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1、哈尔滨商业大学毕业设计（论文）哈尔滨商业大学毕业设计（论文） 一株优良葡萄酒酵母菌生理生化特征一株优良葡萄酒酵母菌生理生化特征 的研究的研究 学 生 姓 名 张 银 指 导 教 师 梁 金 钟 专 业 生物工程 学 院 食品工程 2010 年 06 月 10 日 Graduation Project (Thesis) Harbin University of Commerce A fine wine physiological and biochemical characteristics of yeast Student Zhang Yin Supervisor Liang Jinzhong

2、 Specialty Bioengineering School Food Engineering 2010-06-10 毕毕业业设设计计（论论文文）任任务务书书 姓名： 张 银学院： 食品工程 班级： 06 - 2专业： 生物工程 毕业设计（论文）题目： 一株优良葡萄酒酵母菌生理生化特性的研究一株优良葡萄酒酵母菌生理生化特性的研究 立题目的和意义： 一株优良葡萄酒酵母在高品质葡萄酒的生产中起着关键性作用，掌握葡萄酒酵母的生理生 化特性对葡萄酒生产指导作用的重要性不言而喻，对提高企业的效益具有重要的意义。 了解合成培养基、半合成培养基和天然培养基的配制方法。 学习和掌握麦芽汁培养基、马铃薯葡萄

3、糖培养基、豆芽汁葡萄糖培养基和察氏培养基的配 制方法。 掌握鉴别、分离纯化酵母菌的实验方法 近几年，我国的葡萄酒产业得到了迅猛发展，2008年葡萄酒产量已达69.83万千升，工业 总产值达191.68亿元。葡萄酒进口连续多年保持高速增长态势，海关统计数据表明，2008年全 国瓶装进口葡萄酒总额达到2.64亿美元，比2007年新增8000万美元，增长率为43.48%。虽然我 国是葡萄酒消费大国，但是我国葡萄酒产业发展仍然存在一些问题，如国产葡萄酒缺乏高端市 场竞争力（高端市场长期被进口酒占领） 、国产葡萄酒同质化较严重、酿酒葡萄产量和质量落 后等。因此，采取一定的措施，促进我国葡萄酒产业的健康发

4、展成为当下之急，如借鉴葡萄酒 发达国家的先进管理经验，通过采取有效的质量控制措施提高国内葡萄酒的品质，根据国内葡 萄酒行业现状发展具有中国特色的葡萄酒文化 此次实验主要利用廉价的麦芽汁作为葡萄酒酵母的营养物质，采用液态，固态等培养的方 法，探讨葡萄酒酵母的最佳培养条件，生理生化特性。但是由于实验条件有限，只能采用简单 的实验室药品进行试验。希望通过本试验，对提高葡萄酒酵母菌的葡萄酒的生产产量与品质与 帮助，并将其应用于大规模生产中，提高工厂效益。 技术要求与工作计划： 1葡萄酒酵母各种培养基的配置。 2葡萄酒酵母各种培养条件的控制。 3葡萄酒酵母生理生化特性的测定。 4. 葡萄酒酵母培养基的优

5、化。 时间安排 2010-03-102010-03-20 查资料，实验方案设计 2010-03-202010-05-10 葡萄酒酵母生理生化试验 2010-05-102010-05-25 葡萄酒酵母的扩大培养与冻干粉的制得 2010-05-252010-06-05 撰写及修改毕业论文 2010-06-052009-06-10 答辩准备与答辩 指导教师要求： （签字） 年 月 日 教研室主任意见： （签字） 年 月 日 院长意见： （签字） 年 月 日 毕毕业业设设计计（论论文文）审审阅阅评评语语 一、指导教师评语： 指导教师签字： 年 月 日 毕毕业业设设计计（论论文文）审审阅阅评评语语 二、

6、评阅人评语： 评阅人签字： 年 月 日 毕毕业业设设计计（论论文文）答答辩辩评评语语及及成成绩绩 三、答辩委员会评语： 四、毕业设计（论文）成绩： 专业答辩组负责人签字： 年 月 日 五、 答辩委员会主任单位： （签章） 答辩委员会主任职称： 答辩委员会主任签字： 年 月 日 哈尔滨商业大学毕业设计（论文） I 摘 要 本实验主要利用廉价的麦芽汁作为葡萄酒酵母的营养物质，采用液态，固态等培养的方 法，探讨葡萄酒酵母的最佳培养条件，生理生化特性 1。得到菌体最多的最佳培养条件是： 麦芽汁培养基中酵母膏为 1.0%，KH2PO4为 0.5% , （NH4）2SO4为 0.7%, MgSO4为 0.

