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1、河南省自然科学基金项目：孕酮对缺血脑的保护及其机理研究孕酮对缺血脑的保护及其机理研究研究内容研 究 摘 要一、孕酮对大鼠局灶性脑缺血-再灌注脑水肿的影响采用大鼠局灶性脑缺血-再灌注模型，大鼠随机分为缺血再灌(I/R) 组:只进行缺血-再灌注手术,不作药物处理; 二甲基亚砜（DMSO）组:缺血前30 min、缺血后6 h 分别i.p 溶剂DMSO(0.5 mL/ kg 体重); 预防组:缺血前30 min i.p PROG 4 mg/kg体重; 防治组:缺血前30 min 和缺血后6 h分别i.p PROG 4 mg/kg 体重; 治疗组:缺血后2 h i.p PROG 4 mg/kg 体重;
2、地塞米松（DEXA）组(即阳性对照组): 缺血前30 min 和缺血后6 h 分别i.p DEXA 4 mg/kg 体重。干湿重法测定脑组织含水量，火焰分光光度计和原子吸收分光光度计测定脑组织Na+、K+、Ca2+ 含量，定量伊文思蓝法测定血脑屏障通透性。结果如下：1孕酮对局灶性缺血-再灌注大鼠脑组织水、Na+、K+含量的影响 I/R组水、Na+含量缺血侧显著高于对侧（P0.05）。预防组、防治组、治疗组（PROGmg/kg组）和DEXA组缺血侧脑皮质和纹状体水与Na+含量均显著低于I/R组（P 0.05，P 0.05）。缺血后缺血侧脑组织K+含量降低，预防组、防治组和DEXA组脑皮质和基底神
3、经节K+含量均显著高于I/R 组和DMSO组（P 0.05，P 0.01）。2孕酮对局灶性I/R大鼠脑组织Ca2+含量的影响脑缺血-再灌注损伤后，缺血侧脑皮质和纹状体Ca2+含量显著升高， I/R组缺血侧Ca2+含量较对侧升高有显著差异（P0.05）。DMSO组缺血侧Ca2+含量与I/R组比较无显著差异。预防组、防治组和DEXA组与I/R 组、DMSO组比较缺血侧Ca2+含量显著降低（P 0.05）。3孕酮对局灶性I/R大鼠血脑屏障通透性的影响 大脑中动脉阻塞h后，肉眼观显示I/R组和DMSO组大鼠缺血侧大脑半球以大脑中动脉为圆心蓝染区。定量测定结果显示PROG组缺血侧伊文思蓝含量显著低于I/
4、R组和DMSO组，统计学上有显著的差异（P0.05)。以上结果表明PROG对局灶性脑缺血-再灌注后脑水肿有明显的预防和治疗作用。这种作用可能是通过降低脑皮层和纹状体Na+和Ca2+的含量，改善血脑屏障通透性实现的。二、孕酮抗大鼠局灶脑缺血-再灌注后神经元的凋亡采用大鼠局灶性脑缺血-再灌注模型，将大鼠随机分为6组：假手术（Sham）组、I/R组、DMSO组、PROG预防组、PROG治疗组、PROG防治组，对各组动物I/R后神经功能缺陷进行计分，并应用免疫组织化学和细胞死亡原位末端标记法研究脑组织细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、p53的表达情况。结果如下：（1）缺血2h再灌注24h后神经
5、功能缺陷计分:Sham组为0分，I/R 组为1.380.92，DMSO组为1.00.53，PROG预防组为0.350.51，PROG治疗组为0.620.52，PROG防治组为0.250.46。（2）高倍视野下p53蛋白阳性细胞数:I/R组为 26.253.54, DMSO组为22.883.52,PROG预防组为 15.002.07，PROG治疗组为16.752.60，PROG防治组为10.381.69。（3）高倍视野下Bcl-2蛋白阳性细胞数:I/R组为9.501.69，DMSO组为10.252.61，PROG预防组为 17.131.13，PROG治疗组16.631.30，PROG防治组为23
6、.501.93。(4) 高倍视野下Bax蛋白阳性细胞数:I/R组为28.132.75, DMSO组为27.753.06,PROG预防组为 14.251.83，PROG治疗组13.001.85, PROG防治组为11.381.41。(5)高倍视野下凋亡细胞数：Sham组为1.880.25,I/R组为41.383.85, DMSO组为38.135.69,PROG预防组为22.882.70，PROG治疗组为25.632.93, PROG防治组为20.882.30。以上5项指标各药物处理组(PROG预防组、PROG治疗组及PROG防治组)与对照组(I/R组，DMSO组)之间差异具有统计学意义(P 0.
