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1、台湾独有珍稀药用真菌樟芝液态发酵产业化及其产品开发项目计划书一、 项目的目的及意义樟芝（Antrodia cinnamomea）又称牛樟芝，牛樟菇，樟内菇等，是台湾特有的珍贵药用真菌，仅生长在中国台湾山区海拔450-2000米之间的牛樟树腐朽的空心内壁，具有强烈的黄樟气味。樟芝含有多种生理活性物质，如多糖，三萜类，超氧化物歧化酶，腺苷，维生素，微量元素锗和氨基酸等，其中多糖和三萜类化合物是其主要的生理活性物质，具有免疫调节、抗肿瘤、保肝、抗病毒、保护神经系统、抗高血压、抗高血脂、抑菌、抗辐射、抗氧化、抗炎症，抗衰老等多种生物活性，可以广泛的应用于医药，食品，化妆品，日化等领域。樟芝自然生长条件
2、苛刻，生长缓慢，此外不法商人的滥采滥伐，导致野生樟芝资源严重短缺和价格的一路飙升。人工栽培面临不能获得樟芝子实体，不易除去不可食用部分，易染菌，周期长等问题。而樟芝深层液态发酵产物富含各种生理活性物质，几乎无毒副作用，易于大规模人工生产。因此采用现代发酵工程技术来生产樟芝的有效物质是开发樟芝，造福人类的最经济，最有效，最环保的方法。 在前期已完成深层液体发酵试生产的基础之上，本项目拟采用投融资，项目整体转让，合作开发等方式建立樟芝深层液态发酵生产线一条，同时展开后续研发实验，开发以樟芝为原料的日化产品2-3个，健康产品2-3个，药品1-2个，最终填补国内空白，为这一珍稀资源的开发和利用开辟新的
3、途径。二、国内外技术发展现状与趋势2.1 樟芝的生物学特性樟芝又称樟生薄孔菌、牛樟菇、牛樟芝、红樟芝、血灵芝、樟内菇、红樟菰等，属于担子菌亚门，层菌纲，非褶菌目，多孔菌科，薄孔菌属，属台湾独有物种。子实体多年生，平伏无柄，木栓质至木质，多附着于牛樟树中空心材内壁上生长。子实体菌肉两层，初生时表层(上层)鲜红色，渐长为白色、淡红褐色、淡褐色或淡黄褐色，下层淡黄色；老熟后成钟状，皮壳黄褐色至黑色，外皮有明显的环状构造，质地极其坚硬。子实体形态多变化，有板状、钟状、马蹄状或塔状，一般以板状居多。新鲜或干老樟芝子实体有浓郁的香樟味，整面充满菌孔(45个mm2 )，不规则，菌管孔口乳黄色，管口近圆形，内
4、有孢子，味极苦。生殖菌丝透明微黄，壁薄，有锁状联合：骨架菌丝淡黄色，壁厚到近实心。樟芝仅生于台湾深山(海拔4502 000m)特有的“国宝”级树种 百年以上的牛樟树(Cinnamomum kanehirai)上，生于空心树干之心材内壁(树干空洞)的称为樟窟内芝，少数生于枯死倒伏之牛樟树木材潮湿面的称为樟外芝。樟芝生长极为缓慢，生长期也仅限于每年的6至1O月，形成子实体的时间相当长，其生长环境均属于幽暗、潮湿且温度稍低之中海拔地区。樟芝主要分布在台湾桃园复兴乡、角板山，苗栗南庄乡、三湾乡，南投竹山镇、水里乡，屏东县六龟乡、高雄旗山等区域之海岸山脉阔叶林内。2.2 樟芝的学名以及分类学历史1990
5、年，中国科学院昆明植物研究所的臧穆与台北医学院的苏庆华共同署名发表我国台湾产灵芝属一新种樟芝Ganoderma camphoratum M.Zang & C.H.Su。因当时模式标本(标本号HKAS 22294) 在实验室中沾染了灵芝类的孢子，以致将灵芝孢子描述成樟芝的孢子，误作为灵芝属的新种类；同时。认为其寄主是香樟Cinnamomum camphora。这篇论文在刊印时将“camphoratum” 及“camphora”中“cam-”误排为“com-”。1995年，台湾省林业试验所张东柱等人根据樟芝子实体外观特征、气味、生长速度、孢子显微结构等研究结果，认为樟芝应归入多孔菌科的薄孔菌属An
6、trodia，将其学名订正为Antrodia cinnamomea TTChang & WNChou (标本号TFRI 119)，并指出其寄主应为牛樟Cinnamomun kanehirai。这个时期有关樟芝的研究文献中，有的还将樟芝的寄主认作沉水樟Cinnamomum micranthum (Hayata) Hayata。1997年，台湾自然科学博物馆的吴声华等人重新检验了樟芝标本HKAS 22294和TFRI 119，整合前两次文献中的一致内容，再次进行新种的修订，并按真菌分类中新种命名的原则，将樟芝学名订正为Antrodia camphorate ( M. Zang& C. H. Su)
