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1、1,第二章 植物组织培养实验室和基本技术 2.1 组培实验室及基本设备 2.1.1 组培实验室的组成及其功能 2.1.1.1 准备室（基本操作实验室） 基本功能 常用仪器和设备,2,2.1.1.2 无菌操作室 功能 组成 缓冲室（间）： 接种室（间）： 无菌操作室的消毒 主要设备 超净工作台 金属器械消毒器,3,2.1.1.3 培养室 功能 主要设备 环境条件,2.1.1.4 温室 功能,4,5,2.1.2 组培实验室的布局 2.1.2.1 布局基本要求 便于隔离，便于操作，便于灭菌和便于观察。 2.1.2.2 基本布局规律 根据实验操作程序排列实验室； 接种室和培养室设在与外界环境隔离性好的
2、区域； 灭菌室与接种室相邻； 其他实验室的布局可根据条件，以方便使用为宜。,6,培 养 室,准 备 室,灭菌室,储藏室,接种室,缓冲室,植物组织培养实验室布局示意图,7,2.1.2.3 设计组培实验室时的注意事项 为了减少污染，实验室最好设一走廊且走廊上方最好安装紫外灯； 培养室最好设在南面，设大玻璃窗，以双层玻璃窗为最好。如果培养室是设在房屋的边侧，其东边或西边的墙上也可设置大玻璃窗； 培养室房间及门要小，而且密闭性要好，最好装移门； 无菌操作室要小，要设缓冲间，也最好装移门，且门要稍大一些。,8,2.1.3 组培实验室的基本设备 2.1.3.1 器皿和器械类 玻璃器皿 器械 镊子类 解剖刀
3、 剪刀 接种针 细菌过滤器,2.1.2.2 仪器设备 无菌操作设备 超净工作台,9,高压蒸汽灭菌器,10,电热烘箱 接种器具消毒器,11,12,培养设备 空调 加湿器和去湿机 定时器 培养架 摇床或旋转床 培养箱,药品贮存和配制仪器设备 冰箱 天平 酸度计 观察分析仪器设备 体视显微镜 普通光学显微镜 倒置显微镜 其它仪器设备 离心机 恒温水浴锅,13,14,2.2 培养基 组培中培养基的重要性： 基本培养基：指只含有维持离体植物细胞基本生命活动所需的营养成分的培养基。通常包括水分、无机营养成分和有机营养成分，不包括激素和天然有机附加物。 完全培养基：指在基本培养基的基础上另外附加激素或天然有
4、机附加物所组成的培养基。,15,2.2.1 培养基的构成 2.2.1.1 水 2.2.1.2 无机盐类 大量元素化合物 微量元素化合物 2.2.1.3 有机营养成分 糖类 维生素类 氨基酸类,16,2.2.1.4 植物生长调节剂 1、生长素类 常用类型：NAA,2,4-D,IBA,IAA 功能 培养基中常用浓度：10-710-5mol/L或 0.110mg/L,2、细胞分裂素类 常用类型：6-BA,KT.TDZ,2-ip 功能 培养基中常用浓度： 10-710-5mol/L或0.110mg/L,17,18,3、组织培养时，植物激素的使用规律 在生长素存在的条件下，细胞分裂素的作用有加强的趋势，
5、但二者在使用上有一定的顺序关系，处理顺序不同，培养物的分化状态也不同。规律如下： 先用生长素处理，后用细胞分裂素处理，有利于细胞分裂，但细胞不容易分化,容易产生多倍体细胞。, 先用细胞分裂素处理，后用生长素处理，细胞分裂也分化。 用生长素和细胞分裂素同时处理，细胞脱分化后分化频率提高。但二者的使用浓度比值可以决定器官分化方向：生长素/细胞分裂素比值高时，有利于根分化，抑制芽形成。反之，有利于芽分化，抑制根形成。比值适中时，促进愈伤组织的形成和生长。,19,20,2.2.1.5 天然有机添加物质 椰汁：CM 100150ml/L 酵母提取液：YE 0.01%0.5% 番茄汁：5% 10% 马铃薯
