十字花科黑腐病菌中一个假定双组份系统的表达和磷酸传递研究.doc

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1、I 十字花科黑腐病菌中一个假定双组份系统的 表达与磷酸传递研究 摘 要 双组份系统是微生物重要的信号转导途径，在感知环境刺激后，通过 磷酸传递的方式将信号传递至胞内，从而产生应答调控功能；十字花科黑 腐病菌(Xanthomonas campestris pv. campestris，Xcc)8004，是研究微生物与 植物相互作用的重要模式菌，全基因组测序已经完成，其中注释为双组分 系统的基因有 106 个。XC3669，XC3670 分别注释为应答调节蛋白和组氨 酸激酶，是一个假定双组份系统。XC3670 位于 XC3669 下游，两个 ORF 间隔 4bp。同源性分析表明，XC3670-XC

2、3669 很保守，在许多已测序的微 生物基因组中都存在其同源基因对，DNA 序列分析表明原始 XC3670 的 G2 box 被一段插入序列所隔开，该插入序列编码两个 IS1404 转座酶，为 重叠基因。本实验中，分别构建了 XC3670/XC3670C、XC3669/XC3669N 和 HrpG 的 pET-30a(+)/ pQE-30 Xa 表达载体，在 E.coli BL21(DE3) /M15pREP4中表达，同时对 HrpG 的可溶性表达进行优化，通过调节诱 导温度、IPIG 浓度和诱导时间最终确定 HrpG 的最优表达条件为 20、 IPTG 浓度 0.8 mM、诱导时间 4 h，

3、此时 HrpG 在破胞上清液的可溶性表达 状况最好。纯化重组蛋白进行 in vitro 磷酸化实验，结果表明 XC3670 具有 自激酶活性，能够接受-32PATP 的磷酸基团，去除 HAMP 和 PAS 结构 域后(XC3670C)，对 XC3670 的活性不产生影响。分别检测了肉桂酸、FAD 及黑暗条件等对磷酸传递的影响，结果没有检测到磷酸基团从 XC3670/ XC3670C传递至 XC3669/ XC3669N；使用 cross-talk 方法验证 XC3670/ XC3670C和其他 12 个应答调节蛋白的磷酸传递，结果表明没有检测到磷 II 酸传递。分析可能是由于 XC3670 由

4、于在进化过程中的插入突变或其本身 的严谨性以及其他原因导致磷酸传递未发生。 关键词：关键词：十字花科黑腐病菌 双组份系统 插入序列 磷酸传递 III EXPRESSION AND PHOSPHOTRANSFER ANALYSIS OF A PUTATIVE TWO-COMPONENT SYSTEM IN XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV. CAMPESTRIS ABSTRACT Two-component system(TCS) plays important role in signal transduction pathways of microorganisms. Af

5、ter perceiving environment stimulus , signal is transducted to cytoplasm by phosphotransfer mechanism, resulting in response regulation accordingly. Xanthomonas campestris pv.campestris (Xcc) 8004 is one of the model bacteria in studying the interaction between microbes and plants, its genome has be

6、en sequenced, including 106 genes annotated two- component system proteins. XC3670-XC3669 which is annotated histidine kinase(HK) and response regulator(RR) respectively, is a putative two- component system. XC3670 is located downstream of XC3669, with only 4 nucleotides between them. Homology analy

7、sis shows that XC3670-XC3669 unit is conserved, and their homologies are found in many sequenced genomes. DNA sequence analysis showed that the G2 box was isolated from kinase core of ancestor XC3670 by a insertion sequence which encodes two IS1404 transferases which are over-lapped genes. In this e

8、xperiment, XC3670/XC3670C, XC3669/XC3669N andhrpG are constructed pET-30a(+)/pQE-30 Xa expression vector respectively, and are expressed in E. coli BL21(DE3)/ M15pREP4. In order to optimize the expression ofhrpG, tempreture, IPTG concentration and time for induction is optimized, respectively. Expre