7、 Sheng H. Wu, Ryvarden & T. T. Chang；把原定名人M. Zang & C. H. Su置前。并将张东柱等发表的Antrodia cinnamomea T. T. Chang& W. N. Chou处理为Antrodia camphorate 的同义名(即同物异名)。该新组合名发表后，为台湾学术界及产业界所接受。不过， 由于台湾省禁止樟芝物种外流。中国科学院微生物研究所真菌标本馆没有研究与保藏樟芝菌种或标本，故樟芝尚未收入中国真菌志多孔菌科。2.3 樟芝的民间应用情况樟芝疗效流传甚久，传说台湾原住民在采伐时，无意问发现生长于牛樟树上的樟芝。早期台湾原住民因长期喜
8、欢饮酒，导致罹患肝病的人数一直居高不下。后来他们发现，在喝过以樟芝熬煮的汤汁后，肝病竟会痊愈，并且体魄强健，因此，原住民每天外出时，都会含上一片樟芝。他们将樟芝视为最珍贵的药材，中药店视之为上好解毒剂，凡食物中毒、腹泻、呕吐、农药中毒均以樟芝作为解毒之用。它对改善肝、胃机能及治疗血液循环疾病均有良好功效。因此，樟芝药效被广泛宣传，在台湾地区称为“神芝”，相传在治疗肝癌上似乎特别有效，一般应用则可治疗急性腹痛、消炎、抗过敏、解毒保肝、强身，其解酒效力更是一流。但是由于樟芝作为新种于1990年才正式发表，且樟芝是台湾特有种，台湾政府禁止樟芝物种外流，加上历史造成两岸隔阂等因素，因此，在大陆传统的中
9、医资料中，始终未见有关樟芝的任何记载，故而开发相对非常的落后。2.4 樟芝的有效成分迄今为止，从樟芝子实体中已经分离得到70多种化合物，包括多糖、二萜类、三萜类、甾体类、苯环衍生物等，其中多数为新化合物。据报道，多糖、萜类和甾体类化合物为樟芝的主要活性化合物。A樟芝多糖目前对于樟芝多糖的研究主要集中于提高其产量和药理活性，对于多糖的分离纯化和结构特性研究报道较少。Huang等人发现樟芝发酵滤出液中多糖的组成主要为甘露糖，葡萄糖和木糖，和少量半乳糖和糖醛酸。但是樟芝菌丝体水提取物和碱液提物中多糖的主要组成单糖为葡萄糖和木糖。通过NMR、X射线和红外光谱测定，多糖分子量大约为106 kDa，其结构
10、具有-D-葡聚糖的结构。经证实，具有-1,3-D-葡聚糖骨架呈现螺旋形的结构，是多糖类物质具有抗肿瘤活性的必要结构。B樟芝三萜类化合物野生樟芝的味道极苦，其甲醇提取物的量高达30%，高达灵芝10倍，暗示着其所含三萜类化合物较多。Chen等人在1995年首次从樟芝子实体中分离得到了三种新的麦角甾烷型（ergostane）三萜类化合物Anticin A-C。1996年，Chen等人以相同的方法又发现四种新的三萜类化合物：actcin E-F、methyl antcinate G和methyl antcinate H。随后，多项研究报道证实了樟芝子实体中含有较多的三萜类化合物，且多数为新化合物。到目
11、前为止，共从樟芝中分离纯化得到30来种三萜类化合物，骨架结构主要以麦角甾烷和羊毛脂烷（lanostane）为主（表1）。樟芝子实体分离出的三萜类化合物的支链上均具24(28)-en的结构，表明樟芝三萜类化合物的代谢途径与常见的灵芝三萜可能有很大的不同。另一方面，目前绝大多数研究都是围绕从樟芝子实体中分离纯化得到的新化合物，对于人工培养的樟芝获得大量化合物研究鲜有报道。表1樟芝子实体、菌丝体和发酵液中分离鉴定的三萜化合物化合物 2.5 樟芝三萜的生物活性自从樟芝被报道以来，樟芝以独特的生物活性引起了人们的研究热情，截至到目前为止共发表了大约150篇的SCI研究论文。大量研究文献表明，樟芝菌有免疫