7、03%，PH 为 5.5 对葡萄酒酵母的生长具有显著的影响作用，糖溶度为 3%，培养温 度 28，接种量为 10%，在 180rmp 的转速下培养，能最大量得到菌体。但是由于实 验条件有限，只能采用简单的实验室药品进行试验。希望通过本试验，能够将结论用于实际生 产中，提高葡萄酒酵母菌葡萄酒的生产产量与品质，并将其应用于大规模生产中，提高工厂效 益。 关键词：关键词：葡萄酒酵母 生理生化特性 优化 哈尔滨商业大学毕业设计（论文） II Abstract In this study, the main advantage of cheap malt juice as wine yeast nutr

8、ients, using liquid, solid and other training methods, the best of wine yeast culture conditions, physiological and biochemical characteristics 1. Be the most optimal cell culture conditions: malt extract medium, yeast extract 1.0%, KH2PO4 to 0.5%, (NH4) 2SO4 to 0.7%, MgSO4 was 0.03%, PH 5.5 the gro

9、wth of wine yeast were significant The influence of sugar solubility of 3%, temperature 28 , 10% inoculum, incubated in 180rmp speed, can get the maximum cell number. However, due to limited experimental conditions, can only be carried out using a simple laboratory test drugs. Hope this trial can be

10、 concluded for the actual production, the increase in the production of wine yeast wine production and quality, and applied to mass production, improve plant efficiency. Key Words：wine yeast, physiological and biochemical characteristics, optimizatio 哈尔滨商业大学毕业设计（论文） 3 目目 录录 摘 要I ABSTRACTII 1 绪 论.5 1

11、.1 葡萄酒酵母的概述5 1.1.1 葡萄酒酵母的来源.5 1.1.2 葡萄酒酵母的特性与应用5 1.2 国内、外葡萄酒酵母菌的研究现状及发展趋势7 1.2.1 国内葡萄酒母菌发酵生产葡萄酒的现状.7 1.2.2 国外葡萄酒酵母菌发酵生产葡萄酒的现状.7 1.3 课题来源.8 1.4 本课题研究的目的.8 1.5 本课题研究的意义.8 1.6 本课题的研究内容.8 2 实 验 内 容9 2.1 实验材料.9 2.1.1 菌种及主要试剂9 2.1.2 主要实验仪器9 2.2 实验方法.10 2.2.1 葡萄酒酵母的活化10 2.2.1.1. 培养基的制备与菌体活化培养.10 2.2.2 葡萄酒酵

12、母的纯化与分离培养.11 2.2.3 葡萄酒酵母生理生化参数的测定11 2.2.4 葡萄酒酵母培养条件的优化14 2.2.5 麦芽汁培养基的优化17 3 结 果 与 讨 论.18 3.1 葡萄酵母酵母的形态18 3.2 葡萄酒酵母菌生理生化特性19 3.2.1 葡萄酒酵母碳源的利用.19 3.2.2 葡萄酒酵母糖发酵实验结果19 3.2.3 葡萄酒酵母对氮源的利用20 3.2.4 葡萄酒酵母生长曲线的测定.20 哈尔滨商业大学毕业设计（论文） 4 3.3 葡萄酒酵母菌生长条件优化21 3.3.1 培养基 pH 对葡萄酒酵母生长的影响21 3.3.2 培养温度对葡萄酒酵母生长的影响.22 3.3

13、.3 渗透压对葡萄酒酵母生长的影响.22 3.3.4 溶氧量对葡萄酒酵母生长的影响.23 3.3.5 接种量对葡萄酒酵母生长的影响23 3.4 麦芽汁培养基的优化23 3.4.1 酵母膏的添加量对葡萄酒酵母生长的影响.23 3.4.2 KH2PO4的添加量对葡萄酒酵母生长的影响24 3.4.3（NH4）2SO4 的添加量对葡萄酒酵母生长的影响.24 3.4.4 MgSO4 的添加量对葡萄酒酵母生长的影响25 3.4.3 麦芽汁培养基优化的具体结果.25 结 论26 参 考 文 献.27 致 谢.28 哈尔滨商业大学毕业设计（论文） 5 1 绪 论 1.1 葡萄酒酵母的概述 1.1.1 葡萄酒酵

14、母的来源 在自然界中，天然存在一种在有氧时可进行有氧呼吸且生长旺盛，在无氧 时进行发酵作用且生长速度较慢的微生物。适宜 pH4-5 的酸性环境，生长温度 一般在 25-30，少数种类可耐 45-47高温，耐糖，少数种类能在高浓度糖浆 (如蜂蜜)中生长，耐受酒精的能力较高的微生物，此微生物是与人类生产生活 息息相关常见的酵母菌2。而葡萄酒酵母是此大家族中的一个小分支，常见于 成熟葡萄的表面。 本次试验的葡萄酒酵母菌种来源是经过诱变育种后筛选，并且在生产中经 历生产条件考验的优良菌种，它对发酵设备，工艺条件等具备了很好的针对性， 非常适合于工业生产4。 1.1.2 葡萄酒酵母的特性与应用 酵母菌是

