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1、题名：细胞因子诱导破骨细胞分化的两种实验模型的建立姓名：蒋东芳工作单位：北京人民医院关节病诊疗中心通讯作者：蒋东芳通讯地址：100044 北京西直门南大街11号 人民医院骨关节实验室电话：68792768 13521019831传真号：68792767Email：细胞因子诱导破骨细胞分化的两种实验模型的建立蒋东芳, 吕厚山, 林剑浩, 姜军, 陈占昆（北京大学 人民医院 关节病诊疗中心， 北京 100044）摘要： 目的 探讨体外从单核细胞诱导分化形成破骨细胞的两种不同方法，建立研究细胞因子对破骨细胞分化作用的两种不同实验模型。方法 外周血单核细胞在10-8mol/l LTB4和25g/L M
2、-CSF刺激下，经过2周的直接诱导分化；外周血单核细胞与RAFLs共培养，加入10-8 mol/l LTB4和25g/L M-CSF，经过3周的间接诱导分化，用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色鉴定破骨细胞样细胞(OCL)。结果 通过直接分化和间接分化均可形成破骨细胞样细胞(OCL)。结论 两种不同实验模型能分别用于研究细胞因子对破骨细胞的直接和间接分化作用。关键词： 单核细胞；破骨细胞；细胞因子；实验模型中号:图分类号：Q2文献标识码：AEstablishment of two experimental models for studying theosteoclast differenti
3、ation induced by CytokinesJIANG Dong-fang, LU Hou-shan, LIN Jian-hao, JIANG Jun, CHEN Zhan-kun (Arthritis Clinic&Research Center, Peking University People Hospital, Beijing 100044, China )Abstract: Objective Establishment of two experimental models for osteoclast differentiation of monocyte from inv
4、itro, and study the potential of osteoclast differentiation induced by cytokines. Method CD14+ monocyte fraction of peripheral blood mononuclear cell (PBMC) stimulated by 25ng/ml M-CSF+10-8M LTB4 for twoweeks. Indirectlystimulated by 25g/L M-CSF+10-8mol/L LTB4 for two weeks. Indirectly model of oste
5、oclast differentiation: Utilize the coculture model of RAFLs and monocyte that were stimulated in the presence of 25g/L M-CSF+10-8mol/L LTB4 for three weeks. Through TRAP staining we observed result of multinucleated TRAP staining positive osteoclast-like cells as differentiation effect of each grou
6、p. Results Osteoclast-like cells can be induced by both direct and indirect models. Discuss Two experimental models for osteoclast differentiation can be used to study effect of various cytokines on directly and indirectly OC differentiation.Key word：Monocyte；Osteoclast；Cytokine；experimental model 破
7、骨细胞（Osteoclasts/OC）是人体生理性骨重建和病理性骨破坏（如RA、牙周疾病、骨转移癌）过程中高度特异性的唯一具有骨质吸收功能的多核性细胞，来源于造血前体细胞 。RANKL和M-CSF是破骨细胞形成过程中两个必需的因子1，M-CSF具有促进单核性破骨细胞前体细胞存活和增殖的作用，RANKL具有促进破骨细胞分化和功能激活的作用。具有促骨吸收作用(osteotropic)的细胞因子对破骨细胞分化作用包括两种途径：（1）独立于RANKL的直接分化作用，如TNF-；（2）依赖于RANKL的间接分化作用，如IL-1、IL-6、IL-11。白三烯B4（LTB4）是花生四烯酸的5脂氧化酶代谢产物