7、05)。以上结果表明：PROG可减轻大鼠脑缺血-再灌注后的神经元凋亡，减少局灶性缺血-再灌注脑损伤动物模型神经功能缺失。抑制脑神经细胞中p53、Bax蛋白表达；上调Bcl-2表达可能是PROG抗其大鼠脑缺血-再灌注后神经元凋亡，发挥神经元保护作用的分子机制之一。三、孕酮减轻大鼠全脑缺血-再灌注损伤采用大鼠四血管闭塞全脑缺血模型，大鼠随机分为sham组、I/R组、PROG组、DMSO(溶剂)组。硫堇染色显示，sham组大鼠海马CA1区无明显损伤，锥体细胞排列整齐致密，神经元密度为201.713.4/mm。I/R组大鼠海马CA1区大部分锥体细胞缺失，残留的锥体细胞排列松散不规则，并伴有明显的胶质细
8、胞浸润，与sham组比较，神经元密度显著降低(P 0.01)。PROG组海马CA1区残存锥体细胞排列疏松，胞核饱满，核仁较清晰，与I/R组相比，神经元密度明显升高（P0.01）。DMSO组与I/R组比较海马CA1区损伤程度无明显差别。Y型迷宫实验结果显示，I/R组与sham组比较，达到学会标准所需训练次数明显升高(P0.01)。与I/R组比较，PROG组训练次数明显降低(P0.05）。以上结果表明PROG可减轻大鼠全脑缺血-再灌注损伤，改善大鼠的学习和记忆功能。四、孕酮对缺血-再灌注脑损伤小鼠学习记忆功能的影响采用小鼠脑缺血-再灌注模型，将小鼠随机分为假手术组和缺血-再灌注模型组，其中缺血-再
9、灌注模型组又分为生理盐水组和三种剂量孕酮组。利用水迷宫和跳台实验评价小鼠的学习记忆功能的改变。水迷宫实验结果显示生理盐水组与假手术组相比，出现明显的学习记忆障碍。与生理盐水组比较，高剂量组到达终点时间，错误次数及2min内到达终点动物比率均有显著性差异，中剂量组错误次数有显著性差异。跳台实验结果显示生理盐水组与假手术组比较，出现明显的学习记忆障碍，反应时间延长，错误次数增加，潜伏期缩短。与生理盐水组比较，孕酮对小鼠缺血-再灌注损伤引起的学习记忆障碍有改善作用，减少反应时间，延长潜伏期，减少测试期和重测期错误次数。AchE活力和Ach含量测定结果显示生理盐水组与假手术组比较，Ach含量明显减少，
10、AchE活力明显增加。与生理盐水组比较，高剂量和中剂量孕酮组Ach含量明显增加，而AchE活力明显降低。以上结果表明PROG可改善缺血-再灌注脑损伤小鼠学习记忆功能，发挥抗小鼠脑缺血-再灌注损伤作用。五、孕酮对新生鼠缺氧缺血性脑病的预防和保护作用 采用新生鼠缺氧缺血性脑病模型，随机分为sham组、缺氧缺血组、PROG组。测定脑组织含水量、Na+、K+、Ca2+以及NO含量。结果显示，缺氧缺血组皮层和海马组织中含水量、Na+、Ca2+和NO含量明显高于sham组（P 0.01），K+含量明显低于sham组（P0.05）。与缺氧缺血组相比，PROG组皮层和海马组织中含水量、Na+、Ca2+和NO含