9、ssion of solublehrpG in supernatant of cell disrution is best while combination E.coli M15pREP4 is induced at 20 for 4 h with IPTG concentration 0.8 mM. Constructed proteins are purified for in vitro phosphorylation. Result shows XC3670/XC3670C is IV autokinase that can be phosphorylated by receving

10、 phosphoryl group from - 32P, and lack of HAMP and PAS domains(XC3670C) does not affect XC3670 activity. Subsequently analysis shows that, no phosphotransfer is detected from XC3670/XC3670C to XC3669/XC3669N, while chromophore, FAD and dark conditions is carried out respectively. Cross-talk analysis

11、 shows that no phosphoryl-transfer activity is detected of XC3670/XC3670C. This result demonstrates that maybe the insert-mutation of ancestor XC3670 and other reasons leading to the failure of phosphotransfer of XC3670. KEY WORDS: Xanthomonas campestris pv. campestris; two-component system; inserti

12、on sequence; phosphotransfer V 目 录 第一章 前 言 .1 1.1 双组份系统 1 1.1.1 概述.1 1.1.2 TCS 磷酸传递方式.2 1.2 组氨酸激酶 6 1.2.1 结构域.6 1.2.2 HK 的活性.6 1.2.3 激酶核心的结构与功能.8 1.2.4 结构域特征和 HK 分类.9 1.2.5 信号转导的机制.10 1.3 应答调控蛋白 10 1.3.1 结构域组合.10 1.3.2 REC 结构域活性.11 1.3.3 REC 的结构和功能.11 1.3.4 REC 分类.12 1.3.5 RR 调控机制.13 1.4 十字花科黑腐病菌 80

13、04 中的 TCS13 1.4.1 Xcc 8004 TCS 概况.13 1.4.2 Xanthomonas 中已研究的 TCS.15 1.4.3 hrp 基因簇研究进展.15 1.5 本研究的目的、内容和意义16 1.5.1 本研究的主要目的.16 1.5.2 本研究的主要内容.16 1.5.3 本研究的主要意义.16 第二章 材料与方法.18 2.1 材料 18 2.1.1 菌株与质粒.18 2.1.2 试剂和制剂18 VI 2.1.3 培养基.20 2.2 方法 21 2.2.1 微生物操作.21 2.2.2 DNA 分子操作22 2.2.3 蛋白质分子操作.24 2.2.4 生物信息学

14、方法.26 第三章 结果与分析.27 3.1 生物信息学分析.27 3.1.1 结构域简述27 3.1.2 DNA 序列分析27 3.1.3 hrpG 基因组定位28 3.1.4 HrpG 理化性质及结构域分析 .28 3.1.5 HrpG 同源性分析 .30 3.2 重组蛋白表达及纯化.31 3.2.1 重组蛋白的表达31 3.2.2 12 个 RR 重组蛋白的表达.32 3.2.3 HrpG 重组蛋白的表达与优化 .32 3.3 in vitro 磷酸化传递实验 35 3.3.1 XC3670 自磷酸化和磷酸传递.35 3.3.2 cross-talk 验证磷酸传递.36 第四章 结论与讨

15、论.38 4.1 假定 TCS.38 4.2 激酶缺失 G2 box38 4.3 HAMP/PAS 结构39 4.4 应答调节蛋白.39 4.5 HrpG 的表达.40 4.6 磷酸传递.41 参考文献.44 致 谢.57 十字花科黑腐病菌一个假定双组份系统的表达和磷酸传递 1 第一章前 言 1.1 双组份系统 1.1.1 概述 面对环境中各种因素的影响，细菌在生存过程中需要及时作出相应调整，这对于 维持其正常生长和繁殖是非常重要的。由于自身复杂程度和生存环境的差异，不同微 生物响应环境变化的途径和和方式各有不同，概括起来主要有以下几种：趋化性受体 系统1 (chemotaxis recept