8、，已经证明，不论体外还是体内实验，LTB4均能促进骨质吸收2。本文用LTB4作为实验研究的细胞因子。我们设计两种不同实验模型，用以研究细胞因子对破骨细胞的两种不同分化作用。1 材料和方法1.1材料：Ficoll-paque plus淋巴细胞高效分离液（Pharmacia公司，Sweden）；DMEM培养液（GIBCO公司，USA）；标准胎牛血清（Hyclone公司，USA）；重组人M-CSF、人RANKL(Cytolab/Peprotech公司，Rehovot，Israel)；LTB4（Cayman Chemical公司，Michigan，USA）；多聚赖氨酸（中山组化公司，中国）；TRAP酶
9、染色试剂盒（Sigma Diagnostic公司，USA）；甲苯胺蓝（Fluka公司，Buchs，Switzerland）1. 2 方法1.2.1 外周血单核细胞的制备：从正常成年人的外周血加等量的PBS稀释，轻轻置于淋巴细 胞分离液（Ficoll-paque plus）上，(体积比为43)，2200r/min离心30min；收集血浆与Ficoll-paque plus中间的外周血单个核细胞（PBMC）层；用PBS洗，1000r/min离心10min2次，以去除血小板；清洗后的细胞用完全DMEM（含100U/ml青霉素、100mg/L链霉素和10胎牛血清）配制成细胞悬液，通过血细胞计数板进行计
10、数并调节细胞浓度。然后将PBMC细胞悬液加到事先预置了10mm10mm正方形玻璃盖片（已包被了多聚赖氨酸）的24孔细胞培养板孔（直径16mm）中，在37 5的CO2细胞培养箱中孵育2h后，将玻璃盖片取出，在PBS液中剧烈漂洗以去除不粘附的淋巴细胞，剩下粘附于包被了多聚赖氨酸玻片的单核细胞；小心保持玻片正面朝上，重新回置于24孔细胞培养板的孔内，作为以下实验中诱导形成破骨细胞的前体细胞。1.2.2 RAFLs的制备：将行TKR手术时获取的新鲜滑膜在PBS中漂洗，以去除脂肪和血液；用眼科剪成糊状，越细越好；加34倍0.25%胰蛋白酶，在37 5的CO2细胞培养箱中消化2.5h；用PBS洗3遍，10
11、00r/min离心10min；用带血清的DMEM培养液洗1次，反复吹打，使细胞从组织中释放出来；完全DMEM（含100U/ml青霉素、100mg/L链霉素和10胎牛血清）调细胞浓度为1108L-1 ，每3d换液，直至达到95细胞贴壁，开始传代。用PBS洗12遍后加入3ml 0.25%新鲜配制/解冻的胰蛋白酶，放入37 5的CO2细胞培养箱中45min，至在显微镜下观察到大部分细胞已漂浮，用完全DMEM终止消化过程，巴氏吸管吹打培养瓶底部，使未漂浮的细胞脱壁；1000r/min离心510min，用完全DMEM培养液调细胞浓度为1108L-1 ，分装于其他新培养瓶中，每3d换液。传5代后，即制备好
12、RAFLs。1.2.3 直接诱导单核细胞形成破骨细胞样细胞：将人外周血单个核细胞（7106cells/well）分别加入到24孔细胞培养板孔内的10mm10mm玻片上，在37 5的CO2细胞培养箱中孵育2h后，将玻片取出，在PBS液中剧烈漂洗以去除不粘附的淋巴细胞，剩下粘附于包被了多聚赖氨酸玻片上的单核细胞；小心保持玻片正面朝上，重新回置于24孔细胞培养板的孔内，每孔内加入2.8ml含10胎牛血清的完全DMEM培养液。在玻片上培养2周。直接诱导途径A组加10-8mol/L LTB4和25g/L M-CSF，B组加25g/L M-CSF+10-8mol/L LTB4+100g/L OPG进行刺激
13、培养，阳性对照加25g/L M-CSF+30g/L sRANKL，阴性对照只加25g/L M-CSF。1.2.4 间接诱导单核细胞形成破骨细胞样细胞：将传代至35代的RAFLs用0.25Trypsin从细胞培养瓶底壁消化下来，用含10FBS的完全DMEM培养液制备成108L-1 RAFLs细胞悬液，加入放置于24孔细胞培养板孔（16mm直径）内玻片（已经预先用多聚赖氨酸包被）上，补充培养液至2ml/well，在37oC、5% CO2细胞培养箱内孵育3d，以使RAFLs 细胞贴壁于多聚赖氨酸包被的玻片上，并且生长汇合。吸除旧培养液后，每孔内加入1ml 109L-1浓度 PBMC细胞悬液，补充完全
14、DMEM培养液至2ml/well，在37oC、5% CO2细胞培养箱内孵育2h后，将盖玻片取出，在PBS液中剧烈漂洗以去除不粘附的淋巴细胞，保持玻片细胞粘附面一直朝向上方，重新回置于24孔细胞培养板孔内，加入完全DMEM培养液2ml，在37oC、5% CO2细胞培养箱内共培养，这样人单核细胞就会粘附在多聚赖氨酸包被的玻片上的滑膜成纤维细胞表面，从而建立起RAFLs与单核细胞共培养的模型。间接诱导途径A组在25g/L M-CSF + 10-8mol/L LTB4刺激下培养，进行细胞诱导培养3周，B组加25g/L M-CSF + 10-8 mol/L LTB4 + 100g/L OPG，阴性对照组