15、单细胞真菌。菌体为卵圆形、圆形或圆柱形。无鞭毛，不运动。 细胞构造具有真菌细胞的一般特征，细胞壁不含纤维素，由葡聚糖、甘露聚糖 等多糖为主，还含有蛋白质，脂类及几丁质等组分。酵母菌菌落圆形、大而厚， 多呈乳白色，少数红色，呈油脂状或皱皮状。在液体培养基中均匀混浊，有的 形成沉淀；有的浮于表面形成菌膜5。 酵母菌以出芽繁殖为其特征，少数可行分裂繁殖或产生孢子。有性繁殖过 程及方式与其他真菌一样十分复杂。如酿酒酵母子囊孢子萌发形成单倍体营养 细胞以出芽繁殖，两个单倍体营养细胞接合形成双倍体营养细胞也以出芽繁殖， 在一定条件下，双倍体营养细胞转变为子囊母细胞，然后形成子囊3。在形成 子囊孢子之前有减

16、数分裂。子囊孢子一般为 1-4 个。酵母菌的子囊孢子有圆形、 帽形、针形、肾形等随种类而有不同6。 酵母菌可以利用多种糖类进行同化或发酵，一般可利用葡萄糖、蔗糖、麦 芽糖等，少数种类能利用五碳糖及淀粉。酵母菌在有氧时可进行有氧呼吸且生 长旺盛，在无氧时进行发酵作用且生长速度较慢。适宜 pH4-5 的酸性环境，不 同菌株的生长范围为 pH2-8.0；生长温度大多在 25-30，少数种类可耐 45- 47高温。一般耐糖，少数种类能在高浓度糖浆(如蜂蜜)中生长。工业用酵母 哈尔滨商业大学毕业设计（论文） 6 菌耐受酒精的能力较高，一般发酵液中乙醇含量可达 10-12%8。 常见的重要酵母菌各属如下9

17、： 1.酵母菌属(Saccharomyces) 细胞圆形、椭圆形、腊肠形。发酵力强，主 要产物为乙醇及 CO2。主要的种有：酿酒酵母(Saccharomyes cerevisiae)为酿造酒及酒精生产的主要菌种，还用于制造面包及医药工 业；葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)细胞椭圆形或长形，它能将棉 子糖全部发酵，还可食用及用于医药工业。 2.裂殖酵母属(Schizosaccharomyces) 细胞椭圆形、圆柱形，由营养细胞 接合，形成子囊。有发酵能力，代表种为粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)，最早分离自非洲粟米酒，能使菊芋发酵 产生酒

18、精。 3.汉逊酵母属(Hansenula) 细胞圆形、椭圆形、腊肠形，多边芽殖，营养 细胞有单倍体或二倍体，发酵或不发酵，可产生乙酸乙脂，同化硝酸 盐。此菌能利用酒精为碳源在饮料表面形成皮膜，为酒类酿造的有害 菌。代表种为异常汉逊酵母(Hansenula anomala)，因能产生乙酸乙脂， 有时可用于食品的增香。 4.毕赤酵母属(Pichia) 细胞形状多样，多边出芽；能形成假菌丝，常有 油滴，表面光滑，发酵或不发酵，不同化硝酸盐，能利用正癸烷及十 六烷，可发酵石油以生产单细胞蛋白，在酿酒业中为有害菌，代表种 为粉状毕赤酵母(Pichia farinosa)。 5.假丝酵母属(Candida

19、) 细胞圆形、卵形或长形，多边芽殖，有些种有 发酵能力；有些种能氧化碳氢化合物，用以生产单细胞蛋白，供食用 或作饲料。少数菌能致病，代表种有：产朊假丝酵母(Candida utilis)， 能利用工农业废液生产单细胞蛋白；热带假丝酵母(Candida tropicalis) 能利用石油生产饲料酵母。 6.球拟酵母属(Torulopsis) 细胞球形、卵形或长圆形。无假菌丝，多边 芽殖，有发酵力，能将葡萄糖转化为多元醇，为生产甘油的重要菌种， 利用石油生产饲料酵母，代表种为白色球拟酵母(Torulopsis candida)。 7.红酵母属(Rhodotorula) 细胞圆形、卵形或长形，多边芽

20、殖，少数形成 假菌丝。无发酵能力，但能同化某些糖类，有的能产生大量脂肪，对 烃类有弱氧化力。常污染食品，少数为致病菌。代表种为粘红酵母 (Rhodotorula glutinis)。 葡萄酒酵母属于酵母菌属中的酿酒酵母，这是发酵工业上最常用的菌种之 哈尔滨商业大学毕业设计（论文） 7 一按细胞长与宽的比例可将其分为三组。葡萄酒酵母细胞形状以卵形和长卵形 为主，也有些圆形或短卵形细胞，长与宽之比通常为2。常形成假菌丝，但不发 达也不典型。主要用于果酒，啤酒，蒸馏酒和酵母的生产。 1.2 国内、外葡萄酒酵母菌的研究现状及发展趋势国内、外葡萄酒酵母菌的研究现状及发展趋势 1.2.1 国内葡萄酒母菌发

