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1、1,第13讲 有机废弃物的资源化：能源、材料、蛋白,2/93,1 有机废弃物生产乙醇,乙醇作为燃料的优点 产能效率高 不产生CO，污染低 可发酵生产，成本低 乙醇发酵的传统原料可选用蔗糖或淀粉，发酵微生物主要是酵母菌 催化反应的酶是蔗糖水解酶（胞外酶）和酒化酶（胞内酶） 目前研究集中在纤维素生物质（农林废弃物和城市固体垃圾）发酵产乙醇,3/93,世界生物乙醇产量的变化趋势,4/93,微生物发酵生产乙醇的原料,5/93,纤维素生物质转化生产乙醇,预处理：去除木质素、溶解半纤维素或破坏纤维素的晶体结构，以利于水解 用纤维素酶和半纤维素酶水解糖化，生成可发酵的糖类 糖发酵生产乙醇,6/93,木质纤维
2、的组成及其利用,主要称为包括纤维素、半纤维素和木质素,7/93,几种纤维素生物质的主要组成,8/93,木质素,木质素是由苯丙烷亚基组成的不规则的近似球状的多聚体，是不可溶的高分子，没有任何规则的重复单元或易被水解的键 可在纤维素周围形成保护层，影响纤维素水解 目前还无法实现木质素的有效降解 水解后的木质素残渣可用于燃料,9/93,木质素的结构,10/93,半纤维素,半纤维素是由五碳糖和六碳糖组成的短链异源多聚体 聚合度低，所含糖单元数在60200，无晶体结构，较易水解 水解产物包括两种五碳糖（木糖和阿拉伯糖）和三种六碳糖（葡萄糖、半乳糖和甘露糖） 一般酵母可发酵六碳糖但不能发酵五碳糖,11/9
3、3,半纤维素的基本结构,12/93,纤维素,由葡萄糖脱水通过-1,4-葡萄糖苷键连接而成直链聚合体，聚合度大（3500-10000） 纤维素大分子之间通过大量氢键连接在一起形成晶体结构的纤维素束，结构稳定，不溶于水，无还原性 常用的水解催化剂是无机酸和纤维素酶，对应酸水解工艺和酶水解工艺 水解生成葡萄糖,13/93,纤维素的结构,14/93,纤维素的预处理,预处理方法应满足 可促进糖的生成或有利于后面的酶水解 避免碳水化合物的降解和损失 避免产生对水解和发酵有害副产物 经济上合理 蒸汽爆裂法、稀酸预处理等都是较成熟可行的预处理技术 没有普遍适用的预处理方法,15/93,预处理方法比较,16/9
4、3,预处理方法比较,17/93,纤维素的水解,目前尚无能直接利用纤维素作为发酵底物的菌株 酸水解的问题 条件苛刻，对设备有腐蚀作用 会生成有毒的分解产物如糖醛、酚类 成本较高 酶水解可常压进行，产率高，污染低，但酶成本较高，限制了其工业应用,18/93,纤维素的水解和脱羧反应,19/93,纤维素的水解过程,纤维素酶包括内切葡聚糖酶（1,4-D-葡萄糖水解酶）、外切葡聚糖酶（1,4-D-葡萄糖纤维二糖水解酶）和-葡萄糖苷酶等多组分酶系,20/93,产纤维素酶的微生物,21/93,纤维素生产乙醇的发酵工艺,纤维素生产乙醇包括纤维素糖化和乙醇发酵两步，前者是酶促反应，是限速步骤，后者是微生物反应，较