12、调节、抗肿瘤、保肝、抗病毒、保护神经系统、抗高血压、抗高血脂、抑菌、抗辐射、抗氧化、抗炎症等多种生物活性，具有很好的市场开发前景。由于篇幅限制，本文仅对成药性和市场前景最好的护肝，抑制乙肝病毒，抗肝癌等方面进行详尽的介绍(见表2)。表2 樟芝的护肝药理活性功能实验样品，剂量模型，实验设计结果参考文献保肝樟芝子实体或菌丝体 500mg,1000mg/kg.day酒精诱导急性肝损伤，雄性SD 大鼠，体内通过抗氧化对急性肝损伤有显著保护作用。Dai et al. (2003)樟芝子实体或菌丝体 500mg,1000mg/kg.day酒精诱导急性肝损伤，雄性SD 大鼠，体内1）能够显著降低大鼠血清AS
13、T，ALT，ALP，BIL 和TG (P0.05)；2）能够抑制乙醇所致的MDA升高，并显著提高GSH 水平及GPx和GR活性(P0.05)；3）显著改善经四氯化碳处理后引起的肝组织病变。Lu et al. (2007)樟芝20%酒精诱导慢性酒精性肝发炎，大鼠，体内能够显著降低TLR-4,5,7,9，伴随着其下游蛋白MyD88， MAPK pathway p-Erk， p-p38， PI3K， AKT及其产生的发炎因子的明显下降。Huang et al(1999)野生樟芝（25mg/kg.Day)20%酒精诱导酒精性脂肪肝，体内可以显著降低肝脏中胆固醇，脂肪的含量；可显著改变酒精伤肝代谢有关基
14、因的表现活性；可加强GSH，Trolox的抗氧化能力，降低肝脏中丙二醛的含量和降低血中转氨酵素的活性；肝组织受损程度大幅减轻。Huang et al(2010)牛樟芝水提物250,750,1250mg/ kg.day. 4day/week四氯化碳诱导急性肝功能障碍，雄性ICR 大鼠，体内通过显著降低抗氧化酵素（catala -se, SOD, TBARs等）的含量，且降低脂质过氧化的程度以达到保肝护肝的作用。Hsiao et al.(2003)樟芝菌丝体发酵液干燥物250mg,500mg/kg.day四氯化碳诱导急性肝功能障碍，雄性SD 大鼠，体内通过向上调节肝脏GSH依赖酶，维持正常的GSH
15、GSSH 比率和清除四氯化碳代谢产生的自由基，在防止肝脏系统的氧化损伤方面发挥显著作用。Song and yen.(2003)樟芝菌丝体发酵过滤液，3，12.4，24.8ml/kg. day四氯化碳诱导慢性肝功能障碍，体内对肝脏生理机能有明显的正面影响，可明显降低肝纤维化程度及变性程度，增加肝脏红血球中GSH含量及增加抗氧化酵素活性，降低肝脏脂质过氧化程度，而有利于体内氧化压力的下降。Chen et al.(2002)樟芝菌丝体（0.5,1.0 g/kg.day)四氯化碳诱导急性肝功能障碍，雄性WISTAR大鼠，体内能够显著抑制四氯化碳引起的肝纤维化进程。Lin et al.(2006)樟芝水
16、提取物，连续12周硫代乙酰胺诱导肝纤维化或者肝硬化，体内樟芝水提物能够有效降低肝损伤。Lee et al.(2005)樟芝菌丝体（0.25mg，100mg/kg，连续84天）二氯化汞处理，SD雄性大鼠，体内 1）可显著降低肝指数GPT，GOT；2）可显著提高抗氧化酵素GSH，GSHPx，GSH/GSSG以及catalase，SOD的活性；3）明显降低总胆固醇以及三酸甘油脂指数Chen et al.(1996)樟芝菌丝体多糖提取物（0.4,0.8g/kg.day） 痤疮丙酸杆菌和脂类多糖处理，雄性ICR 大鼠，体内能够显著降低大鼠血清AST,ALT。Han et al.(2006) 抑制乙肝病毒
17、5种樟芝菌种培养得到的子实体和菌丝体中提取出的多糖体(50g /ml)MS-G2细胞株，体外所有樟芝多糖均显示出较强的抗B型肝炎表面抗原作用，比干扰素1000 单位/ml的作用还强这些多糖体均无细胞毒作用。Lee et al(2002)樟芝子实体分离到的十个化合物（5-50m）HBV，HCC细胞株，体外采用活性追踪的方法分离的一个抗乙肝病毒的连苯类化合物Huang etal（2003）樟芝液体培养基（5-50m）HBV细胞株，体外采用活性追踪的方法分离的一个抗乙肝病毒的化合物Shen etal（2005）抗肝癌樟芝子实体的乙酸乙酯提取物（10-100g /ml）肝癌细胞Hep G2, PLC/