16、or)、抗-因子系统2(anti- factor pair)、Ser/Thr/Tyr蛋白激酶 系统3 (Ser/Thr/Tyr protein kinase，SKS)和双组份系统4(Two-component system，TCS)。 同种微生物中可能同时存在上述几种信号系统，这与其生存能力相对应。总的来看， 在微生物特别是原核生物中，TCS在这几种信号体系中占主导地位。 顾名思义，TCS 由两部分构成，一个是组氨酸激酶(histidine kinase，HK)，通过感 应结构域来感知环境信号，并将信号向胞内传递；另一个是同源的应答调节蛋白 (responsse regulator，RR)，用

17、于接收来自 HK 的信号并启动调节功能5。TCS 信号的转 化是以磷酸传递的方式进行的，HK 催化 ATP 的磷酸基团转移，发生自磷酸化反应， 并将磷酸基团传递至同源 RR 的上，经磷酸化后，RR 发生构象转变为激活状态，启动 相关的调控机制。事实上，TCS 的结构存在多样性，在复杂的 TCS 中，磷酸传递呈现 多级(磷酸接力)甚至是分支交叉形式(cross-talk)而不仅是两个组分之间的信号转导。这 一方面反应了微生物中信号调控的多样性和复杂性，另一方面也显示了微生物适应环 境、应对环境改变的能力。 由于微生物自身和栖息环境等原因，不同细菌之间的TCS数目和结构复杂程度差 别很大，且呈不均

18、匀分布，但基本上与基因组大小呈正比6。一般而言，自养微生物的 TCS数量要比寄生型多，高等微生物的TCS比低等的复杂7。前者是因为营寄生生活的 微生物生存环境稳定，不需要应对过多的变化刺激，所以信号系统比较少；而自养型 微生物生存环境复杂多变，其信号传导和调节机制比较完善。TCS的数量和复杂程度 反映了细菌适应环境的能力和信息调节的严谨完善程度8。 十字花科黑腐病菌一个假定双组份系统的表达和磷酸传递 2 TCS 最早在 E. coli 中得以阐述，随着研究的深入，逐渐发现 TCS 参与调节各种 不同的信号应答，包括环境温度、pH、渗透压，细菌的趋化性、感光性和致病性、孢 子形成等生理生化过程。

19、进一步研究表明，在细菌的营养(C、N、P)吸收与代谢、离子 应答(如 Mg2+、Cu2+、Ni2+、NO2-、NO3-)、小分子吸收与代谢(O2、苹果酸、延胡索酸、 草酰乙酸、柠檬酸、四硫磺酸、葡萄糖、6-磷酸葡萄糖、谷氨酰胺、N-氧化三甲胺)、 蛋白折叠纠错、胞内电势与还原态、物质分泌和细胞分化、细胞密度、细胞抗性(阳离 子抗微生物肽、细胞壁活性抗微生物肽、杆菌肽)、聚膜形成、节律周期、全局感应(自 诱导肽、感应态刺激肽、融合信号因子、壁压刺激因子)及胞间交流等方面发挥了重要 作用9-17。 TCS不仅在原核生物中广泛存在，在低等真核微生物和植物中都有发现18。与原 核生物中的TCS相比，真

20、核中的TCS更加复杂，表现在HK序列的多结构域，信号传递 的多步骤和信号途径的多交叉与整合上，这和真核生物自身结构和信号途径的复杂多 样性相关。这种差异可以通过SKS与TCS的对比进行阐述，与TCS相似，SKS在原核和 真核生物中也均存在，但原核生物中的SKS结构简单，数量较少；而真核生物中，SKS 占主导地位，且结构功能复杂。在高等脊椎动物中TCS完全不存在，而SKS成为一种重 要的信号传导机制19。有趣的是在一些低等真核生物如酵母中，信号经TCS传递之后 并不直接行使调控功能，而是继续传递给SKS，最终完成信号应答20。这种TCS-SKS 之间信号传递的延续与整合体现了生物信号系统的进化趋