5、为成熟 纤维素糖化过程中，纤维二糖、葡萄糖等酶解产物的不断累积，会抑制纤维素酶的活性，导致反应速率下降 工业上有三种工艺：单独水解和发酵法（间接法），直接微生物转化法和同时糖化发酵法,22/93,单独水解和发酵法（SHF）,酶的生产、纤维素水解和葡萄糖发酵三个过程分开,23/93,直接微生物转化法（DMC）,同一微生物完成纤维素的水解、糖化和乙醇发酵的生产过程 常用的微生物是热纤梭菌或其和热硫化氢梭菌混合 将酶生产、纤维素水解和糖发酵在一个反应器中进行，设备简单，成本低 但目前没有找到同时高产纤维素酶和高乙醇发酵浓度的微生物 混菌发酵产量较低，且有其他副产物生成,24/93,热纤梭菌和热硫化氢
6、梭菌混合培养生产乙醇,25/93,同时糖化和发酵法（SSF）,利用可产生纤维素酶的微生物和酵母在同一容器中连续进行纤维素的糖化和发酵 糖的积累较低，消除了其对纤维素酶活性的抑制 但乙醇对纤维素酶活性有抑制 主要问题是水解和发酵所需温度不能匹配，实际采用折中温度，造成水解和发酵效率都无法达到最大 可培养耐热酵母解决高温发酵的问题,26/93,27/93,生物质发酵生产乙醇的发展前景,减轻或消除发酵原料中有害物的影响 水解副产物如乙酸、甲酸、乙酰丙酸、酚类和醛类 提高微生物的抵抗力 五碳糖的发酵 将木糖转化为木酮糖，为酵母所利用 驯化可以降解五碳糖的天然微生物 基因工程技术改造菌种以利用五碳糖 发
7、酵中添加营养物,28/93,基因工程技术开发五碳糖发酵制乙醇的微生物,29/93,2 厌氧发酵制氢,混合酸发酵途径、 丁酸型发酵途径、 乙醇型发酵途径、 NADH途径,30/93,混合酸发酵产氢途径,典型微生物有埃希式菌属和志贺式菌属 产物有乳酸、乙酸、二氧化碳、氢气和甲酸,31/93,丁酸型发酵产氢途径,典型微生物有梭状芽孢杆菌属、丁酸弧菌属等 产物有丁酸、乙酸、二氧化碳和氢气,32/93,乙醇型发酵产氢途径,产物有乙醇、乙酸、二氧化碳、氢气和少量丁酸 与丁酸型发酵产氢途经相同 不同之处是在不同pH和氧化还原电位下，产氢后得到的乙酰辅酶A有三种后续的发酵类型,33/93,NADH途径,NAD
8、H/NAD+是一种平衡调节途径 当NADH和H+产生积累时，微生物进行调控释放分子氢,34/93,不同废水产氢结果,35/93,生物产氢的前景展望,氢气形成的生物化学机制研究 高产菌株的选育 原料利用种类的研究 连续产氢设备及产氢动力学方面的研究 氢气与其他混合气分离工艺的研究 副产物利用方面的研究,36/93,3 厌氧发酵产甲烷,不溶性有机高分子物质在细胞外酶的作用下水解成可溶性的有机物单体 有机物单体发酵降解，产物为氢气、甲酸、重碳酸盐、丙酮酸盐、乙醇及各类挥发性低级脂肪酸（乙酸、丙酸、丁酸等） 专性产氢产乙酸菌将简单有机物氧化成氢气和乙酸,37/93,同型产乙酸菌利用氢气将重碳酸盐还原生
9、成乙酸 简单有机物氧化为重碳酸盐和乙酸，参与的细菌为硝酸盐还原菌和硫酸盐还原菌 由硝酸盐还原菌和硫酸盐还原菌将乙酸盐氧化为碳酸盐,38/93,由硝酸盐还原菌和硫酸盐还原菌进行氢气或甲酸的氧化 乙酸发酵产甲烷，主要参与细菌为产甲烷八叠球菌和产甲烷丝菌，该步骤产甲烷量占70%（限速步） 重碳酸盐还原产甲烷，参与细菌为氢氧化产甲烷细菌，该步骤产甲烷量占30%,39/93,厌氧消化过程的微生物学,水解酸化菌群 将大分子不溶性有机物在水解酶的催化作用下水解成小分子的水溶性有机物 将水解产物吸收进细胞内，经细胞内复杂的酶系统催化转化，将一部分有机物转化为代谢产物，排入细胞外的水溶液里，成为参与下一阶段生化