18、PRF/5,体外樟芝的抗癌机制包括1）诱导细胞程序性凋亡2）启动Hep G2肿瘤细胞Fas/Fas ligand 通道3）启动线粒体通道4）调节Bcl-2族蛋白5）抑制NF-kB的活化Hsu et al.(2005)樟芝菌丝体甲醇提取物（10-200g /ml）人体肝癌细胞Hep G2；体外通提升Fas/Fasl来活化caspase-8，-3以抑制肿瘤细胞的增生。Song et al.（2005a）樟芝菌丝体甲醇提取物（10-50g /ml）SD大鼠Hep G2，Hep3B肝癌细胞，体外通过提升caspase-8，-3来抑制肿瘤细胞的增生。Song et al.（2005b）樟芝子实体的乙酸乙
19、酯提取物（30-120g /ml）人类肿瘤细胞Hep 3B，体外通过调节钙离子，钙蛋白依赖通道来抑制肝癌细胞的增生。Kuo et al.(2006)樟芝子实体乙酸乙酯提取物（10-40g /ml）人类肿瘤细胞PLC/PRF/5，体外通过抑制NF-kB的活化来抑制肿瘤细胞的增生。Hsu et al.(2007)固态培养樟芝菌丝体乙醇提取物（100g，200g，400g，800g/ml）人体Hep 3B肝癌细胞，体外半数抑制浓度为574.55g/mlCai et al.(2005)樟芝合并其他抗肿瘤药物人体肝癌细胞，体外 肝癌细胞合并低浓度樟芝与不同作用机制的抗癌药物后，调节肝癌细胞中的抗药性相关
20、蛋白的表现而造成肝癌细胞的抗药性降低，造成药物更易进入肝癌细胞中，因而增加药物累计量，同时也降低了P-gp作用以减少药物排出量，最终使肝癌细胞走向凋亡。同时通过降低MDR表现以促进抗癌药物对细胞的毒杀作用。Huang et al(2006)固态培养樟芝菌丝体（50,100,200mg/ml）Hep 3B肝癌细胞以及，5-FU处理的免疫抑制BALB/c小鼠，体内能够显著提升免疫抑制小鼠的免疫力，能够显著减少老鼠身上的肿瘤大小，显著延长存活时间。Cai et al.(2005)固态培养樟芝菌丝体90%酒精提取物（1g/ml，0.2ml/只.天，每天2次，连续14天）Hep G2肝癌细胞，雌性NOD
21、大鼠，体内肝癌肿瘤小鼠的肿瘤生长缓慢，且肿瘤较小（p0.01），平均肿瘤小鼠的存活率延长70%，能够显著抑制肿瘤细胞的增生。Lin et al.(2008)固态/液态培养樟芝菌丝体提取物人类肝癌细胞C3A和PLC/PRF/5，体外；ICR裸鼠，C3A和PLC/PRF/5，体内樟芝提取物，通过与顺铂，丝裂霉素联用，可显著减少肝癌细胞数量，延长裸鼠存活时间。Chang et al(2008)提高免疫樟芝子实体（40，200,1000mg/kg.bw，1次/天，连续35天）小鼠肝癌H22，C57BL/6小鼠，体内对肝癌H22荷瘤小鼠的抑瘤率达到7424；同时与荷瘤空白对照组及正常空白对照组相比高剂量
22、组荷瘤小鼠腹腔M的吞噬能力、NK 及LAK 细胞的细胞毒活性显著提高(P001)，T细胞转化能力及脾细胞抗体生成能力显著增强(P001)血清IL一2、IL一12及TNF等细胞因子水平显著提高(P001)。中剂量组与低剂量组比较只有NK细胞毒活性有显著提高(P001)中、低剂量组与正常空白对照组及荷瘤空白对照组比较LAK细胞细胞毒活性、T细胞转化能力及血清TNFa水平均有显著提高(P001)。Meng etal.(2005)液态发酵樟芝菌丝体醇沉物（250mg/kg，连续15天）小鼠肝癌H22，SPF级昆明小鼠，体内对小鼠肝癌H22 肿瘤的体内抑制极显著（p001，抑瘤大于70.44%），对脾脏
23、等免疫器官的功能有调节作用，尤其是对自然杀伤细胞的增强作用，效果明显好于化疗药物环磷酰胺。Wang et al.(2010)人体试验樟芝菌丝体胶囊，400mg/粒，每日两粒，持续两周。健康运功员志愿者能够显著提升个体运动后免疫球蛋白浓度，在肝指数上对GPT呈现显著差异，GOT虽有下降但不显著（建议增加每日摄入量）。Qiao et al.(2008)2.6 樟芝的安全性评价在过去的二十年当中，台湾政府投入了大量的人力物力财力对于樟芝的安全性进行了全面地研究，其中由台湾经济部辅助成立的科专计划研究中，总共委托了五个单位（医院或研究单位）进行安全性实验，其结果显示樟芝属于无毒级物质，可以放心使用。这