11、量明显降低。上述结果表明，PROG可减轻新生鼠缺氧缺血性脑病损伤后脑水肿，从而减轻新生鼠缺氧缺血性脑病损伤，这种作用可能与降低缺氧缺血后脑组织Na+、Ca2+和NO含量有关。六、结论1在大鼠局灶脑缺血模型、大鼠全脑缺血模型、新生鼠缺血缺氧模型和小鼠缺血-再灌注模型上均观察到了孕酮对缺血性脑病的保护作用。2孕酮可减轻脑缺血后脑组织水肿，这种作用可能是通过降低脑皮层、海马和纹状体Na+和Ca2+的含量，维持离子的稳态和降低血脑屏障通透性实现的。3孕酮可减轻大鼠脑缺血-再灌注后的神经元凋亡，减少缺血脑损伤动物神经元缺失，从而改善动物神经功能和学习记忆等认知功能。而抑制脑神经细胞中p53、Bax蛋白表
12、达，上调Bcl-2表达可能是PROG抗其大鼠脑缺血-再灌注后神经元凋亡，发挥神经元保护作用的分子机制之一。前 言脑血管病是危害中老年健康的常见病、多发病，生活水平愈高，该病就愈发突出，死亡率和致残率很高，而且发病率有逐年增加的趋势。我国每年有150万人发生脑梗塞，死亡100万，幸存者中75%不同程度致残，严重致残40%，经济消耗约100亿元，给家庭、社会及国家带来沉重负担。脑血管病大体分为两大类：（1）缺血性脑血管病，约占70-80（2）出血性脑血管病，约占20-30。对脑卒中病理生理的深入研究加深了对其预防和治疗的认识，并推动对新型抗脑缺血药物的研制开发。近年来，钙超载，毒性氧自由基和兴奋性
13、氨基酸毒性等学说的出现，为解释脑缺血的病理生理奠定了基础，一些治疗脑缺血的药物如钙通道阻滞药、自由基清除剂和兴奋性氨基酸(EAA)拮抗剂也应运而生，但迄今尚无较理想的治疗药物，因此如何及时、有效地预防和治疗脑血管病一直是神经科学工作者关注的焦点。流行病学调查表明50-55岁妇女对精神药物、镇静剂和兴奋剂使用率要高出其它年龄组3倍，同年龄组的男性未发现增加现象。并且女性脑卒中的发病率较男性低得多，哺乳妇女尤为少见，而绝经后则明显升高1。这些现象使人们有理由推测雌性激素影响着神经系统疾病、脑血管病的发生和发展。而另一项流行病学调查发现女性绝经期前中风的发病风险明显低于同龄男性，绝经期以后女性发病率
14、却明显增高，短期内达到与男性相近的水平2，提示性激素水平的变化与脑中风的发生有一定联系。研究已证实雌激素可通过对抗兴奋性氨基酸（EAA）毒性、抗脂质过氧化等发挥对脑的保护作用3,4。孕酮（Progesterone,PROG）作为另一重要的雌性激素在神经系统的作用过去研究并不多，但近十年来，PROG的广泛作用已经引起人们极大的重视。除了内分泌器官（卵巢、黄体和肾上腺）分泌PROG及其前体和代谢物外5，中枢神经系统的少突胶质细胞6和外周神经系统的雪旺氏细胞7都能把胆固醇或甲羟戊酸合成为PROG。神经系统可以不依赖内分泌腺而维持其中有一定的PROG浓度8,9，因此PROG又被称之为“神经甾体”(Ne
15、urosteriod)。研究表明PROG受体广泛分布于中枢神经系统，包括下丘脑、视前区、中脑、皮质、杏仁核、海马、尾壳核和小脑10，为PROG发挥神经系统作用奠定了基础。经典的观点认为PROG在神经细胞是通过甾体特异性胞浆/胞核受体发挥作用的11。然而，最近研究表明PROG是通过调节中枢神经递质系统发挥作用的，它可影响抑制性氨基酸12,13和兴奋性氨基酸(EAA)递质系统14,15，从而影响神经系统的功能。PROG与其相关代谢物又是中枢神经系统抑制剂，发挥麻醉16,17,18、抗惊厥19,20,21和抗焦虑22作用。以上表明PROG具有广泛的功能，而并非一种简单的与妊娠有关的激素了。最近，有人