21、酵生产葡萄酒的现状 近几年，我国的葡萄酒产业得到了迅猛发展，2008年葡萄酒产量已达69.83 万千升，工业总产值达191.68亿元。葡萄酒进口连续多年保持高速增长态势， 海关统计数据表明，2008年全国瓶装进口葡萄酒总额达到2.64亿美元，比2007 年新增8000万美元，增长率为43.48%。虽然我国是葡萄酒消费大国，但是我国 葡萄酒产业发展仍然存在一些问题，如国产葡萄酒缺乏高端市场竞争力（高端 市场长期被进口酒占领）、国产葡萄酒同质化较严重、酿酒葡萄产量和质量落 后等。 通过引进消化国外先进酿酒工艺， 合资建设葡萄酒厂，产业结构的调整， 葡萄品种与国际接轨等，全面提高我国葡萄酒的酿制水平

22、，众多葡萄酒企业已 采用了具有国际先进水平的气囊压榨、浸提、低温旋转发酵、人工酵母、急速 冷冻、全自动葡萄酒灌装生产线等生产技术及装备。现阶段我国葡萄酒企业的 酿酒工艺、技术水平与世界同步，从原辅材料、工艺技术到生产设备，达到国 际先进水平。随着人们生活水平的提高、葡萄酒文化的深入传播和葡萄酒消费 市场的积极培育， 产品高端化成为葡萄酒行业的重要趋势，酒庄酒、冰酒、年 份酒、分级酒、树龄酒、产地酒、品种酒等概念化的高端酒在市场上占据的份 额越来越重要，直接拉升了吨酒均价。2006 年吨酒均价已经达到2.6 万元，较 2004 年上涨幅度超过40 %，目前这一趋势仍在延续11。 1.2.2 国外

23、葡萄酒酵母菌发酵生产葡萄酒的现状 近几年，世界葡萄酒年产量、葡萄种植面积、人均葡萄酒年消费量呈连续 下滑趋势， 而全球性的金融危机更加剧了这一趋势。2008 年全球葡萄酒年产 量2765 万t、葡萄种植面积780 万km2。世界上三大葡萄酒生产国为意大利 （496.8 万t） 、法国（436.5 万t） 、西班牙，这3 个国家葡萄酒产量占全球总产 量的50 %。 2008 年，全球葡萄酒年销售量2430 万t，年销售总产值达1 千亿美元，人 均葡萄酒消费量为4.5 L，较1990年下降1 L，达到近年来的最低点。人均葡萄酒 消费量下降的主要原因是由于作为葡萄酒主要消费市场的欧盟国家生活方式的

24、哈尔滨商业大学毕业设计（论文） 8 改变，尤其是法国、意大利，这些国家均有着以葡萄酒佐餐的传统。随着欧洲 人生活节奏加快，软饮料、果汁、瓶装水逐渐在某些场合取代了葡萄酒的重要 位置，尤其是年轻消费者已不再青睐葡萄酒17。1980 年，法国和意大利人的 葡萄酒消费量占到全球消费总量的45 %，但2008 年降至24 %。欧盟人均消费 量从1995 年的30 L降至2008 年的28 L。美国是世界增长最快的葡萄酒消费国 之一，2008 年其人均葡萄酒消费量为9 L。法国、意大利分别为51 L 和44 L， 梵蒂冈是全球人均葡萄酒消费量最高的国家，为62 L11。 1.3 课题来源 梁教授工厂委托

25、项目。 1.4 本课题研究的目的本课题研究的目的 此次实验主要利用廉价的麦芽汁作为葡萄酒酵母的营养物质，采用液态， 固态等培养的方法，探讨葡萄酒酵母的最佳培养条件，生理生化特性。但是由 于实验条件有限，只能采用简单的实验室药品进行试验。希望通过本试验，能 够提高葡萄酒酵母菌葡萄酒的生产产量与品质，并将其应用于大规模生产中， 提高工厂效益。 了解合成培养基、半合成培养基和天然培养基的配制原理。 学习和掌握麦芽汁培养基、马铃薯葡萄糖培养基、豆芽汁葡萄糖培养基和 察氏培养基的配制方法。 掌握鉴别、分离纯化酵母菌的实验方法 1.5 本课题研究的意义 一株优良葡萄酒酵母在高品质葡萄酒的生产中起着关键性作

26、用，掌握在发 酵生产中起关键性作用的葡萄酒酵母的生理生化的重要性，对生产的指导作用 的重要性不言而喻，掌握了优良葡萄酒的生理生化特性，对葡萄酒的发酵生产 工艺进行优化，对提高企业的效益具有重要的意义。 1.6 本课题的研究内容 本课题以葡萄酒酵母为研究中心,检测其生理生化特性 ,探讨其最佳培养， 发酵条件，获得最佳菌种的条件,优化麦芽汁培养基，然后利用以优化的麦芽汁 培养基，在葡萄酒酵母菌最优的生长条件下进行液体培养，获得菌体细胞，然 后在真空冷冻干燥器中冷冻干燥，获得酵母菌冻干粉。 哈尔滨商业大学毕业设计（论文） 9 2 实 验 内 容 2.1 实验材料 2.1.1 菌种及主要试剂 2.1.

