《干热河谷地区几种豆科植物根瘤菌纯培养及生理生化的初步研究论文.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《干热河谷地区几种豆科植物根瘤菌纯培养及生理生化的初步研究论文.doc（37页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、西南林业大学本科毕业（设计）论文（2010届）题 目:干热河谷地区几种豆科植物根瘤菌纯培养及生理生化的初步研究Preliminary study of several legume rhizobia purification and physiological and biochemical characteristics in dry-hot valley 教学院系: 保护生物学学院 专 业: 植物保护06级 学生姓名: 代志浩 指导教师: 张东华（讲师） 评 阅 人: 刘丽（实验师） 2010年 6 月 8日 干热河谷地区几种豆科植物根瘤菌纯培养及生理生化的初步研究代志浩（西南林业大学 保
2、护生物学学院 昆明 650224）摘要: 本试验对采自云南元谋和元江干热河谷地区的10种豆科植物根瘤样品进行了分离纯化培养，共纯化出34株菌，其中具有根瘤菌特征的的有4个菌株，对其进行耐酸碱性、耐盐性、生长温度范围3种生理生化的初步分析测定，所测4个菌株均表现出耐酸碱性和耐盐性的性状，在短时间的低温和高温下处理后，仍能保持活性，表现出良好的生长势。并对分离出来的10株革兰氏阴性菌进行回接实验，选择沙土、蛭石、营养液等不同的培养载体，并选择台湾相思作为回接豆科植物，以确定供试豆科植物与所分离培养菌种之间的共生结瘤关系、获得并保存高效优良的根瘤菌菌株。关键词: 干热河谷 根瘤菌 分离纯化 回接试验
3、 生理生化Preliminary study of several legume rhizobia purification and physiological and biochemical characteristics in dry-hot valleyDai Zhihao(Faculty of conservation biology ,Southwest Forestry University, Kunming,650224)Abstract: This study taken ten kinds of legume rhizobia for purified culture fro
4、m theYuanmou and Yuanjiang dry-hot valley, and 34 strains were purified, which has the characteristics of Rhizobia strains,4. Determined by the preliminary analysis, 4 strains showed acid and salt tolerance traits, in short low and high temperature treatment, remain active and showing good growth po
5、tential. On the isolated 10 strains of Gram-negative bacteria to-back experiments, selected the sand, vermiculite and nutrient solution such as different training vectors, and select Acacia legumes as back then, to determine the tested legumes and The strains were isolated and cultured relations bet