16、试用外源性PROG处理脑挫伤大鼠，结果显示能减轻脑水肿，促进认知能力的恢复，抑制神经细胞的继发性死亡23,24。Betz等将PROG用于局灶性脑缺血大鼠显示能减轻缺血早期脑水肿25 。最近，Jiang等研究表明PROG能减少脑缺血大鼠脑梗塞面积26。另外PROG可能通过阻滞Na，K+ATP酶介导的Na+运输减轻脑水肿27，而PROG对孤立大脑微循环离子运输的阻滞较塞米松强10倍28。以上有关PROG的初步研究结果给人以强烈的印象，PROG可能干预缺血性脑损伤发病机制中某个环节，有益于神经组织。然而这方面的报道尚少，而且至今PROG对缺血脑的保护作用的机制还不明了。基于此，我们的实验旨在证实PR
17、OG减轻缺血性脑水肿的作用，并初步阐明PROG减轻脑水肿的机制，以探讨PROG对脑缺血损伤的保护作用。一、孕酮减轻大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤后脑水肿1 材料和方法1. 1 试剂PROG(Sigma 公司) ，实验前溶于二甲基亚砜（DMSO） 配成8mg/ ml 浓度备用；DMSO 为分析纯(北京化工厂) ；戊巴比受钠(西德Serva 进口分装)，实验前配制成2 %的溶液；地塞米松（DEXA）注射液,江苏涟水制药厂。1.2 大鼠局灶性脑缺血-再灌注（I/R）模型制作本实验采用尼龙线栓塞法大脑中动脉阻塞（MCAO）I/R模型。按照本研究室以前的方法29，参考Longa等的报道30,31 ，并加以
18、改良。术前大鼠禁食12-24 h，控制血糖水平32。把尼龙线剪成约5 cm长，然后将其一端与酒精灯火焰的底部保持一定距离，缓慢加热。先烧成端面为平面的膨体，继续加热至膨体熔化，变成小而光滑的球体，并在低倍显微镜下核实。用酒精擦洗干净，距球端20 mm处作标记，置于生理盐水中备用。取大鼠，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，仰卧位固定于手术台上，在颈旁左侧距颈中线0.5 cm处纵向切开皮肤，切口约2.5 cm。分离颈总动脉，在其近心端穿线，并轻轻提起，向头部分离，烧断甲状腺动脉。从颈总动脉分叉处向上分离颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）。烧断ECA近心端的分支，尽量游离ECA，在ECA远端结扎，并于结扎
19、处远端烧断。向颅底继续分离ICA，在颅底处仔细分离出翼腭动脉，并结扎根部，仅保留ICA入颅的主干畅通。将ECA残端的结扎线向胸部方向牵拉，使ECA残端与ICA方向一致，用小型动脉夹暂时夹闭ICA和颈总动脉。在ECA残端下备线，然后用虹膜剪在ECA残端剪一小口，插入尼龙线的球端，并用备线适度结扎，避免结扎过松而致出血或结扎过紧影响尼龙线的插入。为防止血凝形成血栓，在插线时滴入浓度为2.5106 u/L的肝素钠溶液数滴。缓缓插入尼龙线，当感到第一阻力时，表明尼龙线球端开始进入颅骨内，继续小心插入，感到第二阻力时，表明球端已到MCA的起始端，再轻轻向前使其到达大脑前动脉(ACA)，阻断MCA血流。在