27、1.1 菌种 优良葡萄酒酵母菌（指导老师给），进过诱变筛选，生产考验的菌种。 2.1.1.2 主要试剂 表 2-1 主 要 试 剂 试验材料规格产地 葡萄糖生化试剂天津市化学试剂一厂 麦芽糖生化试剂中国科学院上海生物化学研究所 蛋白胨生化试剂天津化学试剂批发厂 磷酸二氢钾分析纯天津市天大化工实验厂 磷酸氢二钾分析纯天津市天大化工实验厂 硫酸镁分析纯天津市天大化工实验厂 氯化钠分析纯天津市天大化工实验厂 盐酸分析纯天津四通化工厂 丙酮分析纯天津四通化工厂 硫酸钾分析纯天津市科密欧化学试剂开发中心 氯化钾分析纯天津市科密欧化学试剂开发中心 七水硫酸镁分析纯北京化工厂 硫酸亚铁分析纯天津市赢达稀贵化

28、学试剂厂 硫酸铵分析纯天津市基准化学试剂有限公司 2.1.2 主要实验仪器主要实验仪器 表 2-2 实 验 仪 器 哈尔滨商业大学毕业设计（论文） 10 实验设备与仪器型号产地 离心机LG10-2.4A北京京力离心机有限公司 电子天平MD200-3 型上海天平仪器厂 糖度计RHB-32ATC泰斯特仪器有限公司 低温冷冻离心机Sigma 216K德国 SIGMA 电热恒温培养箱DHG-9053A南京电器三厂 立式压力蒸汽灭菌锅LDZX-50KB上海申安医疗器械厂 血球计数板XB-K-25玉环县求精医用仪器厂制造 显微镜Motic-BA 210麦克奥迪实业集团有限公司（福建） 2.2 实验方法 通

29、过前人的实验，可以简单的确定葡萄酒酵母菌生理生化实验方向，确定 环境对其影响的实验方案与培养葡萄酒酵母的实验条件。葡萄酒酵母生理生化 研究的主要内容有：糖发酵实验、碳源同化实验、氮源同化实验等。葡萄酒酵 母生长的主要影响因素有：培养基 PH、渗透压、温度、接种量及溶氧量等 10。 除此之外，我对葡萄酒酵母的进行了优化，微生物的生长过程是微生物有效利 用环境中的营养物质通过自身的生长代谢活动来获取菌体的过程，生长水平不 仅取决于生产菌种自身的性能，更取决于生长环境，使菌种的生长能力充分表 达出来。对于特定的微生物而言，就要研究其对环境条件，如培养基、培养温 度、pH 以及氧的等需求，菌种处于产物

30、合成的最佳环境中，菌的代谢向需要的 方向进行，达到最佳的生长水平。我们在葡萄酒酵母培养条件优化过程中，对 葡萄酒酵母的培养基的 pH、培养温度等影响因素进行了初步研究 15。 2.2.1 葡萄酒酵母的活化 2.2.1.1. 培养基的制备与菌体活化培养 葡萄酒酵母活化培养基制备： 新鲜葡萄汁 100mL ，蔗糖 1.5% ，琼脂 2%。 将培养基分装于干净的三角瓶内，在 121 、0.1MPa 灭菌 15 min 后，在 无菌操作台上凉至 50左右，然后倒入平板中，待平板凝固后用接种环划线接 种，接种后放置在 28的恒温培养箱中，培养 4872 h，长出均落后放置于冰 箱中备用5。 哈尔滨商业大

31、学毕业设计（论文） 11 2.2.2 葡萄酒酵母的纯化与分离培养 葡萄酒酵母的纯化与分离培养基还是用上述活化培养基。 葡萄酒酵母的分离纯化还是用平板划线分离法。用接种环蘸取少许已活化 的菌种，然后在琼脂平板面上分区进行划线，划线接种的平板经过培养后会得 到呈分散状态的单菌落。 具体操作方法：接种环灭菌从琼脂平板（A）中粘去取菌种划线分离 （B）在适宜的条件下培养5 2.2.3 葡萄酒酵母生理生化参数的酵母生理生化参数的测定 2.2.3.1 葡萄酒酵母菌糖发酵试验 (1)实验原理 酵母菌在厌氧条件下能分解糖类，产生各种有机酸、气体和其它产物。酵 母菌种类不同对各种糖类的发酵能力各异。因此，这是鉴