6、ween the symbiotic nodulation, acquire and save the high quality of the Rhizobium stra.Key words: dry-hot valley, rhizobium, purification, inoculating test, physiological and biochemical.目录1 研究背景11.1 干热河谷概况11.2 生物固氮11.3 豆科植物的根瘤菌21.4 干热河谷根瘤菌国内外研究进展31.4.1 根瘤菌耐旱性研究进展31.4.2 温度对根瘤菌的影响研究进展41.5 该实验的目的意义52
7、材料62.1 实验试剂及药品62.2 实验仪器62.3 实验材料63 研究区域概况及研究方法83.1 研究区域概况83.2 样品采集93.3 菌株的分离纯化与保存123.3.1 根瘤的表面消毒123.3.2 根瘤菌的分离纯化123.3.3 革兰氏染色143.3.4 菌种的保存143.4 菌株的回接结瘤试验153.4.1 种子催芽153.4.2 回接无氮营养液153.4.3 培养载体准备153.4.4 接种及培养条件163.5 生理生化试验163.5.1 根瘤菌耐酸碱性测定163.5.2 根瘤菌耐盐性测定173.5.3 根瘤菌生长温度范围测定174 结果184.1 所采集的豆科植物根瘤菌分离纯化
8、184.2 根瘤菌耐酸碱性测定214.3 根瘤菌耐盐性测定214.4 根瘤菌生长温度范围测定224.5 回接接瘤225 结论与讨论235.1 所采集的豆科植物根瘤菌分离纯化235.2 根瘤菌耐酸碱性测定235.3 根瘤菌耐盐性测定235.4 根瘤菌生长温度范围测定245.5 回接试验24参考文献25指导教师简介28致谢29附录30研究背景1 研究背景1.1 干热河谷概况干热河谷包括干旱和半干旱、热带和亚热带的河谷，是河流流域地形深陷封闭、气候炎热干燥生境条件下的特殊河谷盆地，是横断山脉地区最突出的自然景观之一，干热是其特点，主要分布在横断山脉地区金沙江、怒江、澜沧江、元江、雅砻江、岷江、大渡河
9、、安宁河等及其支流的河的部分地段，垂直幅度2001 000m,干旱河谷总长4 105km，总面积11 230km1.干热河谷是干旱河谷的一种亚类型，只分布在怒江海拔1200m 以下、元江海拔 1 000m1 400m 以下、澜沧江海拔1 000m 以下不间断河谷、金沙江800m1 200m 以下河谷、另外在南盘江局部地域1 000m 以下的河谷，这些地区主要包括攀枝花的部分地区、元谋、东川、巧家、怒江、元江、红河、开远等1.2。干热河谷地区年平均降水 17.5 ,最冷月日平均温度 10 ，全年积温6 000 , 10 天数 30d ,月均最低温 0 ,全年平均气候干燥度1.53；干旱河谷现存植
10、被均为耐旱乔木、灌丛、草丛,一些地段已呈半荒漠化景观,大部分地段盖度大多在2030 % ,个别植被较好的地段可达60 % ,群落层次结构单一,所有种类基本上都是阳性的,呈现多毛、具刺、叶小、质厚、低矮或匍匐生长等典型旱生植被特征。除在横断山区南段的一些干热河谷有一些耐旱乔木如木棉等零星分布外,随着积温等的逐渐降低,北段河谷只有落叶低矮小灌丛、草丛分布。土壤类型有燥红土、褐红壤、赤红壤、紫色土等,有典型的干热生物气候特征。1.2 生物固氮空气中约 80%的氮气不能被植物直接利用, 而有一些生物能够直接吸收空气中的氮素作为养料，它们将分子态氮先还原成氨，再转化为氨基酸和蛋白质，这就叫生物固氮。当今
11、由生物固定的氮已达2.0 亿t/a , 占地表化合态氮的65%70% ,而根瘤菌豆科植物共生体固定的氮又占生物固氮量的65% 。生物固氮是自然生态系统中氮的主要来源，全球生物固氮的量是巨大的，海洋生态系统每年生物固氮量在4101321014 g，陆地生态系统生物固氮量在910131.31014 g，而工业固氮量在20 世纪90 年代中期每年约为1.41014 g。可见，生物固氮在农、林业生产和氮素生态系统平衡中的作用很大。我国农民利用豆科植物固氮肥田历史悠长，直至现在仍保留着豆科植物和非豆科植物轮作、套作和间作等耕作制度。国外也十分重视固氮生物在农业中的作用4.5,豆科植物等，其根部长有许多小