6、汁：100g/L 200g/L 香蕉泥（汁）：150mg/L 200mg/L,2.2.1.6 培养基的pH值 灭菌前pH值调控范围：pH=5.75.8 pH对培养基凝固的影响 pH调节剂 2.2.1.7凝固剂 琼脂： 用量范围：310g/L 影响琼脂凝固的因素 Gelrite：植物凝胶 2.2.1.8 其他添加物 活性炭（AC）、维生素C、抗生素等,21,22,2.2.2 基本培养基的选择 2.2.2.1 基本培养基的类型 高无机盐含量的培养基 代表类型：MS，LS，BL，ER 硝酸钾含量较高的培养基 代表类型：B5，N6，SH 中等无机盐含量的培养基 代表类型：Nitsch，Miller，H
7、 低无机盐含量的培养基 代表类型：White，WS，HE,2.2.2.2 基本培养基的选择 MS培养基 B5培养基 N6培养基 改良的White培养基 WPM培养基 培养基是否适合所培养的植物，必须通过试验进行筛选。,23,24,2.2.3 培养基的配制 母液稀释法 2.2.3.1 培养基母液的配制和保存 1、基本培养基母液的配制 单配法 混配法 按照避免难溶性沉淀形成的原则和物质种类的不同，将基本培养基配方所包括的物质进行分组；,25,基本培养基配方中物质划分组数的多少，即配制母液数的多少可根据实际情况而定，如MS培养基可以配制三液式、四液式、五液式等； 例如：MS培养基五液式 大量元素母液
8、 钙盐母液 微量元素母液 铁盐母液 有机营养成分母液,26,2、激素母液的配制 激素母液的浓度 110mmol/L或0.11mg/L 配制方法 生长素类 细胞分裂素类 培养基的保存,27,2.2.3.2 培养基的配制 水 准备 母液 混合定容 调pH 加入琼脂 糖 加热溶解 培养器皿 清洗 干燥 分装 封口 高压蒸汽灭菌 冷却 凝固 接种 培养基具体配制操作过程：P21,培 养 基 配 制 程 序,28,2.3 组培实验基本操作技术 2.3.1 器皿和器具的洗涤 P19 1.洗涤剂：无磷中性的肥皂粉、洗衣粉和洗洁精 2.常用清洗方法 洗涤剂清洗法 超声波清洗法,3.玻璃器皿的清洗 新购置的玻璃
9、器皿的清洗 用过的培养器皿的清洗 已经污染的玻璃器皿的清洗,29,30,2.3.2 灭菌 2.3.2.1 器具的灭菌方法 干热灭菌法 高压蒸汽灭菌法（湿热灭菌法） 火焰灼烧灭菌法 2.3.2.2 培养基的灭菌方法 高温蒸汽灭菌法 过滤除菌法,31,培养基灭菌方法 -湿热灭菌法 培养基湿热灭菌最少时间 液体容积（ml） 121所需时间（min） 20-50 15 75 20 250-500 25 1000 30 1500-2000 35-40,32,培养基高压蒸汽灭菌（湿热灭菌）操作 P20 灭菌后培养基的存放：,锅内加水,放入消毒桶,装入培养基,盖好锅盖,接通电源加热,排尽锅内冷空气,达到灭菌