10、反应的细菌群可利用的基质 产氢产乙酸菌群 将第一阶段产生的有机代谢产物，如三碳及三碳以上的直链脂肪酸、二碳及二碳以上的醇、酮和芳香族有机酸等转化为甲烷,40/93,同型产乙酸菌群 混合营养型厌氧细菌，既能利用有机基质产生乙酸，也能利用分子氢和二氧化碳产生乙酸 产甲烷菌群 参与厌氧消化的最后一类也是最重要的一类细菌群 细胞壁中缺少肽聚糖，而含有多糖、多肽或多肽多糖的囊状物 从分类学上属于古细菌 已分离得到约40余种，常见的有产甲烷短杆菌属、产甲烷杆菌属、产甲烷球菌属、产甲烷螺菌属、产甲烷八叠球菌属和产甲烷丝菌属 能利用的能源物质有氢气/二氧化碳、甲酸、甲醇、甲胺基类和乙酸,41/93,实际应用,
11、发酵原料易得，小型化甲烷生产不必使用复杂的发酵工艺和设备 大规模甲烷生产需要对发酵参数进行严格控制，以获得最大甲烷产量,农村常用发酵生产甲烷的原料及沼气产量,42/93,4 生产可生物降解塑料PHAs,可降解塑料的分类 以聚-羟基烷酸（PHAs）为原料制造的新型塑料，可被多种微生物完全降解，应用前景乐观,43/93,PHAs的结构,44/93,PHAs的特点,多种微生物能在体内累积PHAs作为碳源和能源的储存物 羟基的手性决定了PHAs具有光学活性，仅以R构型稳定存在 大多数PHAs的物理化学性质是针对于PHB（聚-羟基丁酸）和PHBV（-羟基丁酸和-羟基戊酸的共聚物）两种聚合物进行的,45/
12、93,PHAs和聚丙烯的性能比较,46/93,PHAs的用途,47/93,PHAs的优缺点,优点是 生物可降解性，不污染环境 生物相容性，可用于医学材料 缺点是 熔化稳定性较差，可通过发酵过程中加入其他单体以合成共聚体解决 易发脆，可通过淬火处理较大程度的解决,48/93,合成PHAs的主要微生物,1925年，Lemoigne从巨大芽孢杆菌中分离并鉴定了PHB，褐球固氮菌也可产生PHB 1974年，Wallen和Rohwedder从活性污泥的氯仿萃取液中得到了其他羟基烷酸单体和杂聚体 1983年，专利报道可用微生物直接合成PHBV共聚物 目前发现的能够生产PHAs的微生物包括光能和化能自养及异
13、养菌，计65个属中的近300种微生物 研究较多的有产碱杆菌属、固氮菌属和红螺菌属等,49/93,产PHAs的商业化菌株,应具备的基本性能 有对廉价碳源的利用能力 生长速度快 对底物转化率高 胞内聚合物含量高 聚合物分子质量大 目前成功应用的菌株主要是真养产碱杆菌 （Alcaligenes eutrophus） 对菌种的改良集中在重组E. coli中进行,50/93,A. Eutrophus和重组E. coli生产PHB的比较,51/93,PHB的合成途径及关键酶,大多数微生物通过三步合成途径合成PHB -酮裂解酶催化乙酰CoA生成乙酰乙酰CoA 在依赖NADPH的乙酰乙酰CoA还原酶的作用下把