21、势及自身对环境的适应的能 力。 随着新型测序方法的推出和大规模测序的不断进行，越来越多的基因组序列得以 揭示，到目前为止，通过生物信息学及实验研究发现的TCS基因已达81988个21，这个 数目还在不断增加。这一方面为进行TCS相关研究提供了大量材料，另一方面也向TCS 的研究方法和理论提出新的要求，随着研究的不断深入，生物和环境之间的相互作用 机制将进一步得以明确。 1.1.2 TCS 磷酸传递方式 TCS 中信号的转导是以磷酸基团传递的方式进行，由于生物系统的多样性，磷酸 传递也以多种方式进行，主要包括 His-Asp、His-Asp-His-Asp 和 cross-talk 三种方式22

22、- 23。 十字花科黑腐病菌一个假定双组份系统的表达和磷酸传递 3 1.1.2.1 His-Asp 途径 来自于ATP的-磷酸基团经HK的His残基直接传递至RR的Asp残基，即His-Asp传递 是TCS最简单的转导方式，见图1-1(a)。 (a)(b) 图1-1 TCS信号传递模式图23 注：(a)典型的TCS，其胞外感应器接受信号后，经跨膜结构(TMI, TM2), 传递至胞内，经CA域催化 结合的ATP，将磷酸基团转移至DHp域的His(H)残基上，发生自磷酸化，然后磷酸基团传递至RR的 REC的保守Asp(D)残基上，通过自身构象改变导致效应域(Effector)激活，引起下游应答。

23、(b)复合型 TCS的信号传递是以磷酸接力(His-Asp-His-Asp)的方式进行的，HisKA域的His残基发生磷酸后磷酸 基团依次转移至中间REC和磷酸转移酶结构域(HPt)上， 最后传递至RR的REC上。此外，其胞内 TM区域的C 端常连接有附加结构域，如PAS、HAMP及GAF等，效应结构域的功能 包括结合DNA/RNA 、酶催化、结合蛋白等，某些情况下可能不存在效应结构域 Figure1-1 Ideograph of TCS signal transduction Note: (a)classical TCS, after periplasimic sensor domain d

24、etects the signal, signal transmitted to cytoplasm through transmenbrans structure.CA domain catalyze the binding ATP, leading to the autophosphorylation of HK. Then ,phosphoryl group is transferred to Asp residule of REC domain in RR, which will resulting in the conformation change of effector doma

25、in, facilitating the laters regulation function; (b)A His-Asp-His-Asp phosphorelay TCS. After sensing stimuliti, the signal would be transferred from DHp to a intermediate REC, then a HPt domain, and at last the REC domain from response regulator. HK的信号感应结构域在感知环境刺激后，通过结合并催化ATP的水解，导致自身 十字花科黑腐病菌一个假定双组

26、份系统的表达和磷酸传递 4 的特定His残基发生磷酸化，随后磷酸基团传递至RR接受结构域的保守Asp残基上，导 致RR构象改变，进而激活调控功能。His-Asp途径是原核生物TCS主要的转导方式，如 E. coli中诱导atoDAEB 操纵子表达，调节多聚烷基3-羟基丁酸poly-(R)-3-hydroxy butyrate合成的AtoS- AtoC 系统24以及Amycolatopsis mediterranei U32中参与rifamycin SV合成的AmrA-AmkA系统25均为His-Asp途径转导方式。 1.1.2.2 His-Asp-His-Asp 途径 在一些TCS中，HK感应

27、信号后将磷酸基团传递至与自身相连或者单独的中继接收 域(intermediate receiver domain，iREC)，然后经组氨酸磷酸转移酶(histidine phospho- transferase，HPt)传递至RR，启动调节功能，见图1-1(b)。与His-Asp途径相比，His- Asp-His-Asp更像是一种“磷酸接力”，并存在多个磷酸中继蛋白26。这一方面通过多 步接力将微小差异信号放大；另一方面多组分形式也提供更多的调控结合位点，使得 信号调节更加准确精细。以B. subtilis 中调控孢子形成的信号系统27为例，在感受信号 刺激后，HinA/B/C/D/E中任何一