12、球，它是由根瘤菌共生形成的根瘤，就具有固氮作用,根瘤菌豆科植物共生固氮体系是自然界固氮效率很高的一个体系，该体系广泛分布于地面各处。据估计，其年固氮量约占各种生物固氮体系总量的50%，大大超过世界化工合成氨产量的总和(约4000 万吨)，成为农业生产的主要氮源6。又如稻田中的水生蕨类植物满江红(俗称红萍)，由于叶腔中有固氮鱼腥藻共生而能吸收和利用大气中的氮；以上两种形式称为共生生物固氮.生物固氮的形式除共生生物固氮外，还有细菌自生固氮联合固氮.联合固氮（又称为半共生固氮） 它又分为内生联合固氮和外部联合固氮. 目前已发现有固氮能力的微生物有60 多属约数百种，包括细菌、放线菌、蓝绿藻等。1.3
13、 豆科植物的根瘤菌根瘤菌 (rhizobia)是一类能与豆科植物共生，形成根瘤并固定空气中的氮气，为植物生长提供氮素营养的革兰氏阴性细菌7。1888 年，荷兰学者Beijerinck 从豆科植物根瘤中分离出固氮细菌，命名为根瘤菌。1895 年Nobbe 和Hiltner 将根瘤菌接种剂第一次用于试验室，并在英美申请豆科植物接种剂专利。从此，各国科学家对生物固氮产生了浓厚的兴趣，并进行了大量的研究。经过不断的探索与实践，豆科植物固氮已在生产实践中取得了很大的成功。目前已知能够与豆科植物结瘤的细菌约40个种，均为革兰氏阴性细菌,属于细菌域( Bacteria) 、变形杆菌门( Proteobact
14、eria)8。自从Deley于1978年首次采用根瘤菌分类系统分类方法以来，特别是自根瘤菌多相分类系统被广泛应用以来，随着大规模资源调查的展开，到目前为止,已发表的根瘤菌已由原来1984年的2属4种增加到2004年的9属43种9、10。1.4 干热河谷根瘤菌国内外研究进展自1888年，荷兰学者Beijerinck MW从豌豆根瘤中第一次成功分离出根瘤菌菌，并将其命名为Bacillus radicicda。1989年建议将可在豆科植物上结瘤的细菌属改名为根瘤菌属（Rhizobium），并沿用至今。至1984年新属不断建立，发展到7属36种。90年代后，新的根瘤菌属种不断被发现。近年来，随着16S
15、rRNA序列分析技术的应用，使根瘤菌系统发育的研究有了重大突破。随着分子生物技术的发展，传统的根瘤菌分类已经被以系统发育为主的多相分类所取代。目前，根瘤菌新属新种不断涌现，已确立的有12属，51种。我国在20世纪50年代使用大豆根瘤开始了生物固氮在农业生产中的应用，至80年代，我国一方面从分子水平进一步研究根瘤菌在豆科植物的固氮机理，一方面通过人工诱发非豆科植物根部根瘤，试图使非豆科植物也能共生固氮。其中相继对水稻、小麦、玉米和高粱等作物的联合固氮进行深入研究，并成功分离出一批具有高效固氮功能的联合菌株。同其他生物一样,根瘤菌的生存及其共生固氮过程往往受到外界不良环境条件的影响,而土壤的干旱和
16、高盐是重要的限制因子11。近年来,不少学者对根瘤菌抗旱性及其机制进行了研究,初步了解了根瘤菌的抗旱机制,并分离出与耐旱性有关的调节基因,从而构建出相应的具有抗性的细菌和植物,为根瘤菌的进一步研究提供了理论依据,也为利用该类微生物在干热河谷等受干热高温条件影响的地区植被状况改善,及农业生产能力提高提供新的方法1.4.1 根瘤菌耐旱性研究进展干旱是干热河谷的主要特征之一，也是根瘤菌豆科植物共生结瘤固氮的限制因素。在干燥土壤中，由于缺少正常根毛，而使感染受到限制。缺水导致固氮作用钝化，失水如果不超过根瘤鲜重的20%，浇水后活性可以恢复。如失水更多，就会导致根瘤构造的永久性损伤根瘤脱落12。当土壤水分
17、从5.5%下降到3.5%时，会明显的减少根毛侵染线的形成并完全限制根瘤的形成13。不同品系的根瘤菌，对高温和干旱的反应不同。Shoushtari 和Pepper 14发现分离自沙漠中的Prosopis(牧豆树属)根瘤菌可以在沙漠土壤中存活一个月。水分胁迫对紫苜蓿M. sativa 15、落花生 (Arachis hypogaea)16、扭曲山蚂蝗（Cyamopsis tetragonoloba）17和一些热带豆科植物瓜尔豆（Desmodium intortum )18的共生固氮影响很小。绿豆（Vigna radiata）19和白花三叶草（Trifolium repens ）20在干旱胁迫下产生