24、些单位的的研究结果如下：表3 樟芝安全性研究项目野生樟芝固体培养樟芝液体培养樟芝急性毒性（一次喂食）急性（14天）毒性亚急性（28天）毒性慢性（90天）毒性致突变性实验细胞毒性实验基因毒性实验微核实验染色体畸变实验致畸胎测试长期食用历史约百年约七年约八年弘光科技大学与国立中兴大学食品科学系合作，所做的樟芝菌丝体与致突变性研究，发现樟芝水萃取物的使用量在每毫升10毫克时，对S.tyohinumurium的所有菌株均不具备毒性；这些樟芝水萃取物的浓度只要在每毫升0.1至10毫克，就不会产生致突变问题。台北荣民总医院毒物研究室为了了解樟芝的安全性。特别做了樟芝对Sprague-Dawley大白鼠之连
25、续投药口服急性毒性实验，在连续喂食大白鼠二十八天后，记录其体重并予观察组织及器官变化，结果发现体内并无病变，SD大白鼠的体重仍持续增长，血清生化学的变化也与对照组没有差异。因而判定樟芝成品经过冷冻干燥后，对SD大白鼠也无急性毒性。即使加大到饲料的2%，经过90天后，SD大白鼠也无异常情况发生（解剖后无特别病变，血清生化值正常，体重未衰减，亦未造成死亡）。这样的计量如果换算成人类，则每人每天的食物以500克计算，2%等于10克，亦即即使每天吃10克樟芝仍然很安全。在葡萄王委托食品工业发展研究所所做的樟芝发酵液冻干成品之微核及染色体畸变实验中，报告显示。给ICR雄性鼷鼠灌食高剂量樟芝发酵液冻干成品
26、，经过四十八小时后，证实对小鼠之红血球代谢有影响，但不明显。经过处理后再灌食七十二个小时，发现高剂量组与阴性对照组没有明显的差异。再以中国仓鼠为对象，检测喂食樟芝后的肺细胞株（CHL）是否导致染色体变异，结果成阴性反应，可见樟芝发酵液冻干成品并不会导致染色体畸变，相当安全。葡萄王另外委托上海市预防医学研究院，以中国仓鼠成纤维细胞系CHL，做哺乳动物体外细胞染色体畸变实验，发现其结果成阴性反应，证实樟芝不至引起哺乳动物畸形。该研究院也以樟芝菌丝体进行毒性实验，包括三十天亚急毒、九十天亚慢性毒性实验，喂养的樟芝剂量高达每公斤鼠重四千五百毫克，结果无论经过三十天或者九十天，实验组大鼠的生长情况都相当
27、的好，其主要脏器与对照组比起来并不明显差异。不仅如此，进一步分类检查血红素、红细胞、白细胞计数，结果均在正常范围内，血清葡萄糖、胆固醇、肌酐、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、谷丙转氨酶、甘油三脂、尿素氮、白蛋白等生化结果，以及血清中的钙、钠、钾、氯化物检查结果均在正常范围之内，尿常规结果正常，各个实验组之间无明显差异，各组偶有个别阳性发现，但比例相近，大体解剖后以肉眼观察，各个剂量组动物的脏器均未发现明显病变。这些脏器包括：肾上腺、主动脉、脑、胃、肠、食道、心、肾、肝、气管及肺、淋巴结、卵巢（或者睾丸）、胰腺、视神经、垂体、前列腺、脊髓、脾、胸腺、甲状腺、膀胱、子宫和骨髓。其中各组动物的肾上腺、主动脉
28、、肠、食道、淋巴结、胰腺、视神经、垂体、脊髓、胸腺、甲状腺、膀胱、子宫等，无论病理大体检验或者显微镜检查均为发现异常，骨髓图片亦同。其次检查并比较实验组与对照组各动物心肌、气管及肺、胃、肝、脾、脑、睾丸、前列腺、卵巢均为发现显著差异。由此可以证实，大鼠喂予樟芝菌丝体发酵液冻干品，即使长达九十天，亦未发现与实验有关的病理型态改变。这两项在上海进行的实验与台北荣总所作者稍有重复，但由此可以看出樟芝确实相当安全。在高剂量菌丝体的急毒性实验方面，财团法人生物技术开发中心以大白鼠的实验结果证实，即使给予大白鼠高剂量樟芝菌丝体高达每公斤体重三千毫克，连续十四天，大白鼠仍不会因急性毒性而死亡。此一结果可作为
29、人体服用樟芝安全剂量参考。该中心另一项以樟芝发酵原液冻干成品所做的大鼠致畸实验测试结果亦证实，即使给予每天每公斤体重五百毫克的最高剂量，对于大鼠的胚胎发育也不会造成任何不良影响，亦未显示任何致畸可能。而这个剂量为人体建议服用量（每天每公斤体重二十五毫克）的二十倍，可见即使孕妇只要依照此标准服用仍然相当安全。但是由于樟芝的来源不同，安全性并不能一体适用，附表中为汇整不同来源的樟芝安全性报告，可供需要者参考。由于野生樟芝太贵，鲜有人拿来喂老鼠，所以虽然很多人食用，却缺乏科学性报告。樟芝子实体虽然在日据时代即有食用传说，近年来服用者尤众，但缺乏科学之安全性报告。我们曾经以六百三十毫克/公斤剂量之子实