32、别酵母菌种类的一项 重要依据。 酸的产生可根据培养基中溴甲酚紫（pH6.8-5.2 由紫变黄）或溴麝香草酚蓝 （pH7.6-6.0 由蓝变黄）指标剂颜色的改变来确定。产气可由发酵管气泡的产生 予以证实。 (2)糖发酵基础液:1.6%溴甲酚紫，葡萄糖、乳糖、蔗糖和麦芽糖，葡萄酒 酵母斜面菌种。 (3)糖发酵培养基：蛋白胨 1 g,Nacl 0.5 g ，葡萄糖（或其他种类的糖） 1 g ，蒸馏水 100 mL， 112灭菌 30min (4)实验内容： a、糖发酵基础液配制好后，按培养液容量的 1%加入糖，分装于杜氏发酵 管中（培养液的高度约为 4-5 厘米），再在试管内加入倒置的小玻管（约 0

33、.42.02.5 厘米）一支。每种糖设三个重复管，121高压灭菌 15 分钟。 b、将啤酒酵母分别接入上述各发酵管中，置 30下培养 48-72 小时，另 以不接种者作对照。 c、如产酸则培养液 pH 值下降而变黄色；如产气，则必先产酸，并在杜氏 小管顶端出现气泡。 d、结果记录。以“ 酸”表示产酸，“0”表示产气，“”表示产酸产气， “”表示无变化，“碱”表示产碱7。 哈尔滨商业大学毕业设计（论文） 12 2.2.3.2 葡萄酒酵母菌碳源同化试验 (1)实验原理： 碳是酵母菌细胞的重要组成成分，约占酵母菌体重量的 50%，为酵母菌生 命活动提供所需的能量和组成其结构的物质。酵母菌对各种碳源的

34、利用，因种 类不同而异。这是酵母菌分类鉴定的一个重要依据。 (2)无碳基础培养基，葡萄酒酵母斜面菌种，0.5%的葡萄糖、蔗糖、乳糖、 麦芽糖、麦芽糖溶液。 (3)实验内容 a、液体试管法 每管加无碳基础培养基 5 毫升，加被测试的某种碳源，并以葡萄糖作为 对照。 接入葡萄酒酒酵母，28下培养 1-2 周，观察结果。 b、生长图谱法 无碳培养基内加入 2%的水洗琼脂，融化后冷却至 45-50，到至平板。 接种新鲜培养的啤酒酵母于 1 毫升无菌生理盐水内，搅匀后倒入上述未 凝平板内，摇匀待凝。 皿底用特种蜡笔写上被测试各种碳源的标记。 用不锈钢匙，按标记加入相应的米粒大小的碳源，并以葡萄糖作对照。

35、 28下培养 24-48 小时后观察结果。 c、结果观察 液体试管中是否形成醭，环岛等。 生长图谱中测量菌落大小，说明对碳源的利用情况7。 2.2.3.3 葡萄酒酵母菌氮源同化试验 (1)实验原理： 酵母菌蛋白酶不分泌于菌体外，故酵母菌对复杂的蛋白质不能利用，酵母 菌对一些较简单的含氮化合物的利用程度也不一致。 (2)无氮基础培养基，葡萄酒酵母斜面菌，0.5%的蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵 和尿素溶液。 (3)实验内容： a、液体试管法 方法同上，以被测试的氮源代替碳源，不加任何氮源作空白对照。 哈尔滨商业大学毕业设计（论文） 13 b、生长图谱法 方法同上，以被测试的氮源代替碳源，不加任何氮化物作

36、空白对照。 c、结果观察 液体试管中溶液 pH 值的变化。 生长图谱中测量形成菌落的大小，说明对各种氮源的利用情况。 2.2.3.4 葡萄酒酵母菌生长曲线测定 (1)实验原理： 葡萄酒酵母菌属于单细胞真核型微生物，把一定数量的酵母菌接种于的液 体培养基中，在适宜的温度下培养时，它的生长过程具有一定的规律性。在其 生长过程中，定时取样测定酵母菌细胞数量，然后以酵母菌细胞数的对数作纵 坐标，生长时间作横坐标，绘制所得的曲线叫生长曲线。此生长曲线大致可划 分为四个阶段：调整期、对数生长期、稳定期和衰退期6。 (2)酵母菌增殖培养基（YEPD 培养基） 葡萄糖 2g，胰蛋白胨 2g，酵母提取物 1g，

37、蒸馏水 100 ml PH 5.05.5 ，121灭菌 20min。 (3)实验内容： a、将培养 24 小时左右的葡萄酒酵母斜面菌种，用无菌水洗下菌苔，以 3000 转/分的速率离心，得菌体。将酵母菌体沉淀物再用无菌水洗 2-3 次后， 制备葡萄酒酵母菌悬液（细胞数量约 106 左右/毫升），测数备用。 b、取上述菌悬液 1 毫升于盛有清亮的酵母增殖培养液的试管中，25下培 养，以此为起始时间，记录起始溶液的细胞数。并在培养 1，2，4，6，8，9，10，11，12，14，16，20，22，24 小时时分别取样检测酵 母菌细胞数量。 c、酵母菌细胞数量的检测 方法：血球计数板计数法。此法是先