18、了基因型变异，来适应干旱的条件。黄明勇等21对花生根瘤菌的抗旱性研究发现，花生根瘤菌在不同的土壤水分条件下其存活数量不同，且所研究的花生根瘤菌中存在其抗旱性较强的菌株。曾小红等22研究干热河谷根瘤菌的耐干热性，发现分离自干热河谷的根瘤菌均具有较好的耐高温抗干旱的特性。关桂兰23等对新疆干旱地区根瘤菌资源研究发现，新疆地区根瘤菌的生长繁殖及对寄主植物侵染结瘤和固氮作用明显不同于其他的生态区，它不仅能在干旱、高温、盐碱等不利条件下很好的生长繁殖，而且还能侵染寄主并使之结瘤固氮，表现出对环境的良好适应性。可以看出，根瘤菌的这种对干热环境出现出来的不同反应，不仅与其本身对干热条件的耐受力和寄主的抗干热
19、能力有关，也与生活环境有关，是一种协同进化。1.4.2 温度对根瘤菌的影响研究进展温度的高低是影响一切生物生长发育的因素之一，同样温度也是影响根瘤菌生长发育的限制因素之一。一般认为，根瘤菌的最适生长温度为2530，但也一些根瘤菌表现出耐热和耐低温的多样性。张慧等24从广西分离的相思树根瘤菌菌株中，有3个耐高温的菌株，表明在相思树根瘤菌中普遍存在着耐高温菌株。黄宝灵等研究了15个分离自不同生态环境的相思树种根瘤菌菌株对温度的耐受性，结果表明，相思树种的根瘤菌能在高温（39）下生长良好的菌株S09号。万晓红等25对陕西杨陵某试验田的22个紫花苜蓿品种的新鲜根瘤分离纯化后得到的52株根瘤菌株进行了耐
20、低温耐高温的研究报道，发现供试菌株在低温4时停止生长，在高温40时均能生长，50时均停住生长，60处理10min后在28培养，所有菌株正常生长，根瘤菌株能瞬间耐高温。李兴芳26等在对相思根瘤菌的抗逆性初步研究中，把21株相思根瘤菌和2 株大豆根瘤菌菌株直接置于气温为8、28、37、43的环境下培养生长和在55下处理20min和65下处理10min后在适宜条件下培养生长27，发现全部能在37条件下生长，经55下处理20min在28条件下培养生长，快生大豆根瘤菌USDA205和8株相思根瘤菌能够较好的生长，有4株微弱生长；经65下处理10min后有快生大豆根瘤菌USDA205和5株相思根瘤菌能够生
21、长，说明有的菌株耐热性较高28。但谷俊等29发现中国北方地区甘草根瘤菌对低温（4）具有很强的耐受性。而关桂兰等研究表明，在高温、干旱地区根瘤菌的生长繁殖以及寄主植物侵染和结瘤固氮作用均有别于一般生态地区，而且还表现出与干旱地区相适应的耐高温耐盐的特点23和温度对干旱地区豆科植物根瘤的形成和固氮活性不是限制性因子28。因此在干热河谷地区也应该存在适应该地区的恶劣环境的耐高温干旱的根瘤菌资源，这也是干旱地区植物对干旱环境适应的表现。1.5 该实验的目的意义本试验对采自云南干热河谷地区（元江和元谋）的部份豆科植物根瘤菌进行分离纯化，生理生化特性分析和回接结瘤试验，以系统获得该地区根瘤菌的耐盐性、抗性
22、等主要生理生化指标的特性；同时通过回接结瘤试验，以确定供试豆科植物与所分离培养菌种之间的共生结瘤关系、获得并保存高效优良的根瘤菌菌株，为干热河谷地区可持续发展农、林、牧业提供相关的理论基础.32 材料2 材料2.1 实验试剂及药品升汞（1%）、丙三醇、甘露醇、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、无水硫酸镁、氯化钠、酵母粉、琼脂粉 、氢氧化钠、盐酸 、PH试纸（1-14）、结晶紫、碘液、番红染液、乙醇（75%）2.2 实验仪器电子天平（0.0001g，0.001g）、高压灭菌锅、电热恒温培养箱、光照培养箱、超低温冰箱、4冰箱、摇床、光学显微镜、超净工作台、移液枪2.3 实验材料本次试验共采用所采集样品中的1
23、0种豆科植物根瘤作为材料，其中元谋5种（见表2-1），元江5种（见表2-2）表2-1元谋采集试验用样品一览表编号时间地 点海拔（m）温度（）湿度(%)生 境宿 主根瘤特征M120099.16元谋县能禹镇凤仪村N25969617E1018504110864030河滩沙石地中，与芝麻混种，光照强度高，土壤水分含量低兵豆Lens culinaris Medic.近球形黄色M320099.17元谋县牛街村N2576342E1018476510783431公路边大豆田中，光照充足，土壤为砖红壤，水分含量高，周围为番茄田大豆Glycine max (L.) Merr.球形M420099.17元谋县黄瓜园镇