30、体连续喂养大白鼠十四天，并未发现有体重异常或者组织病变等症状。菌丝体方面则比较完整，首先在基因毒性分析方面，采用Ames测试法以实验樟芝菌丝体是否有致突变性。合液（0.5）公克，均呈现阴性反应，显示不具对微生物的致突变性。另外，以中国仓鼠肺细胞株（CHL）检测是否会诱导染色体变异，结果为阴性反应，证明樟芝发酵全液冻干成品亦不会造成染色体之畸变。利用SpragueDawley大白鼠进行活体实验，评估樟芝菌丝体在不同剂量投予下，是否造成急性或者亚急性毒性。以喂食针投予SD大白鼠雌雄各六只樟芝菌丝体悬浮液（3000mg/kg），进行临床观察十四天最后牺牲解剖。实验结果在外观上无任何临床毒性发生，解剖
31、观察器官亦无任何组织病变。在二十八天以胃管连续喂食不同剂量干燥之樟芝菌丝冻干体（2000，200，20mg/kg对照组），结果发现连续喂食二十八天后，均不造成与此测试药物有关之大白鼠死亡，而大白鼠体重仍持续成长，尸体解剖亦无病变，血清生化学之变化与对照组并无差异性。因此判定冷冻干燥樟芝菌丝体在活体测试下，对SD大白鼠无急性毒性发生。在亚急毒性实验，将冷冻干燥之樟芝成品混在饲料由（2%，1%，0.5%及对照组）连续喂食SD大白鼠九十天后，发现并无差异，尸体解剖无特别之病变，血清生化学变化亦与对照组无异，因而判定此经冷冻干燥之樟芝成品在九十天连续喂食后，无亚急性毒性影响。另外林文鑫等以喂食针喂食S
32、D怀孕雌鼠樟芝冻干成品，以评估对胚胎之影响及造成畸胎之可能。将交配成功之SD雌鼠分为四组，于怀孕第六天至第十五天，各组之剂量分别为50、150、或500毫克/公斤/天。结果显示实验期间，各剂量组并无任何临床表现，第二十天实验终结，怀孕鼠以帝王切开术进行解剖，肉眼观察各脏器管并未发现任何病变，各剂量组与对照组怀孕雌鼠之子宫重量、生育能力指数、受精卵着床流失率、着床后死亡率及胎鼠平均体重均无差异。胎鼠之外观、内脏及骨骼检查结果并未发现任何畸胎现象。3 樟芝的人工培养3.1 人工栽培自然界樟芝是一种仅寄生在牛樟树上的珍贵药用真菌。适合牛樟树生长的地区有限，自然界牛樟树存数不多且为台湾政府的保护植物，
33、因此樟芝数量极少，况且樟芝生长缓慢，导致樟芝资源严重短缺，无法满足社会需求，所以至今尚无法大规模生产。3.2 人工培养目前由于樟芝的子实体无法进行大量栽培，而且其生长周期长不适宜工业化生产，目前多数利用生物技术以固体复合栽培结合代谢调控技术进行培养。通过功能性评估，发现其效果接近野生子实体，而且售价较低，是目前较为经济、符合环保要求的人工培育法。该法采用太空包进行樟芝固体培养，改变太空包内的培养基，作为樟芝菌丝体固体培养的生产模式，培养出固态樟芝菌丝体，然后移出太空包，使菌丝体暴露于空气中栽培，形成类子实体。该方法速度较快，而且能刺激具有药用价值的代谢产物如多糖的产生，但是人工栽培面临不能去除
34、木屑及其他不可食用部分，不能获得樟芝子实体，易污染，周期长等问题。樟芝的液体发酵培养是指采用液体培养基对樟芝菌丝进行发酵培养以大量生产菌丝体。深层液体培养极大缩短了培养周期，不受地理、时间的限制，且可能达到野生樟芝所具有的多项生理活性及有效成分。通过优化培养工艺改变真菌代谢途径，还可使活性物质含量达到甚至超过野生樟芝子实体，因此该方法是大规模工业化生产、利用樟芝造福人类的最经济，最有效，最环保的方法。已有学者对樟芝的液体培养进行了研究，关于樟芝液体培养的生物量及其活性物质产量的文献报道结果见表4。由表4可以看出，目前对于樟芝液体培养的研究主要致力于提高樟芝生物量，而以樟芝活性物质为目标的优化研