20、ECA残端插线处扎紧，以固定尼龙线。将尼龙线尾端留于皮外1 cm，缝合切口皮肤。为防止动物术后脱水，术后常规在大鼠腹部皮下注射0.9% Nacl溶液2 ml。若动物已清醒，需要再次麻醉后拔线，以免拔线时动物挣扎颅底血管破裂出血。阻断MCAh时，在动物麻醉状态下，轻轻向外抽拉尼龙线，感到第一阻力时，表明尼龙线球部已达颅骨内孔。当感到第二阻力时，球部到达ECA主干中，恢复大脑动脉环和MCA的血供，然后剪断暴露在外的尼龙线。术中用60瓦白炽灯保持颅温，术后保持体温至清醒。平时保持室温于20-24。大鼠术后单笼饲养，自由饮水进食。为保证模型的均一性，对MCA阻塞后大鼠进行神经体征的观察，以剔除不符合实
21、验标准的动物。本实验对术后h内没有出现提尾悬空实验阳性的大鼠（只）和再灌注拔线时出现动物突然死亡，解剖发现系由颅底出血而死（只）的均予剔除。1.3 实验动物分组SD 雄性大鼠(河北医科大学实验动物中心提供)，体重280400g，48 只，随机分为6 组( n = 8)：(1) 缺血再灌( I/ R) 组：只进行缺血-再灌注手术，不作药物处理； (2) 二甲基亚砜（DMSO）组(溶剂对照组)：MCAO 前30min 和MCAO 后6 h 分别i.p 溶剂DMSO 0.5 ml/ kg体重；(3) 预防组：MCAO 前30 min i.p PROG 4 mg/kg 体重；(4) 防治组：MCAO
22、前30 min 和MCAO 后6 h分别i.p PROG 4 mg/kg 体重；(5) 治疗组：缺血后2 h i.p PROG，根据PROG的量又分为2 mg/ kg体重 组、4 mg/ kg体重组和 8 mg/ kg体重组；(6) 地塞米松（DEXA）组(即阳性对照组)：MCAO 前30 min 和MCAO 后6 h 分别i.p DEXA 4 mg/ kg 体重。1. 4 脑组织含水量测定33大鼠MCAO 24 h后处死，迅速取脑。将取出的脑组织放在一个内有生理盐水湿润的定性滤纸的培养皿中，以防组织水分蒸发。实验前准备带盖干净玻璃称量瓶若干，用硝酸浸泡，去离子蒸馏水冲洗，烘干备用。去除大脑皮
23、质表面软脑膜，切取直经约6 mm的左右额顶叶皮质及左右基底神经节，分别置于用预先称重的玻璃称量瓶内，用电光分析天平（分度值0.1 mg）称湿重。从开颅取脑至称重完毕控制在分钟内。称重后放入电热恒温干燥箱105-110烘烤48 h，至恒重后称干重（两次干重之差0.2 mg。根据干湿法公式：(湿重干重)/湿重100%，测算脑组织含水量百分率。1.5 脑组织Na+、K+、Ca2+ 含量测定34在烘干的脑组织中加入优级纯硝酸ml、高氯酸数滴，放置h后，水浴加热消化4 h，然后用去离子水稀释定容后过滤。将滤液分成份置于试管中，用火焰分光光度计测定脑皮质和基底神经节Na+、K+含量，用原子吸收分光光度计测
24、定Ca2+ 含量。测的数值用每g干组织中含有离子的mmol数表示。1.6 血脑屏障通透性定量观察33,35,36伊文思蓝（EB）标准曲线制作：称取出EB 4 mg于容量瓶中，加生理盐水至总容积为25 ml，取0.3 ml于试管中，加入5.7ml甲酰胺混匀作为第1管；从第1管取3 ml加入3 ml甲酰胺作为第2管；从第2管取3 ml加入3 ml甲酰胺作为第3管；依此类推共作7管，其浓度分别为8，4，2，1，0.5，0.25，0.125 mg/ml，54孵育24小时后比色（l=632 nm）测定光密度，制作标准曲线，计算出线性回归方程。脑组织中EB含量确定：大鼠大脑中动脉阻塞后10分钟尾静脉注入2