38、将以上定时取出的被检样品作一系列 稀释后，使菌落数约为 105-106 个/毫升，取一滴稀释液滴于血球计数板内，在 显微镜下直接计算细胞总数5。 d、绘制生长曲线 以酵母菌细胞数的对数作为纵坐标，以培养时间作为横坐标，画出酵母菌 的生长曲线。并分析酵母菌群体的生长规律。 计数所用的血球板的规格为 25*16 酵母细胞数（1ml 培养液）=80 小格内酵母细胞数/80*400*10000*菌液稀释 哈尔滨商业大学毕业设计（论文） 14 倍数 2.2.4 葡萄酒酵母培养条件的优化酵母培养条件的优化 2.2.4.1 培养基 pH 对葡萄酒酵母的影响实验 (1)实验原理： 微生物作为一个群体，其生长的

39、 pH 范围很广泛，但绝大多的数种类都生长 在 pH 59 之间，而每种微生物都有其生长的最高、最低和最适 pH。现以培养 基的 pH 为单因数，探讨葡萄酒酵母的最适 pH。 (2)豆芽汁葡萄糖液体培养基，葡萄酒酵母斜面菌，恒温培养箱，移液管， 培养皿等。 (3)实验内容： a、配置豆芽汁葡萄糖液体培养基，分别调至 pH 3、5、7、9 和 11，每管 pH 分装 3 管，每管盛培养液 5ml，灭菌备用。将葡萄酒酵母制成酵母菌悬液， 每管接种一滴（或 0.1ml），摇匀，置 28恒温箱中培养。 b、结果观察： 培养 24h 后观察结果。根据培养液的浑浊度判定微生物在不同 PH 的生长情 况：以

40、“”表示不生长，“+”表示生长，并以“+”、“+”、“+”表示 不同的生长量，记录实验结果。 2.2.4.2 培养温度对葡萄酒酵母的影响实验 (1)实验原理： 不同微生物生长繁殖所要求的最适温度不同。根据微生物生长的最适温度 范围，可分为高温菌、中温菌和低温菌。自然界中绝大多数微生物属中温菌， 葡萄酒酵母菌也属中温菌。现以培养温度为单因数，探讨葡萄酒酵母的最适生 长温度。 (2)豆芽汁葡萄糖培养基，葡萄酒酵母斜面菌，恒温培养箱，移液管，培 养皿等。 (3)实验内容： a、配置豆芽汁葡萄糖培养基，分别取 8 支试管，每管装 5ml 豆芽汁葡萄糖 培养液，灭菌后分别标明 20、28、37和 45四

41、种温度，每种温度两管。 向每管接入培养 1820h 的葡萄酒酵母菌液 0.1mL，混合均匀。 哈尔滨商业大学毕业设计（论文） 15 b、结果观察： 将上述各管分别置于不同温度下，进行振荡培养 24h，观察结果。根据菌 液的浑浊度，以“”表示不生长，“+”表示生长，并以“+”、“+”、 “+”表示不同的生长量，记录实验结果。 2.2.4.3 渗透压对葡萄酒酵母的影响实验 (1)实验原理： 渗透压对微生物的生长有重大的影响。等渗溶液适合微生物的生长；高渗 溶液可使微生物细胞脱水发生质壁分离；而低渗溶液则会使细胞吸水膨胀，甚 至使细胞破裂，现以培养基的渗透压为单因数，探讨葡萄酒酵母的最适生长渗 透压

42、。 (2)豆芽汁葡萄糖培养基，葡萄酒酵母斜面菌，恒温培养箱，移液管，培 养皿等。 (3)实验内容： a、以察氏培养基为基础，把其含糖量分别为 3%、10%、20%、40%配置培 养液，每种含糖量两管，每管装 5ml。灭菌后，各管分别接入葡萄酒酵母 0.1ml。以肉膏蛋白胨培养基为基础，把其 NaCl 含量分别为 0.5%、2.5%、5%、10%配置培养基，每种 NaCl 量 2 管，每管装 5ml。灭菌后， 各管分别接入葡萄酒酵母 0.1ml。 b、结果观察： 将接种酿酒酵母的各管置于 28恒温培养箱中培养，24h 后观察结果。根 据菌液的混浊度，以“”表示不生长，“+”表示生长，并以“+”、

43、“+”、 “+”表示不同的生长量，记录实验结果。 2.2.4.4 溶氧量对葡萄酒酵母的影响实验 (1)实验原理： 不同微生物生长繁殖所要求的溶氧不同。根据微生物对氧的需求，可把微 生物分为需氧菌和厌氧菌两大类，又可分为需氧菌、兼性厌氧菌、微需氧菌、 耐氧菌和厌氧菌。葡萄酒酵母菌属于兼性厌氧菌。现以培养温度为单因数，探 讨葡萄酒酵母的最适生长温度。 (2)豆芽汁葡萄糖培养基，葡萄酒酵母斜面菌，摇床培养器，移液管，培养 皿等。 哈尔滨商业大学毕业设计（论文） 16 (3)实验内容： a、配置豆芽汁葡萄糖培养基，分别取 5 支 250ml 的三角瓶，每管装 50ml 豆芽汁葡萄糖培养液，灭菌后分别标