24、河西村N2576203E1018330310603847河滩沙地上，水分含量高，光照充足，周围生长有桉树、竹子响铃豆Crotalaria albida Heyne不规则M620099.17元谋县黄瓜园镇河西村N2576216E1018331110603448河滩沙地上，水分含量高，光照充足，周围生长有桉树、竹子小叶三点金Desmodium microphyllum (Thunb.) DC球形黄色续表2-1编号时间地点海拔（m）温度（）湿度（%）生 境宿 主根瘤特征M820099.18元谋县元马镇沙地村后山N2569673E1018739610923255小山丘上的夹杂有按树，竹子的银合欢林中，
25、光照丰富，土壤为红壤，林中有小水沟银合欢Leucaena glauca(L.)Benth.球形黑色表2-2元江采集试验用样品一览表编号时 间地 点海拔（m）温度（）湿度(%)生 境宿 主根瘤特点J1200910.21元江县新村N235914E10199173922770农田边草丛银合欢Leucaenaglauca(L.) Benth.梭形褐色J4200910.21元江县黄秧数村N2358318E101983453873150茉莉花地边，光照强度大，土壤为黄壤，水分含量低山蚂蝗属Desmodium Desv椭圆形褐色J6200910.21元江县那整村N2358991E10199180405413
26、0公路边的草丛中，光照强，土壤为沙石土，水分少响铃豆Crotalaria albida Heyne球形黄色J8200910.22元江县元江河边N2360450E102004383883846桂圆林下，光照丰富，紫色土壤，水分含量大花生ArachisHypogaea linn.球形褐色J14200910.22元江县元江河边N2360992E102001733822070河边沙滩上，光照强，土壤沙质，周围为芦苇丛兵豆Lens culinaris Medic.球形黄色研究方法3 研究区域概况及研究方法3.1 研究区域概况元谋位于云南中北部，东经1013510206,北纬25232606之间。东倚武定
27、，南接禄丰，西邻大姚，北连四川会理；西南与牟定接壤，西北与永仁毗邻。最大纵距82公里、横距42公里，总面积202169平方公里。其中，坝区面积占55.7，山区占44.3，海拔1087米，。元谋盆地是金沙江干热河谷的典型代表，年平均降雨量6137 mm，90 以上的降雨量集中在雨季(51O月份)，年均蒸发量3 4263 mm，年均相对湿度54 ，无霜期35036530 属南亚热带干燥气候，年平均气温21.5，素有“天然温室”之称。 元谋干热河谷区水土流失严重,土壤肥力低,生态环境脆弱,近代不合理的开发利用使本区成为土壤退化严重的地区之一。豆科牧草和灌木是元谋干热河谷的主要自然覆盖植被。豆科牧草具
28、有保持水土,改善土壤结构,增进土壤肥力等作用，对元谋干热河谷植被恢复具有重要作用。元江干热河谷(23002500E, 1003010330N)是中国西南最典型的干热河谷，位于云南高原的中南部,西北至东南走向,河谷深陷,其西南一侧有与大江平行而高大的哀牢山和无量山脉. 主要包括云南省的元江、红河、石屏等12个县市,其中最典型的是元江坝的干热河谷31.32 。 高大山脉的屏障作用阻挡了来自孟加拉湾的西南暖湿气流,在河谷底部形成“焚风效应”. 同时,河谷地形比较闭塞,降雨稀少,晴天较多,太阳辐射强度大,河谷底部受热剧烈,散热不易,造成了河谷区干燥、闷热的气候特征32. 另一方面,由于河谷各地的小环境
29、,如土壤、地形以及人为干扰程度不尽相同,河谷区气候条件的局部差异较大,不同坡向、坡度的降雨量和气温存在较大差别.元江干热河谷区的年平均温度2317 ,最冷月平均气温1617 ,最热月平均气2816 , 10 年积温达8 708. 9;干湿季节分明,干季为11月翌年4月,雨季为5月10月;年平均降水80511 mm,其中81%的降雨集中在雨季33.34.3.2 样品采集2009.9.152009.9.18赴元谋干热河谷地区采集，2009.10.202009.10.23赴元江干热河谷地区采集豆科树种根瘤样品。在两地共采集到22份根瘤样品，其中元谋8种（见表3-1）、元江14种（见表3-2）。采集方