25、%的EBml/kg，几秒钟后大鼠眼球、四肢等显示蓝色，表示注入成功。动物于MCAO后24 h处死,处死前半小时麻醉，剪开胸腔暴露心脏，用剪刀在右心耳处剪一小口作为血流出口，然后将磨钝的9号注射针头插入左心室，用加有抗凝剂的生理盐水灌洗至流出液呈无色为止，以冲洗存留于血管中的染料，保证试验的精确性。灌洗后迅速取左侧半球缺血区脑组织和右侧对应区域脑组织，称取湿重，然后将组织置于已加有ml甲酰胺的试管中，在54恒温培养箱中孵育24 h，让组织中的EB充分溶解在甲酰胺溶液中。然后将溶有伊文思蓝的甲酰胺溶液过滤，用分光光度计，波长632 nm，蒸馏水作空白比色，测定其光密度。根据线性回归方程计算出溶液中
26、EB的浓度，最后以克组织中所含EB的微克数表示。1. 7统计分析各组结果采用SPSS 统计软件处理，实验数据用均数标准差表示，组间进行单因素方差分析，组内进行配对t 检验。2 结果2. 1 PROG对缺血脑组织含水量的影响从表1可看出，单纯I/R组、溶剂对照组（DMSO）脑皮质和基底神经节含水量MCAO侧与非MCAO侧相比均有显著差异（P0.05）。而DMSO组与单纯I/R组比较无显著差异,表明本实验所用DMSO剂量对缺血脑含水量无影响。 PROG预防组（i.p 4mg/kg）和防治组（i.p 4mg/kg2），MCAO侧脑皮质含水量分别为80.57 1.13和80.511.06 mmol/g
27、干重，与单纯I/R组(83.171.21 mmol/g干重和溶剂对照组（83.031.51 mmol/g干重）相比，含水量显著下降，统计学处理有非常显著的差别（P0.01）。PROG治疗4mg/kg和8mg/kg组也明显降低脑MCAO侧皮质含水量(分别为81.780.88，81.740.89 mmol/g干重，与单纯I/R组比较有显著的差别(P0.05)。各组MCAO侧基底神经节含水量与单纯I/R组和溶剂对照组比较得到了上述同样的结果(表1)。并且结果也显示PROG预防组和防治组降低脑含水量的趋势更明显。表明，PROG对局灶性脑缺血脑水肿有明显的预防和治疗作用。DEXA组MCAO侧脑皮质含水量
28、(81.321.08 mmol/g干重与单纯I/R组和DMSO组比较均有显著的差异(P0.05）。结果证实了DEXA具有降低脑组织含水量的作用。非MCAO侧各组无显著差异(P0.05) 。Table 1 Effects of PROG on brain H2O contents after MCAO in ratsDrug Dose (mg/kg)Medication time Brain H2O contents(mmol/g dry wt) LC RC LB RBSI/R83.171.21#80.140.9682.431.39#79.751.19DMSOC83.031.51#80.590.