28、个HK磷酸化，将磷酸基团传递至iREC Spo0F，经HPt Spo0B，最后至RR Spo0A，进而启动孢子形成的相关基因表达。 存在于Saccharomyces cerevisiae的Sln1-Ypd1-Ssk1系统28也是该种转导途径。该系 统通过在胞内积累甘油来维持正常细胞渗透压。低渗条件下，Sln1自磷酸化，磷酸基 团经自身iREC 转移至HPt Ypd1，后传递至RR Ssk1，Ssk1 的保守Asp残基被磷酸化， 导致自身活性抑制；环境渗透压升高时，Sln1激酶活性被抑制，最终导致导致Ssk1去磷 酸化而被激活。与B. subtilis 中HinA/B/C/D/E-Spo0F-S

29、po0B- Spo0A系统不同的是， Ssk1不是作为转录因子调控基因表达，而是进一步激活活化促细胞分裂(mitogen- activated protein kinase，MAPK)激酶级联反应。去磷酸化后的Ssk1 激活两个 MAP2KKK(Ssk2和Ssk22)，MAP2KKK激活两个MAPKK(bs2和Pbs2)，后者再激活一个 MAPK(Hog1)，最终导致甘油磷酸脱氢酶的表达，启动甘油合成提高胞内渗透压。 1.1.2.3 cross-talk 途径 除上述两类信号传递途径外，TCS 中还存在一种称为 cross-talk 的信号转导模式29。 cross-talk 是指 TCS 在

30、传递过程中出现分支或非同源性传递的方式，概括起来分三种情 况：HK1/HK2-RR 模式：两个或多个 HK 在感应信号时，将磷酸基团传递至同一个 RR 上；HK-RR1/RR2模式：HK 在感应信号时，将磷酸基团传递至不同的 十字花科黑腐病菌一个假定双组份系统的表达和磷酸传递 5 RR；HK1- RR2/HK2-RR1模式：一个 TCS 的 HK 感应信号刺激后，将磷酸基团传递 给另一个 TCS 的 RR，后者 TCS 的 HK 可能同样可以磷酸化前一个 RR。可以看出 cross-talk 涉及多个 HK 或/和 RR 之间的磷酸传递，使得调控机制更加复杂。正是由于 这种信号传导的复杂性，所

31、以只有在特定的环境下 cross-talk 才可能发生，否则将会导 致信号转导发生紊乱，影响两个不同的功能途径。正常情况下，不同途径之间的 cross- talk 趋向于最小，否则将无法对专一性信号刺激引发足够的应答；但在某些特殊情况下， cross-talk 作为整合不同信号或将分化单一信号的途径对于微生物而言很有利30。 (a)(b)(c) 图1-2 TCS中不同的cross-talk形式35 注：(a)HK1将磷酸基团传给同一TCS的RR1和另一个TCS的RR2；(b)HK1将磷酸基团传递至同一个 TCS的RR1和RR2；(c)HK1和HK2将磷酸基团传递至同一TCS的RR1 Figur

32、e 1-2 Different cross-talk schemes of TCS Note: (a) Phosphoryl group can be transferred fromHK1to RR1which belongs to the same TCS and a second RR2 which belongs to another TCS; (b)Phosphoryl group can be transferred fromHK1to both RR1 and RR2 which belong to the same TCS; (c) Phosphoryl group can b

33、e transferred from both HK1 andHK2 to both RR1 which belong to the same TCS 第一种类型的例子 E. coli 中的 CheA-CheY/CheB 系统31，见图 1-2(b)。该系统为 细菌趋化性系统，CheA 接收信号发生自磷酸化后，磷酸基团同时传递给 CheY 和 CheB；第二种类型是 Vibrio harveyi 中的群感效应系统(quorum sensing)，即 LuxN/LuxQ/ CqsS-LuxU 系统32，见图 1-2(c)。LuxN、LuxQ 和 CqsS 在分别感应 AI- 1、AI-2 和 C