30、法如下：用铁铲刨取豆科植物根系（主根或侧根），用枝剪将生长着的根瘤菌剪下，如根瘤紧贴主根生长时，用尖刀将根瘤连同主根组织一起挖下（见附图I）。小心地解开缠绕的部分，同时用纯净水洗去粘在根系上砂粒或土粒，注意不要扭伤根，将根瘤装入充满甘油（50%）的试管中，封口编号。并记录采集时间、地点、生态植被、土壤类型、水分条件等情况。带回实验室后于4冰箱保存待用。表3-1元谋采集样品一览表编号时 间地 点海拔（m）温度（）湿度(%)生 境宿 主根瘤特征M1 20099.16元谋县能禹镇凤仪村N25969617E1018504110864030河滩沙石地中，与芝麻混种，光照强度高，土壤水分含量大兵豆Lens
31、culinaris Medic.近球形黄色M3 20099.17元谋县牛街村N2576342E1018476510783431公路边大豆田中，光照充足，土壤为砖红壤，水分含量高，周围为番茄田大豆Glycine ax(Linn.)Merr球形M4 20099.17元谋县黄瓜园镇河西村 N2576203E1018330310603847河滩沙地上，水分含量高，光照充足，周围生长有桉树。竹子响铃豆Crotalaria albidaHeyne不规则M5 20099.17元谋县黄瓜园镇河西村N2576216E1018331110623548河边小山坡的草甸上，光照充足，土壤水分含量低山蚂蝗属Desmod
32、ium Desv球形黑色M6 20099.17元谋县黄瓜园镇河西村N2576216E1018331110603448河滩沙地上，水分含量高，光照充足，周围生长有桉树。竹子小叶三点金Desmodium microphyllum(Thunb.) DC球形黄色M7-120099.17元谋县黄瓜园镇河西村N2576216E1018331110603847河滩沙地上，水分含量高，光照充足，周围生长有桉树。竹子银合欢Leucaena glauca(L.) Benth.球形黑色续表3-1编号时间地点海拔（m）温度（）湿度（%）生 境宿主根瘤特征M7-220099.17元谋县黄瓜园镇河西村N2576216E1
33、018331110603847河滩沙地上，水分含量高，光照充足，周围生长有桉树。竹子金合欢Acacia farnesiana (Linn.)Willd球形M820099.18元谋县元马镇沙地村后山N2569673E1018739610923255小山丘上的夹杂有按树，竹子的银合欢林中，光照丰富，土壤为红壤，林中有小水沟银合欢Leucaena glauca(L.) Benth.球形黑色表3-2元江采集样品一览表编号时间地 点海拔（m）温度（）湿度(%)生 境宿 主根瘤特征J1200910.21元江县新村N235914E10199173922770农田边草丛银合欢Leucaena glauca(L
34、.) Benth.梭形褐色J2200910.21元江县新村N235914E10199173922770农田边草丛中未鉴定出球形J3200910.21元江县新村N235914E10199173922765农田边草丛中，与银合欢混生未鉴定出球形黄色J4200910.21元江县黄秧数村N2358318E101983453873150茉莉花地边，光照强度大，土壤为黄壤，水分含量低山蚂蝗属Desmodium Desv球形或椭圆形褐色J5200910.21元江县黄秧树村N2358061E101983634003450豆田中，光照强度高，土壤水分含量大未鉴定出球形黄色J6200910.21元江县那整村N23
35、58991E101991804054130公路边的草丛中，光照强，土壤为沙石土，水分少响铃豆Crotalaria albida Heyne球形黄色J7200910.21元江县那整村N2356864E101979924373541农家菜园中，光照强，土壤沙质水分含量大树豆Cajanus cajan球形黄色续表3-2编号时间地点海拔（m）温度（）湿度（%）生 境宿 主根瘤特征J8200910.22元江县元江河边N2360450E102004383883846桂圆林下，光照丰富，紫色土壤，水分含量大花生ArachisHypogaea Linn.球形褐色J9200910.22元江县元江河边N23697