15、只加25g/L M-CSF。1.2.5 破骨细胞形态学特征的鉴定：分别经过2周和3周培养后，将玻片从培养板的孔中取出，使用白细胞酸性磷酸酶TRAP染色试剂盒行破骨细胞相关的标志物抗酒石酸酸性磷酸酶细胞化学染色3。在光镜下对玻片进行观察，我们把TRAP酶染色阳性的多核性细胞称作破骨细胞样细胞（OCL），OCL的出现被认为是细胞因子具有直接或间接分化作用。2 结果2.1 LTB4可直接诱导人单核细胞分化为破骨细胞样细胞：经过在玻璃盖玻片上2h的孵育，单核细胞粘附在玻片上，在只有25g/L M-CSF刺激的情况下，经过16d的培养，几乎没有出现多核性TRAP染色阳性的破骨细胞样细胞（Osteocla
16、st-like cells）。而在有25g/L M-CSF + 30g/L sRANKL 、10-8mol/L LTB4 + 25g/L M-CSF和25g/L M-CSF + 10-8mol/L LTB4 + 100g/L OPG刺激的情况，出现较多的单核性或多核性TRAP酶染色阳性的细胞（图1）。2.2 LTB4可间接诱导单核细胞分化为破骨细胞样细胞：在玻璃盖玻片上，105RAFLs与106PBMC细胞只有在25g/L M-CSF + 10-8mol/L LTB4的刺激下共培养3周，经过TRAP酶细胞化学染色以及苏木素复染后，在光学显微镜下观察，有许多TRAP酶染色阳性的破骨细胞样细胞形成
17、，而在有25g/L M-CSF和25g/L M-CSF + 10-8mol/L LTB4 + 100g/L OPG组几乎无阳性破骨样细胞形成（图2）。3 讨论破骨细胞的形成过程包括两个阶段：从造血前体细胞分化为破骨细胞样细胞，以及破骨细胞样细胞的功能激活。一直以来认为在体外破骨细胞的诱导分化培养需要破骨细胞前体细胞与成骨细胞或骨髓基质细胞的接触。已经发现在这两种细胞的细胞膜表面表达破骨细胞分化因子（osteoclast differentiation factor/ODF）或者被称作骨保护素配体(osteoprotegerin ligand/OPGL) 4，是破骨细胞分化所必需的直接作用因子，
18、还有Lancey 等于1997年已经克隆鉴定为细胞核因子kB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand/RANKL) 5。RANKL是一种细胞膜跨膜蛋白，是TNF配体超家族成员。许多能增强破骨细胞形成和活性的因子已经被证明是通过上调RANKL的表达来起作用的。破骨细胞膜表面存在RANKL的受体RANK（receptor activator of nuclear factor kappa B）。Simonet 等分离鉴定出骨保护素(osteoprotegerin/OPG) 6,也就是破骨细胞生成抑制因子,是一种可溶性的
19、RANKL的“圈套”受体，与RANK结构完全不同，可以同RANKL结合后抑制其促进破骨细胞分化和增强其活性的能力。巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和破骨细胞分化因子(RANKL)的联合作用对破骨细胞的形成是必需的而且是充分的。M-CSF结合在破骨细胞前体细胞表面的受体c-Fms，对破骨细胞前体细胞的存活和增殖提供必要的信号。在骨组织代谢过程中RANKL是NFKB配体的受体活化物，是TNF配体家族成员。已有报道证明在MCSF存在的条件下，RANKL与它的特异性受体RANK结合，促进破骨细胞的分化和功能激活7,8,9。有些细胞因子可以直接作用在破骨细胞前体细胞诱导其增殖和分化，或者直接作用于初步
20、形成的破骨细胞以增强其活性，包括巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、肿瘤坏死因子（TNF-）、白介素1或（IL-1/）、白介素6(IL-6)和白介素11(IL-11) 。另外一些因子则通过对成骨细胞、骨髓基质细胞和骨表面细胞（bone lining cell）的作用来间接促进破骨细胞前体细胞的分化，包括甲状旁腺激素、甲状旁腺激素相关肽(PTHrp)、1，25二羟维生素D3，雌激素、糖皮质激素、前列素E2、白介素11(IL-11)、Oncostatin M10。虽然IL-1/能直接作用于破骨细胞，TNF-能直接作用于破骨细胞前体细胞，但是二者均可通过对成骨细胞、骨髓基质细胞和骨表面细胞的作用来间
21、接促进破骨细胞前体细胞的分化和活性。为研究细胞因子对破骨细胞的两种分化作用，我们通过本实验建立了两种细胞实验模型，分别用来研究细胞因子对破骨细胞的直接和间接分化作用。在实验研究过程中，利用健康成人外周血的单核细胞做为破骨细胞的前体细胞，能够分化为成熟的功能性破骨细胞。在直接分化作用模型中：我们在单核细胞中加入108mol/L LTB4+25g/L M-CSF，主要作用是直接刺激作为破骨细胞前体细胞的单核细胞诱导分化为破骨细胞样细胞，结果为阳性反应,说明有RANKL的分化作用存在；而在上述基础上加入阻断RANKL与RANK结合的“圈套”受体OPG，不能阻止LTB4对人破骨细胞形成的诱导作用，证明