34、AI-1 信号时，均将磷酸基团传递至 HPt LuxU；第三种类型中，可以以 E. coli 中的 NarQ-NarP 和 NarX-NarL 系统为例33，见图 1-2(a)。NarX 和 NarQ 都应答硝 酸盐和亚硝酸盐，并且都可以磷酸化 NarP 和 NarL。在低浓度下硝酸盐比亚硝酸盐更 易于被 NarX 感知，并且在亚硝酸盐作为信号的情况下，NarX 催化 NarL 的去磷酸化。 十字花科黑腐病菌一个假定双组份系统的表达和磷酸传递 6 磷酸化的 NarL 和 NarP 的调控功能是非等价的，它们分别识别的靶向序列存在细微差 异。 NarX 和 NarQ 识别信号上的细微差异，最终导

35、致了 NarL 和 NarP 识别明显不同 的启动子，实现了一系列信号的整合(硝酸盐和亚硝酸盐的浓度)和区别应答。Cross-talk 可能在一些微生物中比较常见。Yamamoto 等分析了 E. coli 中 25 个 HK 和 34 个 RR 之 间的 in vitro 磷酸传递关系，经 30s 温育后，有 11 个 RR 能够被超过一个 HK 磷酸化34。 1.2 组氨酸激酶 1.2.1 结构域 由于生存环境和细菌本身的差异，HK的种类很多，典型的HK存在跨膜结构，常 包括胞外和胞内两部分。胞外部分负责感应和输入信号，胞内部分转化和输出信号。 由于环境信号的多样性，HK中的感应域(sen

36、sor domain)最具差异性。实际上，除胞外 域形式外，感应域既有跨膜形式，又有胞内形式存在36。HK的胞内部分有两个明显的 结构域，一个是高度保守的C端催化-ATP结合结构域(C-terminal catalytic and ATP binding domain，CA)也称之为HATPase_c (Histidine associated ATPase C terminal)结构域； HATPase_ c形式催化活性将磷酸基团有ATP传递至His残基。另一个是相对保守性较低 的二聚化-组氨酸磷酸传递结构域(dimerization and histidine phosphotransfe

37、r domain，DHp)，也称之为HisKA (Histidine Kinase Acceptor)结构域。HisKA含有一个用 于磷酸化的保守His残基。HK胞内部分的复杂性主要体现在不同结构域的组合上，除 了必需的HisKA和HATPase_c结构域之外，一些组氨酸激酶还附加了 HAMP、PAS、PAC、GAF、iREC、HPt 或GGDEF等结构域37(见表1-1)中的一个或几 个，这些结构域既可能作为某些调控因子的结合位点亦可能是信号中继域，或者行使 相应的催化功能，使得组氨酸激酶的呈现形式复杂多样，导致其信号传递更加复杂， 调控更加灵活。就TCS而言，生命过程的复杂不仅反映现在TC

38、S的数量上，还反映在组 氨酸激酶的复杂程度上。 1.2.2 HK 的酶活性 HK磷酸化形成氨基磷酸酯而不是SKS中的磷酸酯47。磷酸基团和His残基咪唑环形 成高能的N-P键，因而相对不稳定，使得磷酸化的His残基更适合作为磷酸传递的中介， 而不是作为蛋白质识别的磷酸化位点48。除HK外，磷酸化His残基在中介性的酶，如 十字花科黑腐病菌一个假定双组份系统的表达和磷酸传递 7 琥珀酰CoA合成酶49(succinyl-CoA-synthetase)和二磷酸核糖激酶50(nucleoside diphosphate kinase)中同样也有发现。 目前尚未在脊椎动物中发现HK，但是含有磷酸化的H

39、is激酶却有发现，其功能在 进一步研究过程中51。HK的激酶活性通常是通过纯化相关蛋白或结构域，in vitro与- 32PATP温育，HK自磷酸化的同时将磷酸基团传递至同源RR上52。此外有in vivo的32P 培养或专一性的磷酸结合标签也可以直接用来检测细胞破碎液中是否存在磷酸化的His 和Asp等方法53,54，这对揭示in vivoHK的调控机制很有帮助。 表1-1HK/RR中部分常见结构域 Table 1-1 Parts of common domains fromHK/RR 结构域模型三级结构注释来源 HAMP 形成螺旋束，可能通过 旋转传递信号 37 PAS 有胞外胞内两种，可

