《人胰腺癌肿瘤干细胞体外增殖能力及耐药性的研究.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《人胰腺癌肿瘤干细胞体外增殖能力及耐药性的研究.doc（10页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、人胰腺癌肿瘤干细胞体外增殖及耐药的研究陈锦鹏 王志伟 陆玉华 陆俊杰 钱海鑫*【摘 要】目的 研究胰腺癌肿瘤干细胞体外增殖能力及其对化疗药吉西他滨耐受性。方法 以CD44+CD24+ESA+为表面标记，用流式细胞仪，在人胰腺癌Panc-1细胞系中分选肿瘤干细胞，接种在96孔板中，用CCK8法检测其体外增殖能力，描制生长曲线，用吉西他滨分别干预普通肿瘤细胞和肿瘤干细胞，比较分析化疗药刺激对两种细胞生长的影响，并计算IC50值。结果 CD44+CD24+ESA+阳性细胞生长速度明显慢于Panc-1细胞，呈干细胞球样缓慢生长，其对吉西他滨抑制试验不如Panc-1细胞敏感。结论 .肿瘤干细胞在体外培养
2、中表现缓慢生长及为耐受化疗药物的干细胞特性。关键词：胰腺癌，肿瘤干细胞，吉西他滨，耐药性【Abstract】 Objective To study the proliferation and drug -resistence ability of pancreatic cancer stem cell in vitro. Methods Isolate pancreatic cancer stem cells of CD44+CD24+ESA+ phenotypes by a FACS Aria II in human cell line Panc-1. To investigate prol
3、iferation ability of cancer stem cell, we draw a growth curve by ways of CCK8 staining. To detect the ability of drug-resistence of cancer stem cell, we stimulated both cells by gemcitabine and study the difference of their IC50.Results Panc-1 Cell and CD44+CD24+ESA+ cells were restrained by gemcita
4、bine. In 48th hour IC50 of Panc-1 cell is 982g/ml, IC50 of CD44+CD24+ESA+ is 1981g/ml. In 72th hour IC50 of Panc-1 cell is 670g/ml, IC50 of CD44+CD24+ESA+ cell is 1484g/ml Conclusions Cancer stem cell perform a stem cell-like characteristic of declined proliferation and highly drug-resistence.Keywor
5、ds Pancreatic cancer，Cancer stem cell，gemcitabine，drug-resistence 基金项目 国家自然科学基金资助课题（ 81101615）江苏省自然科学基金（BK2010276）作者单位 陈锦鹏 南通大学附属医院 苏州大学医学院博士研究生通信作者 钱海鑫 苏州大学附属第一医院10 胰腺癌在癌症致死病因中排在第四至第五位，其五年生存率不足5%，中位生存期仅6个月1。胰腺癌最让人头疼的问题之一是他对传统治疗手段普遍耐受2,3，很多研究发现，在接受传统放化疗之后胰腺癌开始变得耐药，使预后变差4。 目前人们对胰腺癌的传统治疗无法改变这一现状，而基于胰腺
6、癌手术标本和细胞系的基因表型和蛋白表达方面的研究5也未取得令人满意的结果。研究者们在不断尝试着胰腺癌治疗的新方法，他们希望通过胰腺癌干细胞的研究，发现干细胞特有的标记物，从而特异性的杀灭肿瘤干细胞。一系列的研究将矛头指向了可能存在并发挥关键作用的胰腺癌干细胞，胰腺癌干细胞属于肿瘤干细胞(Cancer Stem Cell, CSC)，他们能自我更新和多向分化，并且还有强大的侵袭、转移和耐药的能力。本研究旨在探索并阐明胰腺癌肝细胞的生物学特性，为胰腺癌的治疗打开新的思路。 1.材料与方法 1.1 主要材料 人胰腺癌细胞系Panc-1（ATCC来源） 购自上海中科院细胞库。DMEN高糖培养基、DME