22、在M-CSF存在的情况下，LTB4能够不依赖于RANKL直接促进人破骨细胞的分化。在间接分化作用的模型中：我们把培养了5代的RAFLs和单核细胞共培养，加入25g/L M-CSF + 10-8mol/L LTB4，主要作用是刺激RAFLs，（有报道证明类风湿关节炎滑膜成纤维细胞能够诱导具有完全表型和功能特征的破骨细胞的形成，其细胞膜表面表达RANKL11,12,13），形成了破骨细胞样细胞；在此基础上又加入了100g/L OPG，则阻断了LTB4上调表达的RAFLs细胞表面RANKL和PBMC中单核细胞表面RANK的结合，从而阻止了单核细胞向破骨细胞样细胞的分化，证明了LTB4的确是作用在RA
23、FLs上，从而间接促进破骨细胞的分化。我们应用35代RAFLs的原因是：原代培养的类风湿关节炎滑膜细胞中，不仅只含有贴壁RAFLs细胞，还包含滑膜巨噬细胞、树突细胞以及淋巴细胞。Hiroshi Takayanagi等14研究证明，经过35代体外传代培养后，全部呈现为贴壁生长的长梭形成纤维细胞样形态而且没有检测到CD-3 positive T细胞和CD-11b positive 巨噬细胞，几乎全部为滑膜成纤维细胞。此模型中35代RAFLs 细胞与PBMC细胞之间的相互作用，对于分化形成破骨细胞是至关重要的。在这两种实验模型中，我们用的细胞因子是国内罕用的LTB4（未见国内其他实验室有相关报道），
24、今后也可以用别的具有促骨细胞作用的细胞因子代替，以验证它们的作用机制。总之，在我们的实验中运用LTB4这种细胞因子作为体外不同途径诱导分化破骨细胞的细胞因子，成功建立了这两种体外诱导分化破骨细胞形成的模型，为进一步研究其它细胞因子对破骨细胞分化作用提供研究基础。参考文献1 Tsurukai T, Udagawa N, Matsuzaki K, et al. Roles of macrophagecolony stimulating factor and osteoclasrt differentiation factor in osteolastogenesis J. J Bone Miner
25、 Metab, 2000, 18: 177-184.2 Flynn MA Qiao M Garcia C et al. Avian osteoclast cells are stimulated to resorb calcified matrices by and pocess receptors for leukotriene B4 J. Calcif Tissue Int, 1999, 64: 154-159.3 Mikin C. Bone acid phosphates: Tartrate-resistant acid phosphates as a marker of osteocl
26、ast function J. Calcif Tissue In, 1982, 34: 285-290.4 Lacey DL, Timms E, Tan HL, et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activationJ . Cell, 1998 (93): 165-176.5 Anderson MA, Maraskovsky E, Billingsley WL, et al. A homologue of the TNF receptor and i
27、ts ligand enhance T cell growth and dendritic cell function J. Nature, 1997 (390): 175-179.6 Simonet WS. Lacey DC, Dunstan CR, et al. a nevel secreted protein involved in the regulation of bone density J. Cell, 1997, 89 (2): 309-319.7 Kobayashi K, Takahashi N, Jimi E, et al. Tumor necrosis factor al
28、pha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of ODF/RANKL-RANK interaction J. J Exp Med, 2000, 191: 275-286.8 Fuller K, Murphy C, Kirstein B, et al. TNF- potently activates osteoclasts through a direct action independent of and strongly synergistic with RANKL J. Endocrinology
