段插入的载体称为插入型载体由于 噬菌体对所包装的 DNA 有大小的限制，因此一般插入型载体设计为可插入 6 kb 长的外源 DNA 片段，最大 14 kb 。 取代型载体18. 什么是考斯质粒（cosmid），其装载容量？ 考斯质粒是一类人工构建的含有-DN

36、Acos序列和质粒复制子的特殊类型的载体。 考斯质粒载体的特点能像-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞；能像质粒那样在受体细胞中自主复制；重组操作简便，筛选容易；装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围；不能体内包装，不裂解受体细胞。19. 噬菌粒（phagemid or phasmid）及其装载容量 噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体的包装序列、复制子以及质粒的复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。 噬菌粒载体的特点能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞；能像质粒那样在受体细胞中自主复制；装载量比常规的M13 mp系列载体要大很多（10 kb）；通过克隆

37、双链DNA能获得同等长度的单链DNA；重组操作简便，筛选容易20. 人造染色体载体主要包括哪两种？ 细菌人造染色体（BAC），装载量：50 kb - 300 kb；拷贝数：各种类型的BAC在大肠杆菌受体菌中只能维持单一拷贝 酵母人造染色体 (YAC)，装载量：350 kb-400 kb21. 基因克隆受体细胞应具备的条件及常用的基因克隆受体细胞 条件a.限制性缺陷型：外切酶和内切酶活性缺陷（hsdR-）b. 重组整合缺陷型：用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-， recB-，recC- ）c. 具有较高的转化效率（改变受体菌细胞壁的通透性及细胞膜的特异吸附性；或选择能够诱导形成感受态细

38、胞的菌株作为受体菌）d. 具有与载体选择标记互补的表型（例如，在大肠杆菌系统中，重组质粒载体上多含有氨苄青霉素抗性标记基因，则所选用的受体细胞应对这种抗生素敏感。）e. 感染寄生缺陷型：防止重组细菌扩散污染（生物武器除外）。22. 核酸序列分析：DNAMAN（了解）23. 目的基因的克隆方法 目的基因的克隆策略分为两大类l 一类是利用PCR扩增、化学合成等技术体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。l 另一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆。 鸟枪法构建基因组文库 cDNA法构建cDNA文库24.

39、什么是鸟枪法克隆目的基因？（鸟枪法用限制性内切酶将基因组DNA进行切割，得到很多在长度上与一般基因大小相当的DNA片段（1000 bp）；然后，将这些片段混合物随机地重组进适当的载体，转化后在受体菌（如：E. Coli）中进行扩增；再用适当的筛选方法筛选出目的基因）1) 鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离（不能除去真核生物基因中的内含子结构）。2) 鸟枪法克隆目的基因的基本步骤。a. 染色体DNA的切断b. 与载体连接 如果转化子采用核酸杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体。c. 转化受体细胞 如果转化子采用核酸杂交法或

40、限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞。d. 筛选含有目的基因的重组子 核酸杂交法、基因产物功能检测法等3) 鸟枪法克隆目的基因过程中染色体DNA切断的方法。 超声波处理：片段长度均一，平头末端。 全酶切：片段长度不均一，有可能使目的基因断开，粘性末端（便于连接） 部分酶切：片段长度可控，目的基因完整，粘性末端25. 什么是cDNA法克隆目的基因是以mRNA为模板，用反转录酶合成互补DNA（complementary DNA，cDNA）的方法。1) cDNA法克隆目的基因中cDNA第二链的合成方法有哪几种：自身引

41、导法、置换合成法、引导合成法（获得的双链cDNA 能保留完整的5端序列，其他两种方法均有缺失）。2) cDNA法克隆目的基因的局限性：并非所有的mRNA分子都具有polyA结构；细菌或原核生物的mRNA半衰期很短；mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难；仅限于克隆蛋白质编码基因。26. 基因库与基因文库1) 概念 基因库（gene pool）：特定生物体基因组上所有基因的集合（天然存在）。 基因文库（gene library or gene bank）：从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）。 根据构建方法的不同，基因文库分为： 基因组文库（含有全

42、部基因）； cDNA文库（含有全部编码蛋白质的结构基因）2) 基因文库构建的基本策略 基因组文库：鸟枪法构建，材料来自染色体DNA。（所产生的克隆群体代表了基因组DNA的所有序列） cDNA文库：cDNA法构建，材料来自mRNA。（在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA种类不同，因此同种生物体的cDNA文库有组织细胞的界定） 显然，cDNA文库的信息量远小于基因组文库。3) 基因文库的完备性指在构建的基因文库中任一基因存在的概率。它与基因文库所含最低克隆数N之间的关系可用下式表示：N = ln(1P)/ln(1f)其中： P = 任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率 f

43、 = 克隆片段的平均大小/生物基因组的大小4) cDNA文库组建步骤 基因组DNA的制备 随机酶切成较大的DNA片段（10-30 Kb，平均20 Kb)，并对这些片段进行分离 重组入适当载体（噬菌体） 转化宿主菌（E.coli)，扩增，获得基因组文库 后续：从基因组文库中筛选特定的重组子。5) 差别杂交法构建cDNA文库的原理（适用于分离经特殊处理而被诱导表达的cDNA克隆。） 技术原理：在一个细胞群体中目的基因正常表达，在另一个细胞群体中目的基因不表达。因此可通过以两种细胞总mRNA（cDNA拷贝）为探针的平行杂交，对特定细胞表达的cDNA文库进行筛选。27. 化学合成法克隆目的基因1) 化

44、学法全基因合成的策略：小片段粘接法、补丁延长法、大片段酶促法2) DNA化学合成的用途：合成天然基因；修饰改造基因；设计新型基因；制备探针、引物、接头等。28. 实验技术（了解）：Gateway技术（Invitrogen）、In-Fusion PCR技术（TaKaRa）、Bioedit软件29. PCR技术的原理a.在微量离心管中,加入适量的缓冲液、微量的模板DNA、四种脱氧核苷酸、耐热性DNA聚合酶、一对合成DNA的引物；b.通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段的循环合成DNA；c.每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍；d.一般样品经过30次循环,可使基因的拷贝数达到数百万。30.

45、PCR技术依据的生物学理论：碱基互补配对原理、半保留复制原理PCR技术依赖于DNA的变性和复性 DNA的变性：加热或强酸、碱性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA。 DNA的复性（退火）：解除变性的条件后, 变性的单链DNA可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复 。31. PCR反应体系的组分及反应程序（以下为PPT实例） 反应体系（总体积：50 mL） 反应程序32. PCR反应条件1) 引物设计（PCR引物设计primer premier），Tm值的计算方法； 引物 浓度：0.1-0.5mol/L，浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计可遵循下列原则： 长度：约16-30bp，太短影响引物与模板的配对； 四种碱基随机分布，在3端不存在连续3个G或C，这样易导致错误引发（false priming）； G+C含量：通常为40-60%，可按下式粗略估计引物的解链温度Tm4(G+C)+2(A+T)； 引物3端：关键碱基，必须与模板完全配对，最好对应密码子的第一或第二位核苷酸，以减少由于密