14、乙酰乙酰CoA还原成D-(-)-3-羟基丁酰CoA 单体的D-(-)-3-羟基丁酰CoA由PHB聚合酶催化聚合生成PHB,52/93,从乙酰CoA合成PHB的三种途径,53/93,PHB生物合成中几种酶的动力学特性参数,54/93,某些微生物中同时存在五步合成途径 -酮裂解酶催化乙酰CoA生成乙酰乙酰CoA 依赖NADPH的乙酰乙酰CoA还原酶催化L-(+)-3-羟基丁酰CoA的形成 L-(+)-3-羟基丁酰CoA经过两个立体专一的烯酰基CoA水合酶先后作用而转变成D-(-)-3-羟基丁酰CoA 单体的D-(-)-3-羟基丁酰CoA由PHB聚合酶催化聚合生成PHB PHA聚合酶是关键酶,55/
15、93,从不同的底物合成PHAs的途径,56/93,PHAs生产工艺细菌发酵生产PHB,细菌发酵生产PHB 尽可能提高细胞密度 保证高的胞内累积量 缩短发酵周期以提高生产强度 多采用流加培养 自然条件下，产PHB的细菌中PHB含量为1%-3%，控制发酵条件下，PHB含量可达细胞干重的70%-80% 细菌发酵生产价格较高，在医药业有市场,57/93,PHB生产比较,58/93,细菌发酵需要解决的问题,定向育种，提高菌种底物转化率和生长速度 控制聚合物分子质量分布 提高提取过程的收率和产品纯度，采用非有机溶剂提取产物以降低污染 聚合物分子设计、修饰和共混加工技术等缩小聚合物和化工合成塑料的性能差异
16、优化流加发酵技术 重组E. coli等使其获得PHB发酵能力,59/93,发酵法生产PHB工业化需具备的条件,60/93,PHAs生产工艺植物生产PHB,1992年美国科学家首次进行了植物生产PHB的尝试,61/93,各种PHB提取方法的比较,62/93,PHAs合成的代谢工程策略,63/93,微生物合成PHA的代谢机理及关键酶,64/93,PHB的降解及PHB解聚酶,一般在厌氧污水中降解最快，在海水中降解最慢 PHB的生物降解机制 PHB表面的-OH和-COOH基团数量增加 细菌解聚反应，酶将高聚物降解成单体 分解产物有-羟基丁酸、乙酰乙酸和少量乙酸，在有氧条件下大多被氧化成为二氧化碳和水
17、较低的pH能阻止聚合物的分解 很多微生物均可分泌PHB解聚酶,65/93,PHB生产的前景及展望,PHB本身有缺陷性，如低的热稳定性、硬脆性等，共聚物的韧性也有待提高 生产PHB的关键在于产量提高 目前PHB及其共聚物的生产仍以发酵为主，价格昂贵，DNA重组技术可使其生产价格得到下降 转基因植物生产PHB的成功，有望使其价格降至石油产品聚乙烯的水平，前景乐观,66/93,生物技术生产PHAs的不同策略,67/93,5 生产单细胞蛋白,单细胞蛋白（single cell protein, SCP）是通过培养单细胞生物而获得的生物体蛋白质，又称微生物蛋白，包括细菌、放线菌中的非病原菌、酵母菌、霉菌
18、和微型藻类等 可利用各种废物，如碳水化合物、碳氢化合物、石油加工副产品等，在适宜的培养条件下生产微生物蛋白 营养丰富，蛋白质含量高达40%80%，含有多种氨基酸、维生素、脂类、矿物质、碳水化合物等,68/93,微生物与动物生产蛋白质速率的比较,农业、林产或家畜工业的废弃物，甘蔗、甜菜糖厂的废糖蜜，造纸厂的亚硫酸盐废液，纤维素水解液，酒精废液，食品发酵废液等均可用作原料,69/93,单细胞的化学组成（干物质）,微生物菌体的70%85%为水分，干物质中的主要成分是糖类、蛋白质、核酸、脂类及灰分,70/93,微生物细胞和传统食品中的氮含量和蛋白质含量,71/93,干酵母中典型氨基酸组成,72/93,