40、能是 结合配基和感应信号 38 HisKA 形成二聚体， 含 His 保守残基 39 HATPase_c 结合 ATP 和 Mg2+，催化 ATP 释放磷酸基团 40 HPt 一般为多级磷酸传递的中 继域，与 HisKA 类似 41 REC 含有保守 Asp 位点，接收 同源 HK 磷酸基团 42 AAA ATPase 酶类，结合/水解 ATP，形成多聚体，结合 启动子和 54因子 43 HTH 常与 AAA 共同形式作用， 结合域 DNA 沟中 44 十字花科黑腐病菌一个假定双组份系统的表达和磷酸传递 8 GGDEF催化 c-di-GMP 的形成45 Trans_reg_C 结合于 DNA

41、特定区域，促 进转录激活 46 注：模型图来自SMART，三级结构来自PDB Note: module from SMART, tertiary structure from PDB 除激酶活性外，许多HK相对与磷酸化的RR而言还具有磷酸酶(phosphatase)活性55， 当然这种双功能(bifunctional)酶活性并不是普遍存在，如趋化性HK CheA，仅存在单一 激酶功能活性56。而CheZ 相对于其RR而言具有磷酸酶活性57。迅速去磷酸化来降低 RR的磷酸化程度是一种快速关闭信号途径的机制，并且能抑制非专一性的cross-talk58。 磷酸酶活性区域可能位于HisKA结构域，并

42、且介导在HisKA和HATPase_c之间的相互作 用。例如E. coli HK EnvZ中保守His残基在磷酸酶活性中发挥重要作用59。由于RR的磷 酸化水平最终决定了TCS 输出的应答反应，而RR磷酸化的调整取决于HK激酶和磷酸 酶活性的平衡。信号应答主要取决于激酶(如CpxA和LuxN)60,61还是磷酸酶(如KdpD)62， 或是两者均有(如NtrB和PhoQ)63,64的情况皆存在，这反映了HK信号转导机制的多样性。 1.2.3 激酶核心的结构与功能 HK激酶核心存在几个保守性的特征基序，分别称之为H、N、G1、F、和 G2 box36；H box含有磷酸化位点，位于HisKA结构域

43、；而N、G1、F和G2 box位于 HATPase_c结构域。这些保守性基序对于HK的自磷酸化和磷酸传递功能非常重要。 HATPase_c在溶液中以单体存在，结构保守常为/夹层折叠形式(表1-1)，这种结 构特点区别于任何已知的SKS的结构，却和GHL ATPase超家族的ATPase的结构域相似 65，GHL ATPase超家族包括GyrB、Hsp90和MutL等家族66。ATP结合腔由高度保守的 N、G1、F和 G2 box的保守性残基67构成。在F和G2 box之间，有一个柔性的区域称之 为ATP盖(ATP-lid)，结合了ATP类似物-ADPNP-的CheA的晶体结构显示，ATP盖变得

44、 相对有序，且盖在ATP类似物上；而在没有结合ATP类似物时，CheA的ATP盖变得很 灵活68。ATP盖构象的改变是为了偶联ATP结合和结构域构象调整以及蛋白质之间相 互作用的协同调整，这种方式在GHL ATPase超家族的其它类型中同样存在66。 十字花科黑腐病菌一个假定双组份系统的表达和磷酸传递 9 Radicicol，一种Hsp90的抑制剂，与PhoQ的HATPase_c可以较低亲和力结合，从而抑制 激酶活性，这种作用使得Radicicol可以作为HK抑制剂的潜在药物69。 HK作为二聚体行使功能，并且采用反式磷酸化(trans-phosphorylation)机制来实现自 磷酸化70