29、, 2002, 143: 1108-1118.9 Kudo O, Sabokbar A, Pocock A, et al. Interleukin-6 and interleukin-11 support human osteoclast formation by a RANKL-independent mechanism J. Bone, 2003, 32: 1-7.10 Suda T, Nakamura I, Jimi E, et al. Regulation of osteoclast function J. J Bone Miner Res, 1997 (12): 869-879.11
30、 Lacey DL, Timms E, Tan HL, et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation J. Cell, 1998 (93): 165-176.12 suda H, Shima N, Nakagawa N, et al. Identity of osteoclastogenesis inhibitory factor (OCIF) and osteoprotegerin(OPG): a mechanism by which O
31、PG/OCIF inhibits osteoclastogenesis in vitro J. Endocrinology, 1998 (139): 1329-1337. 13 Gravallese EM, Manning C, Tsay A, et al. Synovial tissue in rheumatoid arthritis is a source of osteoclast differentiation factor J. Arthritis & Rheumatism, 2000 (43): 250-258.14 Takayanagi H, Oda H, Yamamoto S,
32、 et al. A new mechanism of bone destruction in rheumatoid arthritis: synovial fibriblasts induce osteoclastogenesis J. Biochem Biophys Res Commun, 1997 (240): 279-286.A B C D 图1 在玻璃盖玻片上对人单核细胞分别在如下细胞因子的刺激下孵育16天 (A)25ng/ml M-CSF, (B) 25ng/ml M-CSF and 30ng/ml sRANK，(C) 25ng/ml M-CSF and 10-8M LTB4, (D
33、) 25ng/ml M-CSF and 10-8M LTB4 and 100ng/ml OPG, 经TRAP酶细胞化学染色以及苏木素复染后，光学显微镜下观察表现 (A)没有TRAP染色阳性的多核性细胞（放大倍数200），(B,C,D) 有较多的TRAP染色阳性的单核性或多核性细胞(放大倍数400)。A B C图 2 在玻璃盖玻片上，105RAFLs与106PBMC细胞分别在如下细胞因子刺激下共培养3周，(A) 25ng/ml M-CSF，(B) 25ng/ml M-CSF and 10-8M LTB4, (C) 25ng/ml M-CSF and 10-8M LTB4 and 100ng/ml
34、 OPG，经过TRAP酶细胞化学染色以及苏木素复染后，在光学显微镜下观察，(A)几乎没有破骨细胞样细胞（OCL）形成(放大倍数100)。(B) 形成较多破骨细胞样细胞（放大倍数400）。(C) 几乎没有形成破骨细胞样细胞（放大倍数100）。图1 A 在玻璃盖玻片上对人单核细胞在细胞因子的刺激下孵育16天，25ng/ml M-CSF组，TRAP酶细胞化学染色以及苏木素复染，放大倍数200图1 B 在玻璃盖玻片上对人单核细胞在细胞因子的刺激下孵育16天，25ng/ml M-CSF and 30ng/ml sRANKL组，TRAP酶细胞化学染色以及苏木素复染，放大倍数400 图1 C 在玻璃盖玻片上
35、对人单核细胞在细胞因子的刺激下孵育16天，25ng/ml M-CSF and 10-8M LTB4组，TRAP酶细胞化学染色以及苏木素复染，放大倍数400图1 D 在玻璃盖玻片上对人单核细胞在细胞因子的刺激下孵育16天，25ng/ml M-CSF and 10-8M LTB4 and 100ng/ml OPG组，TRAP酶细胞化学染色以及苏木素复染，放大倍数400图2 A 在玻璃盖玻片上，105RAFLs与106PBMC细胞在细胞因子刺激下共培养3周，25ng/ml M-CSF组，TRAP酶细胞化学染色以及苏木素复染，放大倍数100图2 B 在玻璃盖玻片上，105RAFLs与106PBMC细胞在细胞因子刺激下共培养3周，25ng/ml M-CSF and 10-8M LTB4组，TRAP酶细胞化学染色以及苏木素复染，放大倍数400图2 C 在玻璃盖玻片上，105RAFLs与106PBMC细胞在细胞因子刺激下共培养3周，25ng/ml M-CSF and 10-8M LTB4 and 100ng/ml OPG组，TRAP酶细胞化学染色以及苏木素复染，放大倍数100