44、明 0 rpm/min、50 rpm/min、100 rpm/min、150 rpm/min 和 180 rpm/min 五种转速。向每支三角瓶中接入培养 1820h 的葡萄酒酵母菌液 1mL，混合均匀。 b、结果观察： 将接种酿酒酵母的各个三角瓶分别放置于不同转速的摇床中培养，24h 后 观察结果。根据菌液的浑浊度，以分度光度计测各个试管中菌液的 OD 值，记录 实验结果。 2.2.4.5 接种量对葡萄酒酵母的影响实验 (1)实验原理： 不同的接种量对葡萄酒酵母生长速度有重要影响。现以接种量为单因数， 探讨葡萄酒酵母的最适的接种量。 (2)YEPD 培养基，葡萄酒酵母斜面菌，摇床培养器，移液

45、管，培养皿等。 (3)实验内容： a、配置 YEPD 培养基，分别取 9 支 250ml 的三角瓶，每管装 50mlYEPD 培养 液，灭菌后分别标明 0.1%、0.5%、1%、5%、10%、15%、20%、25%和 30%九种接 种量。向每支三角瓶中接入培养 10h 的不同量的葡萄酒酵母菌液，混合均匀， 自然 pH， 28，180rpm，培养 24h。 b、结果观察： 将接种酿酒酵母的各个三角瓶放置 180rpm 转速的摇床中培养，24h 后观察 结果。根据菌液的浑浊度，以分度光度计测各个试管中菌液的 OD 值，记录实验 结果。 2.2.5麦芽汁培养基 需要优化的麦芽汁培养基： 麦芽汁 10

46、15 Br 酵母膏 1.5% KH2PO4 0.5% （NH4）2SO4 0.5% MgSO4 0.05% PH 6.06.5 哈尔滨商业大学毕业设计（论文） 17 在 115灭菌 15min 5 3 结 果 与 讨 论 3.1 葡萄酵母酵母的形态 葡萄酒酵母（Rhodotorula sp.）细胞形状多为卵形和长卵形为主（如图 3-1 所示） ，也有些圆形或短卵形细胞，长与宽之比通常为 29。常形成假丝，但不 发达，也不典型，其形成的菌落与细菌相似，但较之大而厚，菌落表面湿润、 粘稠，易被挑起，菌落呈乳白色4。 哈尔滨商业大学毕业设计（论文） 18 图图 3-1 显微镜下所观察到的葡萄酒酵母菌

47、与菌落形态显微镜下所观察到的葡萄酒酵母菌与菌落形态 3.2 葡萄酒酵母菌生理生化特性 3.2.1 葡萄酒酵母碳源的利用葡萄酒酵母碳源的利用 通过对葡萄酒酵母的碳源同化实验，可得到以下结果： 表表 3-1 葡萄酒酵母的碳源同化实验葡萄酒酵母的碳源同化实验 实验碳源葡萄糖麦芽糖蔗糖乳糖 OD 值 0.4120.3920.3850.256 从表 3-1 中可以看出葡萄酒酵母对葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖的利用率分 大小别为：葡萄糖麦芽糖蔗糖乳糖。在液体培养 5 天后，在试管中出现 菌膜，环岛；葡萄酒酵母在液体培养集中均匀生长，发生混浊，产生沉淀。 3.2.2 葡萄酒酵母糖发酵实验结果 通过对葡萄酒酵母

48、的糖发酵试验，可得到以下结果： 表表 3-2 葡萄酒酵母的糖发酵试验葡萄酒酵母的糖发酵试验 葡萄糖0酸+ 乳糖碱无明显变化 蔗糖酸无明显变化 麦芽糖酸无明显变化 注：“ 酸”表示产酸，“0”表示产气，“”表示产酸产气，“”表示无变化，“碱” 表示产碱。 哈尔滨商业大学毕业设计（论文） 19 从表 31 中可以看出葡萄酒酵母发酵葡萄糖产气，产酸，培养液显酸性； 发酵乳糖培养液显碱性；发酵蔗糖、麦芽糖，培养液现酸性，其他的无明显变 化。 3.2.3 葡萄酒酵母对氮源的利用 通过对葡萄酒酵母的氮源同化实验，可得到以下结果： 表表 3-3 氮源蛋白胨硝酸铵硫酸铵空白尿素 菌落大小 0.81mm 0.70.8mm0.40.5mm0.10.2mm不生长 注：无氮培养基：葡萄糖 2 g K2HPO 4 0.1 g MgSO47H2O 0.05 g 酵母膏 0.01 g 水洗琼脂 2 g 加无氮蒸馏水至 100ml PH 6.5 在 115 湿热灭菌 30min 5 此培养基适用于测定酵母菌对氮源的利用（加被测氮源 0.5%） 由结果可知，葡萄酒酵母对各种氮源的利用率表现为：蛋白胨硝酸铵 硫酸铵尿素 液体培养基培养五天 PH 的变化： 初始 PH