7、M/F12培养基购自Hyclone公司，成纤维细胞生长因子（FGF）、表皮细胞生长因子（EGF）购自Prospec公司，抗人CD44-APC、CD24-PE、ESA-FITC流式荧光抗体购自BD公司，羊抗兔FITC二抗购自Jackson公司,流式细胞分选仪(FACS Aria II)购自BD公司，荧光定量PCR仪7500购自ABI公司,Lilly France 。1.2 实验流程与方法1.2.1 人胰腺癌细胞的培养和胰腺癌干细胞的获得 将人胰腺癌细胞株Panc-1细胞接种于含10胎牛血清的DMEM高糖培养基、青霉素(1105UL)和链霉素(100mgL)组成的培养基中， 5CO2，饱和湿度，恒
8、温37培养，达到对数生长期后，用0.25胰酶消化，完培重悬，离心弃去上清后，PBS液重悬细胞并计数。每1106个细胞分别加入20L抗人CD24-PE、抗人CD44-APC和抗人ESA-FITC抗体，室温避光孵育30 min。对照组不加抗体。应用流式细胞仪进行检测及分选。每次细胞分选后重复上机一次，保证分选后的干细胞纯度95。将分选得到CD24+CD44+双阳性细胞和CD24+CD44+ESA+三阳性细胞，分别种于无血清细胞培养基中（DMEM/F12培养基+10ng/mL成纤维细胞生长因子+20ng/mL上皮生长因子+ITS+1105u/L青霉素+100mg/L链霉素），培养在5CO2，饱和湿度
9、，恒温37培养箱内。1.2.2 CCK8法检测细胞耐药性 将Panc-1细胞和CD24+CD44+ESA+细胞分别接种于96孔板，浓度为1X105细胞/ml，每孔加100l，设只加培养基的空白对照，只加培养基和细胞的阴性对照，板边缘的孔中加入PBS液，在37，5%CO2，饱和湿度条件下培养。24H后加入化疗药吉西他滨，药物终浓度分别为为50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml。加入化疗药后48H取出细胞用CCK8法测相应时间试验孔的OD值，加药后72H重复。每个浓度下的抑制率=1-（测得OD值-空白对照OD值）/(阴性对照-空白对照OD值)x1
10、00%。同一时间点Panc-1细胞与肿瘤干细胞抑制率采用配对资料t检验统计分析。将每个浓度的抑制率输入Sigmaplot10.0软件，得到拟合曲线，通过拟合曲线计算抑制率为50%时的药物浓度，即半数抑制率（IC50），得到吉西他滨在加药后第48H和72H时对该种细胞的IC50值。2. 结 果2.1 胰腺癌细胞的培养和干细胞的获得 普通胰腺癌Panc-1细胞在含10%FBS的完培中呈梭形，贴壁生长，增殖较快，约2-3天传代（见图1）。分选出的CD24+CD44+ESA+细胞在含有生长因子的无血清培养基中均为悬浮，呈球状生长，增殖速度较慢（见图3)。以CD24、CD44、ESA为标记物，在人胰腺癌
11、Panc-1细胞中分选CSC，阳性细胞比例在0.1%-0.8%之间。 图 1 胰腺癌Panc-1细胞（200x） 图 2 CD44+CD24+ESA+生长（200x用CCK8法测Panc-1及CD24+CD44+ESA+细胞OD值，并描绘生长曲线，发现Panc-1细胞在第2-3天进入对数生长期，第4天数量达到最大值。CD24+CD44+ESA+细胞在第5天仍未明显进入对数生长期，一直呈缓慢扩增状态。统计学分析t=3.306，P100ng/ml的组开始出现抑制，Panc-1细胞生长抑制明显，光镜下细胞数量减少，形态变瘦长。在加药达到2000ng/ml时，两种细胞均出现明显生长抑制，数量减少超过一
12、半。在用CCK8法检测测OD值，并计算生长抑制率，用配对资料t检验，t=2.69，P0.05,两种细胞抑制率差异有统计学意义，在加药后48H吉西他滨对Panc-1细胞生长抑制作用强于CD24+CD44+ESA+细胞。见表1、图4表 1 吉西他滨对Panc-1细胞和肿瘤干细胞在48H的生长抑制率(%)浓度(ng/ml)501005001000200048H Panc-112.803.3114.564.2434.244.2168.486.2983.044.3548H 干细胞2.234.315.185.616.526.226.795.951.566.6图 4 检测48H吉西他滨对Panc-1细胞和肿
13、瘤干细胞生长抑制率（t=2.69，P100ng/ml的组开始出现抑制，Panc-1组明显，在2000ng/ml组，均出现明显抑制。检测并计算生长抑制率，用配对资料t检验，t=4.38，P0.01两种细胞抑制率差异显著，在加药后72H吉西他滨对Panc-1细胞生长抑制作用强于CD24+CD44+ESA+细胞。见表2、图5表 2 吉西他滨对Panc-1细胞和肿瘤干细胞在72H的生长抑制率(%)浓度(ng/ml)501005001000200072H Panc-120.447.726.096.864.276.481.887.191.394.772H 干细胞-1.485.417.344.328.128