35、究却不多。仅有的几项研究也是针对樟芝多糖，而对发酵法生产樟芝三萜的研究极少，因此展开这方面的针对性研究显得非常的有必要。另外，不同樟芝菌株液体深层培养获得的生物量、多糖和三萜的产量相差较大，说明不同菌株和不同培养条件对樟芝代谢产物的生成影响较大。表4文献报道的樟芝液体培养的生物量以及胞外多糖、胞内多糖和三萜的产量发酵规模菌株编号生物量（g/L）胞外多糖（g/L）胞内多糖（g/L）胞内三萜（mg/g）文献5000L发酵罐BCRC3539627.101.200.7074.74Chen etal(2009)700L发酵罐AC062320.00-63.00Chen etal(2009)5L发酵罐AC0
36、62323.00-30.0045500 mL摇瓶B852.88-Deng etal(2009)250 mL摇瓶BCRC3539621.64-Liu etal(2007)250 mL摇瓶BCRC353968.870.15Chen etal(2007)250 mL摇瓶BCRC353962.600.49Shen etal(2004)250 mL摇瓶BCRC353968.701.36Shen etal（2004）250 mL摇瓶BCRC3671612.521.860.4331.00Shen etal（2007）250 mL摇瓶A210Shen etal（2003）250 mL摇瓶未注明-28.91So
37、ng etal（2002）4 现在已经开发的产品目前，台湾和日本均有樟芝产品上市。台湾葡萄王企业成功地采用搅拌通气式发酵罐(槽)大量生产樟芝菌丝体，并进行热水萃取、固液分离，然后减压浓缩、冷冻干燥，获得高纯度樟芝菌丝体冻干粉末，经包装、灭菌，得到菌丝体提取物成品，产品已于2000年l1月上市。辅英科技大学和科景生物科技公司宣布已研制成功牛樟芝结合透明质酸-玻尿酸的保健新产品。在国内，由于台湾和大陆地区两岸隔阂，加上台湾政府不允许樟芝物种外流，目前内地对于樟芝的研究、开发和利用尚处于起步阶段，除了少数一些研究报告之外至今尚未见规模化生产利用的报道。三、亟待解决的几个问题以及本项目的创新性：综上所
38、述，樟芝作为一种食用安全，效果显著，在民间具有一定应用历史的珍稀药用真菌，具有很好的开发应用前景。在过去的二十年里各界投入大量的人力、物力、财力对其进行研究，积累了大量的资料，但是由于樟芝作为新种于1990年才发表，所以至今为止依旧有很多问题悬而未决：1）目前台湾规模化生产樟芝的方法普遍十分粗放，而针对樟芝的某个或者某类有效成分，尤其是三萜类化合物的规模化生产的研究更是少之又少。2）虽然从樟芝中分离到七十多个单体化合物，其中不乏樟芝独有的，生物活性显著的新化合物，但是对于这些单体化合物的药理学，构效关系的研究却很少，目前的动物药理学实验则普遍采用樟芝提取物，从而制约了樟芝的相关的医药产品的开发
39、。3）对于人工培育樟芝和野生樟芝之间的差别的研究很少，造成市面上樟芝产品龙蛇混杂，真假难辨。4）樟芝为台湾地区著名的药用真菌，已经受到台湾学术界和消费市场的广泛关注，但是目前内地对樟芝的研究很少，加上两岸长期隔阂，台湾政府不允许樟芝物种外流，大大限制了其在国内的的开发利用。5）受台湾地区医药监管法规的限制，樟芝在台湾地区只能够作为膳食补充剂在市场上销售，因此其市场认可度大大的被削弱。而相反的，樟芝在国内开发成药品，尤其是护肝类药品的可能性却大大存在，市场前景巨大。本项目采用单因子实验和均匀设计的方法筛选和优化发酵条件，以得到适合三萜、多糖积累的最优条件，并在最优条件下对相应的参数进行考察和补料
40、的研究。通过筛选培养基种类，优化优化培养的组成以及发酵工艺条件，可使生物量增加，活性物质的含量（多糖、总三萜）达到甚至超过野生樟芝子实体。项目具有自主知识产权，实验结果整体达到了国际先进水平，填补了国内市场空白。四、项目的主要方案以及实施进度4.1 项目总体方案本项目主要按以下细化方案进行：（1）樟芝菌种的诱导，筛选；（1）樟芝菌丝体的发酵条件研究：以樟芝总三萜的含量为主要目标，同时兼顾菌体体产量，多糖含量，筛选培养及的种类和优化培养基的组成；（2）发酵工艺的研究：在前期实验基础上，通过小试，中试研究建立樟芝深层发酵工艺，实现规模花的生产；（3）樟芝活性物质分离提取工艺的研究；（4）樟芝活性成