19、酵母的典型元素组成,73/93,细菌、真菌和藻类生产的单细胞蛋白组分的比较,74/93,黑曲霉细胞的氨基酸含量与FAO标准非常相符,75/93,生产单细胞蛋白的微生物,76/93,生产单细胞蛋白的微生物,77/93,藻类、细菌和真菌生产单细胞蛋白各种参数比较,78/93,生产单细胞蛋白的微生物优缺点,细菌：生长速度快，蛋白质含量高，能利用糖类和烃类，但细菌个体小，分离困难，且蛋白质不如酵母菌易于消化吸收 丝状真菌：易于回收，但生产速度慢，蛋白质含量较低 藻类：缺点是其纤维质的细胞壁不易为人体消化 酵母：个体大，易于分离、回收，且蛋白质易于吸收，目前生产上采用较多,79/93,微生物生产单细胞蛋
20、白的优点总结,生长速率快，倍增时间为几个小时 容易进行遗传操作，宜于大规模筛选和转基因技术实施 蛋白质含量高，营养价值高 能在相对小的连续发酵反应器中大量培养，占地小，不依赖气候 培养基来源广泛，低廉，可利用废料,80/93,用于生产SCP的常见废弃物,农业废弃物，需经粉碎、碱处理以提高可消化性 烃类及其衍生物，包括石油烃、天然气及其氧化物如甲醇、乙醇、乙酸等 高浓度有机废水，如造纸工业的亚硫酸盐纸浆废液、制糖工业废水、酿造业废水、乳品工业废水、屠宰场废水等 固体废弃物，包括城市有机垃圾、造纸厂废弃物、酿造废弃物酒糟、水产加工废弃物，食品加工中的废物等 工业废气，如工业上排放的二氧化碳可用于培
21、养藻类；石油加工厂废气中的烷烃，可先转化成酒精、甲醇、乙酸等，再用于生产SCP,81/93,利用有机废料生产单细胞蛋白,82/93,利用有机废料生产单细胞蛋白,83/93,单细胞蛋白生产工艺,1. 亚硫酸盐纸浆废液生产SCP 废液中含有 不同磺化程度的与高分子聚合的木质磺酸 半纤维素分解的产物 以单糖及多糖解聚的中间物的形态而存在的纤维素 挥发性有机酸（甲酸、乙酸） 酒精（乙醇、甲醇） 树脂，糖醛等 有机物含量达87%-90%，其中糖占22%-28%,84/93,Pekilo工艺流程,85/93,2. Waterloo单细胞蛋白生物转化法 采用纤维质为底物 生产的为真菌蛋白 生产费用低,86/
22、93,Waterloo单细胞蛋白生物转化的综合流程图,87/93,降低单细胞蛋白中核酸含量的方法,88/93,3. 其他工艺 利用城市垃圾生产单细胞蛋白,89/93,利用动物饲养场废料生产单细胞蛋白,90/93,单细胞蛋白生产中应该考虑的问题,降低核酸含量，以免尿酸积累过高影响健康 检测可能含有毒物质的存在（重金属、生物毒素等） 微生物的可消化性好，营养价值高 相较大豆蛋白而言较为昂贵，进一步降低成本,91/93,单细胞蛋白的安全性评价,FAO，WHO，ISO均建立了单细胞蛋白委员会，制定评价标准 生产用菌株不能是致病菌 不产生毒素 生产原料有一定要求，如石油原料中芳香烃的含量、农产品中重金属和农药残留 培养过程无污染，无溶剂残留和热损害 最终产品无致病菌，无活细胞，无原料和溶剂残留 动物实验+临床实验,92/93,单细胞蛋白的营养性评价,SCP粗蛋白质含量与氨基酸组成,93/93,生物价：被生物吸收的蛋白质与留在动物体内的供生长和维持生命部分的比例，其值越高蛋白质质量越高,