10、温度时开始计时并保持足够长的时间,继续加热,切断电源,压力表指针归零时打开锅盖,取出培养基并存放好,33,高压蒸汽灭菌锅安全使用注意事项： 灭菌前外层锅内要加入足够的水,灭菌完成后要将锅内的水排放干净。 在灭菌过程中及灭菌后，压力表压力指针归零之前,不能打开锅盖,以免发生危险。 注意日常维护和检查,及时发现问题,及时修理，保证使用安全可靠。,34,使用高压蒸汽灭菌锅进行物品灭菌时的注意事项： 消毒锅内放置的物品要有一定的缝隙，便于高温蒸汽上下回流，达到良好灭菌效果。 锅内冷空气必须完全排尽，否则压力表的指针虽然达到了规定的压力，但由于锅内冷空气的存在，并不能达到相应的温度，因而影响灭菌效果。
11、进行培养基灭菌时，锅内达到规定的灭菌温度后，在严格保持灭菌温度的同时，还要严格保持灭菌时间。时间过长会破坏培养基内一些化学成分的有效性，时间过短则达不到灭菌效果。,2.3.2.3 无菌操作室内的灭菌方法 熏蒸灭菌法 射线灭菌法 2.3.2.4 外植体的表面灭菌 P29 化学消毒剂灭菌法 抗生素抑菌法,35,36,1.外植体灭菌的常用杀菌剂 良好的外植体灭菌效果的含义： 外植体灭菌后无菌率高，同时植物细胞不会受损伤或只是轻微受损伤而能保持正常生长。,37,2.外植体表面灭菌 外植体表面灭菌操作前的准备工作： 无菌水、漂洗瓶、切割用器皿（玻璃培养皿或不锈钢切割盘）和金属器具均经过高温高压灭菌并整齐
12、摆放在超净工作台上。 灭菌剂配制好并整齐摆放在超净工作台上。,38,39,外植体表面灭菌的一般过程 预处理：,外植体取材,备用,无菌水充分漂洗35次,无菌条件下，消毒剂处理,无菌条件下，70%酒精表面消毒30S60S,预处理,40,3.影响外植体消毒效果的因素： 消毒剂种类 消毒剂使用浓度 消毒处理时间 4.培养过程中污染原因及对策 污染的病原类型 污染发生原因 防污染对策,41,2.3.3 外植体的接种 1 定义 2 外植体接种操作前的准备工作 接种室的清洁和灭菌 超净工作台的清洁和灭菌准备 操作人员无菌操作前的准备 3 外植体接种的具体步骤,切割外植体,培养瓶倾斜靠近酒精灯火焰,瓶盖外部在
13、火焰上旋转灼烧数秒钟,旋开瓶盖，扣放在酒精灯旁边,瓶口在火焰上旋转灼烧数秒钟,用无菌镊子将外植体均匀放置在培养基上,瓶盖在火焰上灼烧两圈,盖紧瓶盖,42,43,44,45,2.4 离体培养体系的建立,供体植物材料的确定,外植体的选择,外植体的灭菌,外植体的培养,外植体的接种,46,2.4.1 供体植物材料的来源 田间材料 温室材料 无菌发芽材料 2.4.2 外植体的选择原则 再生能力强 遗传稳定性好 外植体来源丰富 外植体灭菌容易,47,2.4.3 常用外植体的种类 茎尖 带节茎段 节间部茎段 叶片和叶柄 鳞片,48,2.5 外植体的培养条件 温度 光照 湿度 培养基的营养物质和pH变化 培养
14、物的气体环境,49,第二章 作业： 组培实验室有哪些实验室组成，分别讲述这些实验室的功能？ 设计组培实验室有哪些注意事项？ 高压蒸汽灭菌锅安全使用注意事项？ 使用高压蒸汽灭菌锅进行各种器皿、器械及培养基灭菌时要注意哪些？ 培养基中的主要成分有哪几类？ 培养基中常添加的植物生长调节物质有哪两大类？各包括哪些常用种类？培养基中使用浓度范围？,50,培养基中经常加入的生长素类和细胞分裂素类物质各有何作用？这两类激素的使用规律如何？ 上述两类激素母液如何配制？激素母液浓度范围？ 培养基的配制程序？培养基配制过程中要注意哪些问题？ 已经污染的培养器皿如何清洗？ 外植体污染原因？ 污染的病原类型？ 防污染对策？ 影响外植体消毒效果的因素？,51,外植体的消毒步骤？ 外植体的接种定义？ 如何进行接种室清洁和灭菌？ 如何进行超净工作台的清洁和灭菌？ 操作人员无菌操作前的准备？,