29、8382.441.55#80.111.08PROG 4B80.571.13 ac80.021.2380.101.23 ac 79.300.94 4C80.521.01 ac80.030.9979.920.37 ac 79.041.11 4A81.791.3680.830.9181.181.03bd 79.331.23 4A81.780.88 bd80.910.7381.180.78 bd 79.700.76 4A81.740.89bd 80.491.4781.141.23 bd79.421.01DEXA 4C81.321.07ac80.661.1380.751.30ac 79.521.17Va
30、lues are S. LC:left cortex; RC:right cortex; LB:left basal gangia; RB:right basal ganglia; A:2h after MCAO; B:30 min before MCAO; C:30 min before and 6h after MCAO; SI/R:simple I/R;DEXA:dexamethasone.aP0.01, bP0.05 compared with SI/R group;cP0.01, dP0.05 compared with DMSO group. #P0.05 compared wit
31、h contralateral group.2.2 PROG对脑组织Na+含量的影响表2结果显示，单纯I/R组、DMSO组脑皮质Na+含量MCAO侧 (分别为233.6829.73，231.3922.60 mmol/g干重与非MCAO侧相比均有显著差异（P0.05）。而DMSO组与单纯I/R组比较无显著差异。PROG各组均有降低MCAO侧Na+含量的作用,预防组(152.4728.59 mmol/g干重、预防合并治疗组(153.6034.23 mmol/g干重)、4 mg/kg治疗组(175.3448.74 mmol/g干重和8 mg/kg治疗组(175.5849.62 mmol/g干重与单纯
32、I/R组和DMSO组比较均有显著的差异(P0.05)。同样的结果也可在脑基底神经节观察到。结果也显示了PROG预防组和预防合并治疗组较其它各组有更明显的降低脑Na+含量的趋势。表明缺血前后使用PROG对局灶性脑缺血MCAO侧Na+含量的升高均具有明显的抑制作用。DEXA组脑皮质和基底神经节Na+含量与I/R组和DMSO组比较均有较明显的差异（P0.05）。非MCAO侧各组无显著差异(P0.05)。Table 2 Effects of PROG on brain Na+ contents after MCAO in ratsDrug Dose(mg/kg)Medication time Brai
33、n Na+ contents(mmol/g dry wt) LC RC LB RBSI/R233.3929.73#142.0518.78230.1041.21#138.4025.15DMSOC231.3922.60#140.3019.54227.0030.01#131.8515.96PROG4B152.4728.59 ac130.0520.21152.7921.17 ac119.0320.184C153.6034.23 ac123.9419.79144.2224.27 ac120.6213.084A193.0651.21139.7013.70187.2544.14139.4421.274A17
34、5.3448.74 ac142.1626.89181.9527.08 ac127.6513.194A175.5849.62 ac133.7821.67180.4346.77 ac125.6528.77DEXA4C175.4717.07 ac146.3518.84177.0732.33 ac136.3521.27Values are S. LC:left cortex; RC:right cortex; LB:left basal gangia; RB:right basal ganglia; A:2h after MCAO; B:30 min before MCAO; C:30 min bef
35、ore and 6h after MCAO; SI/R:simple I/R;DEXA:dexamethasone.aP0.01, bP0.05 compared with SI/R group;cP 0.01, dP0.05 compared with DMSO group. #P 0.05 compared with contralateral group.2.3 PROG对脑组织K+含量的影响从表3可看出，单纯I/R组、DMSO组脑皮质和基底神经节K+含量MCAO侧 与非MCAO侧相比均有显著差异（P0.05）。而DMSO组与单纯I/R组比较无显著差异。PROG预防组和防治组与单纯I/R
36、 组和DMSO组比较，MCAO侧脑皮质和基底神经节K+含量均显著升高（P 0.05）。DEXA组脑皮质和基底神经节K+含量高于单纯I/R 组(分别为P 0.05, P0.05）。其它PROG各治疗组虽有升高脑组织K+含量的趋势，但统计学上无显著差异(P 0.05)。非MCAO侧各组无显著差异(P 0.05)。Table 3 Effects of PROG on brain K+ contents after MCAO in ratsDrug Dose(mg/kg)Medication time Brain K+ contents(mmol/g dry wt) LC RC LB RBSI/R24
37、5.6750.24#387.7923.48247.3340.75#380.4528.65DMSOC254.7543.54#397.3510.98252.6238.52#385.1615.27PROG4B350.8081.86 ac386.6537.07338.5663.11ac384.2224.724C361.6941.67ac380.9731.17341.2042.80ac381.8216.734A312.4523.86393.4417.12287.2126.30379.7736.834A310.0563.19381.0527.92281.9337.93354.8340.064A322.11
38、75.53 ac384.7612.90278.2840.52371.4827.33DEXA4C322.2428.96ac385.7520.67319.3829.06ac359.6536.12Values are S. LC:left cortex; RC:right cortex; LB:left basal gangion; RB:right basal ganglia; A:2h after MCAO; B:30 min before MCAO; C:30 min before and after MCAO; SI/R:simple I/R;DEXA:dexamethasone.aP 0.