45、，也就是二聚体中一个HK的HATPase_c催化另一个HK单体的HisKA上的His 残基磷酸化。HisKA介导激酶核心的二聚体化，EnvZ、HK853和KinB的HisKA结构存 在四螺旋束的形式(表1-1)，H box的His残基位于表面螺旋的中间位置。在HK853结构 中，反向平行螺旋在束中交叉，使得一个亚基的HATPase_c与另一个亚基的HisKA相互 接触，促使了顺式磷酸化的发生71。 HK具有多种酶活性，包括激酶、磷酸酶和磷酸转移酶活性72，这几种酶活性的平 衡和改变需要HATPase_c和HisKA不同的构象态之间的相互转变。HK853的胞内结构域 的结构形式提供了激酶核心结构

46、域之间相互作用的一个模型73。HATPase_c 和 HisKA 之间的存在相互作用界面，这种相互作用使得HK处于磷酸酶和磷酸转移酶活性占突出 优势的状态，当外界信号刺激被感知后，界面平衡被打破，导致HK自磷酸化。实验表 明，导致界面稳定或不稳定的突变，会分别减弱或增强HK的激酶活性。位于HisKA helix I 之前的一段螺旋卷曲区域被认为是促使信号由跨膜区域向激酶核心区域的转导， 通过影响结构域之间的相互作用或His残基的空间定位来调整HK的酶活性。胞质HK NtrB不存在跨膜结构域，在HATPase_c结构域有一个独特的发夹结构，被认为可能是 结合到胞内信号转导PII蛋白上，来调控HK

47、的酶活74,75。 1.2.4 结构域特征和 HK 分类 尽管激酶的催化核心很保守，但是感应结构域呈现多样性，这种结构组合使得HK 能够感应大量的不同种类的信号刺激，同时又采用比较模式化的方式进行信号的传递 和转导。近年来在HK信号感知机制和结构方面有所发现，但大多数HK感应结构域的 结构和所识别的胞外信号依旧未知76。 根据已经研究的感应结构域的的拓扑结构，HK可分成三类77，最大的一类是最典 型的HK，存在一个胞外结构域位于两个TM之间，胞外结构域包括不同的结构域家族， 胞外信号的感知通过跨膜传导来调控激酶/磷酸酶活性。第二类含有多个跨膜螺旋，但 没有明显的胞外结构域。这类HK感应的信号被

48、认为是与膜相关的的刺激，由膜整合组 分和离子浓度形成刺激信号等。第三类是存在胞内结构域，应答内部或扩散的信号。 有些HK同时具有这几种特征，以整合来自不同的输入结构域的信号。 十字花科黑腐病菌一个假定双组份系统的表达和磷酸传递 10 由于胞外感应结构域的多样性，仅有有限的HK的胞外结构域得以识别，如周质空 间的可溶性结合PBPb 结构域、HATPase_c 的CHE和一系列的CHASE 结构域78-80。 与之相反，大多数HK的胞内感应和信号结构域存在少许结构上的相同性。大约有33% 的HK含有至少一个PAS结构域，可以结合小的配体或感应光、氧、还原电势和细胞能 量水平的变化81；另一个小分子

49、结合结构域GAF在约9%的HK中存在82。PAS和GAF 均存在序列上的多样性和结构上的可塑性，使得它们成为通用的信号结构域，不但能 识别而且可以转导信号，这主要依赖于它们蛋白质-蛋白质之间相互作用的倾向性。 HAMP结构域，在大约31%的HK中存在，通常紧随TM区域是信号转导的核心区域83。 目前又发现了一种通用的功能基序-信号螺旋(signal helix)，连接感应和激酶结构域，可 能在信号转导过程中发挥重要作用84。 1.2.5 信号转导的机制 二聚体似乎是HK行使功能的前提条件，但是与许多真核受体家族调节机制不同的 是，HK信号转导并不是通过信号介导的激酶结构域二聚体化，而是感应信号导致了 HK 二聚体界面蛋白质相互作用发生改变，这种变换传递至激酶核心85。随着一系列 HK和已知配基结合的的结构得以阐明，不同配基结合模式和胞外/胞内感应结构域的折 叠方式逐渐清晰。尽管序列同源性很低，一些小的相似的折叠基序和TM信号传导