36、42E102004313884135河滩草丛中，光照强，土壤为沙石土，水分高未鉴定出球形J10200910.22元江县元江河边N2369742E102004313884135河滩草丛中，光照强，土壤为沙石土，水分高未鉴定出球形J11200910.22元江县元江河边N2369742E102004313884135河滩草丛中，光照强，土壤为沙石土，水分高未鉴定出球形J12200910.22元江县元江河边N2369742E102004313883940河滩草丛中，光照强，土壤为沙石土，水分高未鉴定出球形黄色J13200910.22元江县元江河边N2360992E102001733822070河边沙滩
37、上，光照强，土壤沙质，周围为芦苇丛大豆Glycine max (L.) Merr.球形J14200910.22元江县元江河边N2360992E102001733822070河边沙滩上，光照强，土壤沙质，周围为芦苇丛兵豆Lensculinaris Medic.球形黄色3.3 菌株的分离纯化与保存3.3.1 根瘤的表面消毒根瘤表面消毒流程：根瘤挑选蒸馏水冲洗75%酒精浸泡30s1%Hgcl浸泡58min蒸馏水冲洗34次转入YMA培养基28培养1天评价消毒效果1%升汞中浸泡根瘤时间视根瘤表皮情况而定。根瘤转入YMA培养基的平板中，用灭菌的镊子滚动平板表面的根瘤，使其每一个面接触培养基。28培养箱培养
38、24小时后观察平板内有无微生物长出，如有表示消毒不成功，需再次消毒或用其他方法消毒。3.3.2 根瘤菌的分离纯化表面消毒成功后，在超净工作台内用灭菌的镊子捏碎平板内的根瘤，使根瘤内的液体流到平板，于28培养箱培养15天，在此期间不断观察平板内菌落出现的情况。15天后根据根瘤菌形态特征挑出相似菌落进一步培养，分离出的菌落培养一段时间后进行平板划线，挑取典型的根瘤菌菌落进行再次平板划线，观察并从培养基上挑选由单细胞生成的正常的独立的菌落（见图1、2、3、4），移植到YMW培养基上，再放入恒温箱培养。移植后还观察记录菌株生长繁殖的速度和菌落的特征。如果菌根异常，则须再次用平板划线法反复分离，直至分离
39、出纯化的菌株为止。图1纯化菌种M3.2.2 图2纯化菌种M8.5.2图3纯化菌种M4.1 图4纯化菌种J6.1.23.3.3 革兰氏染色根瘤菌 (rhizobia)是一类能与豆科植物共生，形成根瘤并固定空气中的氮气，为植物生长提供氮素营养的革兰氏阴性细菌7革兰氏染色步骤:涂片固定结晶紫初染1min碘液媒染1min95%酒精脱色2025s番红复染5min镜检镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。 在显微镜油镜头下观察，菌体显蓝紫色的为革兰氏阳性菌（G+）；菌体显红色的为革兰氏阴性菌（G-）3.3.4 菌种的保存分离纯化得到的单菌落在进行研究之前，首先要进行
40、保藏。本次试验分别采用冷藏法和甘油管保存法。冷藏法：最常见的是采用斜面保存法。在酵母汁甘露醇琼脂培养基（YMA ）上划线存放在4冰箱内，每2个月转接一次。甘油培养基液体保存方法：将甘油和YMB液体培养基按3:7的比例混合配置成保存液，再接入适量的根瘤菌菌液，放置于-70冰箱内保存。3.4 菌株的回接结瘤试验3.4.1 种子催芽回接用豆科植物种子经挑选后（无坏死，腐烂和破损）放入灭菌器内用1%的KMnO4进行消毒，并用无菌水冲洗，之后放入垫有湿润滤纸的培养皿中，置28光照培养箱发芽，小粒种子发芽后即可接种并播种，大粒种子根长到3-5cm即可接种。3.4.2 回接无氮营养液 回接结瘤试验无氮营养液
41、（见表3-3），调节pH至6.87.0，而后在121，0.10.14MPa压力条件下灭菌25min。表3-3无氮营养液无氮营养液微量元素Ca(NO3)20.03gH2BO32.86gK2HPO40.136gMgSO41.18gKCl0.075gZnSO40.22gMgSO47H2O0.06gCuSO4.5H2O0.8gCaSO40.46gH2MoO40.22g柠檬酸铁0.075g蒸馏水1000ml微量元素1ml蒸馏水1000ml3.4.3 培养载体准备营养液：以无氮营养液作为培养载体，回接采用20030mm的试管，内置覆有滤纸的牛皮纸（注意牛皮纸条宽度为2.5cm ，长度应为试管长度的2/3，牛皮纸斜插），用纱布条将植物根系绑在牛皮纸的2/3处，绑完后纱布条必须能接触到试管底部，之后在试管中放入无氮营养液，营养液不得超过牛皮纸的1/3高度（见图5）。 图5 营养