41、分的活性评价和作用机制研究；（5）基于樟芝活性成分的产品开发研究，如保健品，药物及其他日化产品。4.2 项目安排，拟解决的关键技术和采用的技术路线及流程初期：通过单因子结合均匀实验设计法, 以樟芝菌丝体产量和活性物质含量确定樟芝菌丝体发酵的最优条件。后期：在前期实验获得的工艺参数基础之上,通过小试和中试确定樟芝菌丝体进行工业化生产的最优工艺条件并最终实现樟芝菌丝发酵生产的工业化。拟采用的技术路线及流程如下：（1） 引进，诱导并且筛选菌种；（2 ）发酵培养：2.1 通过文献调研和预实验，采用种子培养 一级种子培养 深层液体发酵的技术路线来摸索樟芝的培养条件和基础培养基；2.2 以基础培养为对照，
42、首先筛选出合适的培养基种类，然后采用均匀设计法进行培养基组成的优化，获得产生三萜丰富的最优发酵条件；2.3在前期试验得到的工艺参数条件基础上，通过小试和中试确定樟芝菌丝体进行工业化生产的最优条件；2.4在小试和中试的实验过程中同时需要对提取工艺和活性评价进行研究，确定提取的最适合条件以及出具樟芝所具有的活性。五、实施进度2009.1-2009.8 樟芝液体基础培养培养条件的确立。拟确定发酵周期，pH值等条件（已完成）；2009.8-2010.4 樟芝液体培养基种类的筛选。拟筛选出既能提高三萜又能增加生物量的相应的碳源，氮源，无机盐，生长因子等（已完成）；2010.4-2010.10 樟芝液体培
43、养选定培养基种类的浓度范围确定（已完成）；2010.10-2011.4 樟芝液体培养培养基组成的优化，拟优化出合适的发酵培养基组成 (已完成)；2011.4-2012.3 樟芝液体培养小试工艺条件的考察及优化和产物提取工艺的研究，明确各种因素的影响，确定最优的发酵工艺(已完成)；2012.3-2012.7 樟芝液体发酵中试工艺条件的考察及优化，明确扩大后的最优发酵工艺，申请国家发明专利1-2项（已完成）；2012.7- 发酵工艺的放大试生产，樟芝菌丝体试生产、销售；2012.7- 展开樟芝的相关药品临床前研究。六、项目的市场情况、收益以及风险分析6.1 市场情况分析在项目实施之前，我们选取了市
44、场极为成熟的台湾地区进行了相应的调查，结果显示：台湾地区目前的人口约为2000万，根据台湾地区相关行业部门统计：台湾地区目前樟芝及其相关产业的年产值约为100亿新台币（约合20亿人民币），年利润超过20亿新台币（约合4亿人民币），台湾地区主营樟芝及其相关产品的企业共有二十多家，培养方法包括椴木培养，固态发酵，液态发酵；其产品涉及野生樟芝子实体切片，樟芝提取物，樟芝保健品（包括提高免疫，护肝解酒等），普通食品以及日化用品等（见表5）。相比台湾市场，内地市场则显得更加巨大且尚处于起步阶段，通过调查我们发现：虽然国内有少量的樟芝产品，提取物销售，但基本上都是从台湾进口的。随着台湾逐渐对于内地居民开放
45、自由行，越来越多的内地消费者会接触并且认识樟芝，内地的樟芝市场会变得越来越炙手可热。表5 台湾樟芝主要生产企业 单位：新台币公司名称产品价格研发类型泰宗生物科技股份有限公司樟芝菌丝体复方液态发酵樟芝复方润喉糖-樟芝糖咏翔生物科技有限公司带樟芝椴木买卖，植菌代工及相关服务椴木培养伯温生技樟芝胶囊（60，120粒）定价2500元；4500元会员价1500元；2500元固态发酵台湾柏荣实业有限公司安健牌樟芝胶囊（60粒）定价2600元；特价2500元椴木培养冷冻椴木牛樟芝大片1两-栽培2年以上定价9000元；特价8000元冷冻椴木牛樟芝中片1两-栽培2年以上定价8000元特价7600元干燥子实体大片
46、（大盒装）-栽培2年以上）定价8000元特价7400元干燥子实体中片-栽培一年半以上定价4200元特价3900元善达生技有限公司野生樟芝子实体人工复育欣健生物科技股份有限公司欣健-御礼红樟芝固体发酵FKS汎可士企业有限公司樟芝胶囊（69粒）4980元椴木培养精锐560樟芝胶囊-超级八倍浓缩315000元樟芝糖（18粒，60粒）99元；299元野生樟芝子实体6600元长青宝生技樟芝胶囊固态发酵葡萄王生技樟芝胶囊（100粒）1820元液态发酵葡萄王-葡众生技樟芝液（180ml*24支/箱）5040元液态发酵发酵液亚新生物科技有限公司樟芝胶囊（60；100粒）椴木培养樟芝养生礼盒（口服液+养生茶）樟芝养生茶（15