14、.735.315.164.488.5图 5 检测72H吉西他滨对Panc-1细胞和肿瘤干细胞生长抑制率（t=4.38，P0.01）将上述生长抑制率输入软件Sigmaplot10.0，得到四条拟合曲线，48H时，Panc-1，f（x）=0.041x+10.7；干细胞，f（x）=0.023x+4.42；72H时Panc-1，f（x）=0.042x+21.82；干细胞，f（x）=0.03x+5.46。求得在48H和72H时，吉西他滨分别对两种细胞的IC50，发现肿瘤干细胞在不同时间点的IC50均大于普通肿瘤细胞，说明肿瘤干细胞的高耐药性。见表3表 3 吉西他滨对两种细胞的半数抑制率（IC50）（ng
15、/ml）时间干细胞Panc-1细胞48H198198272H1484670三 讨 论在欧美国家，胰腺癌在癌症致死病因中排在第四位，其五年生存率不足5%，中位生存期仅6个月5。目前人们对胰腺癌的传统治疗无法改变这一现状，而基于胰腺癌手术标本和细胞系的基因表型和蛋白表达方面的研究2也未取得令人满意的结果。一系列的研究将矛头指向了可能存在并发挥关键作用的胰腺癌干细胞，胰腺癌干细胞属于肿瘤干细胞(Cancer Stem Cell, CSC)，CSC在某些特性上与干细胞十分类似，他们能自我更新和多向分化，并且还有强大的侵袭、转移和耐药的能力。在2007年Li6的研究小组首次报道以CD24+CD44+ES
16、A+为标记分离出胰腺癌干细胞，并通过细胞行为学的方法验证其为具有干细胞特性的肿瘤细胞。经典的肿瘤模型认为肿瘤的发生是随机的，正常的组织中的任何细胞，在外界环境的刺激下发生着变异，当DNA的突变累积到一定程度，就会产生肿瘤7。这一模型强调了肿瘤细胞的均质性，所有细胞都具有同样的快速增殖和高侵袭性的特点，因此传统的非手术抗肿瘤治疗往往针对的就是这一类快增殖细胞，但传统治疗方法对很多肿瘤束手无策。肿瘤干细胞模型认为肿瘤具有异质型，当正常干/祖细胞的自我复制和多向分化的功能失控，就成为了所谓的肿瘤干细胞，这类细胞在体内不对称的分裂成新的干细胞和普通肿瘤细胞，从而产生肿瘤。许多信号通路已被证明与肿瘤细胞
17、的自我复制和多向分化能力有关，包括Notch8，Wnt/-Catenin9、10，Hedgehog11、12和BMI-113。肿瘤干细胞模型的提出很好的解释了传统手段治疗肿瘤是遇到的复发、转移和耐药的问题，肿瘤干细胞往往处于静止期，能有效逃避放化疗的攻击14。吉西他滨（gemcitabine，GEM）已经成为晚期胰腺癌的一线化疗药物，但疗效仍不理想，获得性的化疗耐受是胰腺癌化疗失败的主要原因之一15。本实验中，我们从人胰腺癌细胞株Panc-1细胞中，通过流式细胞仪，成功地分选出CD44+CD24+ESA+细胞，其无血清培养基中呈干细胞球样生长，这与文献报道的CSC的干细胞样特征相符合，说明胰腺
18、癌干细胞的确存在。体外扩增实验数据表明，作为胰腺癌干细胞的CD44+CD24+ESA+细胞，其体外扩增的速度远低于Panc-1细胞，证明了胰腺癌干细胞往往处于静止期，其生长速度远低于普通肿瘤细胞。在吉西他滨抑制实验中，我们发现吉西他滨对Panc-1细胞生长抑制作用强于CD24+CD44+ESA+细胞，其48、72小时抑制率，用配对资料t检验进行统计分析，P值均小于0.05,两种细胞抑制率差异有统计学意义。对其半数抑制率的统计分析发现，发现肿瘤干细胞在不同时间点的IC50均大于普通肿瘤细胞，说明肿瘤干细胞的高耐药性。本实验通过体外胰腺癌CSC的生物学特性研究，验证了胰腺癌CSC具有缓慢生长的特性
19、，并且较普通肿瘤细胞耐药性高。我们认为，胰腺癌的化疗之所以疗效不佳，主要在于普通胰腺癌细胞被化疗药物抑制杀灭，由于胰腺癌干细胞处于休眠状态，对化疗不敏感，化疗结束后可以再次分化形成新的肿瘤细胞，导致治疗失败。胰腺癌干细胞的研究为胰腺癌临床治疗带来了新希望，杀灭肿瘤组织中的干细胞就能从根本上消除胰腺癌复发、耐药，转移等一系列问题，达到临床治愈。但是目前还存在很多问题，有待进一步的研究。参考文献1 Jemal A, Siegel R, Ward E, Hao Y, Xu J, Murray T, Thun MJ. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 2008,
20、 58(2):71-962Ho MM, Ng AV, Lam S, Hung JY. Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stemlike cancer cells. Cancer Res. 2007, 67(10):4827-48333Ma S, Lee TK, ZhengBJ, ChanKW,Guan XY. CD133+ HCC cancer stem cells confer chemoresistance by preferential expression of th