39、01, bP 0.05 compared with SI/R group;cP 0.01, dP 0.05 compared with DMSO group. #P 0.05 compared with contralateral group.2.4 PROG对脑组织Ca2+含量的影响从表4可看出，单纯I/R组、DMSO组脑皮质和基底神经节Ca2+含量MCAO侧 与非MCAO侧相比均有显著差异（P0.05）.而DMSO组与单纯I/R组比较无显著差异。PROG预防组和预防合并治疗组与单纯I/R 组比较，MCAO侧脑皮质(分别为23.655.19,21.805.57 mmol/g干重)和基底神经节
40、Ca2+含量(24.523.65,25.765.81 mmol/g干重)显著降低（p0.05）。DEXA组脑皮质Ca2+含量显著低于单纯I/R组(P0.01)和DMSO组(P0.05）。其它各组虽有降低脑组织Ca2+含量的趋势，但统计学上无显著差异(P0.05)。表明PROG对局灶性脑缺血MCAO侧Ca2+含量的升高有明显的预防作用。非MCAO侧各组无显著差异(P0.05)。Table 4 Effects of PROG on brain Ca2+ contents after MCAO in ratsDrug Dose(mg/kg)Medication time Brain Ca2+ con
41、tents(mmol/g dry wt) LC RC LB RBSI/R38.947.18#23.454.6338.775.68#21.963.44DMSOC39.228.83#22.015.2437.956.80#23.261.59PROG4B23.655.19ac20.325.1624.523.65ac22.606.394C21.805.57ac20.011.8225.765.81bd22.064.074A31.718.0924.244.7836.4210.8722.918.364A32.316.1121.756.4334.779.6026.706.064A30.8313.4224.824
42、.7027.364.90bd21.413.84DEXA4C24.694.84ac25.626.1629.858.11bd2.655.44Values are S. LC:left cortex; RC:right cortex; LB:left basal gangia; RB:right basal ganglia; A:2h after MCAO; B:30 min before MCAO; C:30 min before and 6h after MCAO; SI/R:simple I/R;DEXA:dexamethasone.aP0.01, bP0.05 compared with S
43、I/R group;cP0.01, dP0.05 compared with DMSO group. #P 0.05)；MCAO 侧EB 含量I/R 组为5.891.37 mg/g湿重,DM SO 组为5.032. 70 mg/g 湿重, PROG 组为2.070.96 mg/g 湿重; PROG组显著低于I/R 组和DM SO组( P 0.05)。表明PROG可显著阻止脑缺血所致的血脑屏障通透性的增加。3 讨论3.1 大鼠局灶性脑I/R模型的改进和标准化 为评价药物对脑缺血的疗效,建立一种接近临床病人且重复性好的动物模型是非常必要的。目前采用的全脑缺血模型死亡率和惊厥率较高，影响了成功率。直
44、接凝断大脑中动脉的方法不能进行再灌流且手术复杂，因而也限制了发展。我们目前采用的可逆性大脑中动脉阻塞I/R模型最早是由Koizumi等37在1986年开始使用的。1989年Nagasawa等31对此模型作进一步的评价；同年Longa30对此模型作了改良。随后经不断的使用和改良，现已发展为较为成熟的模型。本实验是在以前脑I/R模型基础上稍作改进，并严格控制实验条件，保证此模型的标准化和均一性，以利于各组之间的比较以及与其它作者的实验进行比较。本实验的结果也显示各指标单纯I/R 组脑MCAO侧与非MCAO侧比较均有显著的差别(P0.01),表明各缺血组达到了缺血的实验目的. 制作标准化I/R模型注意事项: 选用合适麻醉剂：参考卜壁涛等人经验38，认为使用