21、e Akt/PKB survival pathway. Oncogene. 2008, 27(12):1749-17584Ischenko I, Camaj P, Seeliger H, Kleespies A, Guba M, De Toni EN, Schwarz B, Graeb C, Eichhorn ME, Jauch KW, Bruns CJ. Inhibition of Src tyrosine kinase reverts chemoresistance toward 5-fluorouracil in human pancreatic carcinoma cells: an
22、involvement of epidermal growth factor receptor signaling. Oncogene. 2008, 27(57):7212-72225 Jemal A, Siegel R, Ward E, Hao Y, Xu J, Murray T, Thun MJ. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 2008, 58(2):71-966 Li C，Heidt DG，Dalerba P，et alIdentification of pancre-atic cancer stem cellsJCancer Res，2007
23、，67（3）：103010377 Hezel AF, Kimmelman AC, Stanger BZ, Bardeesy N, Depinho RA. Genetics and biology of pancreatic ductal adenocarcinoma. Genes Dev. 2006, 20(10): 1218-12498 Leach SD. Epithelial differentiation in pancreatic development and neoplasia: new niches for nestin and Notch. J Clin Gastroenter
24、ol. 2005, 39(4 Suppl2):S78-829 Zeng G, Germinaro M, Micsenyi A, Monga NK, Bell A, Sood A, Malhotra V, Sood N, Midda V, Monga DK, Kokkinakis DM, Monga SP. Aberrant Wnt/beta-catenin signaling in pancreatic adenocarcinoma. Neoplasia. 2006, 8(4):279-28910 Pasca di Magliano M, Biankin AV, Heiser PW, Cano
25、 DA, Gutierrez PJ, Deramaudt T, Segara D, Dawson AC, Kench JG, Henshall SM, Sutherland RL, Dlugosz A, Rustgi AK, Hebrok M. Common activation of canonical Wnt signaling in pancreatic adenocarcinoma. PLoS ONE. 2007, 2(11):e115511 Tian H, Callahan CA, Dupree KJ, Darbonne WC, Ahn CP, Scales SJ, de Sauva
26、ge FJ. Hedgehog signaling is restricted to the stromal compartment during pancreatic carcinogenesis. Proc Natl Acad Sci. 2009, 106(11):4254-425912 Li C, Heidt DG, Dalerba P, Burant CF, Zhang L, Adsay V, Wicha M, Clarke MF, Simeone DM. Identification of pancreatic cancer stem cells. Cancer Res. 2007,
27、 67(3):1030-103713 Lee CJ, Dosch J, Simeone DM. Pancreatic cancer stem cells. J Clin Oncol. 2008, 26(17):2806-281214 Tang C, Ang BT, Pervaiz S. Cancer stem cell: target for anti-cancer therapy. FASEB J. 2007, 21(14):3777-378515Fryer RA，Galustian C，Dalgleish AGRecent advances and developments in treatment strategies against pancreatic cancerJCurr Clin Pharmacol，2009，4（2）：102112