猪冷冻精液应用的关键技术.ppt

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1、猪冷冻精液应用的关键技术,李兆华 博士 吉林省农业科学院 研究员 百钧达科技发展（北京）有限公司 技术顾问,目 录,一、猪冷冻精液的研究意义 二、使用猪冷冻精液的现状 三、冷冻稀释液配方技术 四、冷冻解冻程序技术 五、深部输精技术,一、猪冷冻精液的研究意义,一、猪冷冻精液的研究意义,延长猪精液的保存期限 常温液态保存精液：23天、57天、1015天 冷冻保存精液：原则上可长期保存 降低引种及饲养管理成本 2014年 能繁母猪4500万头 2.2窝/年 受胎率80% 常温液态精液：配种800头次 约12万头种公猪 冷冻精液： 配种4600头次 约2.1万头种公猪 减少公猪饲养量：约82%,一、猪

2、冷冻精液的研究意义,降低引种及饲养管理成本 以饲养100头种公猪的猪场为例： （1）1头公猪的引种费用6000元，使用冷冻精液可少引种82头公猪，引种费用可节省82头6000元=492000元。 （2）每头每天猪饲养费用10元，82头一天可节省82头10元=820元，每年可节省820365天=299300元。 （3）人工费用（饲喂+采精费用）：按2人计算，每天每人100元，一年2人可节省100元2人365天=73000元。 （4）疾病费用方面，每头猪药费成本每年100元，82头猪可节省药费82头100元=8200元。 以上这些直接节省的费用（即猪场的纯利）可达872500元。,一、猪冷冻精液的

3、研究意义,提高优秀种公猪的利用率 常温液态保存精液：可稀释成鲜精25-30瓶，可配13-15头母猪 冷冻精液：可制成冻精大约400-500支，可配60-80头左右母猪（深部输精） 冻精利用率比鲜精至少高5倍 使高性能种公猪与更多数量的母猪配种，大大提高了优质基因的覆盖面 促进品种改良，提高生产性能 冷冻精液便于储存、便于运输、便于使用，不受地域、时间的限制，便于跨区域、跨国引入优秀的种质资源，辐射区域可全球化，打破了鲜精使用区域辐射小的限制。有利于品种的改良，提高生产性能。,一、猪冷冻精液的研究意义,为生物安全提供保障 公猪冷冻精液可以在后裔测定或疾病检测后再开始大量供应，为稳定的遗传进展和严

4、格的生物安全提供保障。从健康角度考虑，冻精为疾病检测提供了足够的时间，冻精还能为大型的人工授精站暴发疾病时提供稳定的精液供应保障，并可实现无抗供种。 为了确保全球的生物安全，猪精液成功的冷冻保存对国际市场是必需的。并且全球养猪业最感兴趣的就是商业上可行的猪精液冷冻保存技术的成功开发。 濒临绝种的品种保种工作 其他 冷冻精液+体外受精体外胚胎生产体系，现代生物工程技术，如细胞核移植、胚胎早期性别鉴定、基因转移提供丰富的实验材料和基本技术保证,一、猪冷冻精液的研究意义,二、猪冷冻精液的研究现状,世界各国都在进行冷冻精液技术的开发 1956年，Ploge开始研究猪精液冷冻保存技术 1970年，Plo

5、ge首次报道，得到冻精生产的小猪 1971年，3个研究小组用干冰制作颗粒冻精 1975年，Pursel和westendorf分别以粒状和细管冷冻方法，成功冷 冻保存公猪精液 在19771979年，美国、瑞士、法国、匈亚利、西班牙利用冻精配种母猪达8001000头,英国、澳大利亚用冻精配种母猪50200头,二、猪冷冻精液的研究现状,我国从50年代初期开始对猪精液冷冻技术进行探索 1975年西安市草滩农场试配了8头母猪，有4头产仔,平均每窝8.9头。此后,广东、北京、上海、吉林、四川等省市也都相继研究成功。 1977年成立了全国猪冻精协作组。据统计,19751978年全国利用猪冻精进行人工授精,累

6、计配种母猪6079头,情期受胎率为42.1%61.3%。 据广西、北京、四川、黑龙江等6省市的统计数字表明,1986年冷冻精液累计配种母猪6万余头,第一情期受胎率达70%以上。,二、猪冷冻精液的研究现状,近几年 科研单位： 中国农业大学、朱士恩教授、吉林大学 周虚教授、西北农林科技大学 李青旺教授、东北农业大学 刘娣教授、上海农科院 张德福研究员、吉林省农业科学院 李兆华研究员 企业： 百钧达科技发展（北京）有限公司、温氏集团、,二、猪冷冻精液的研究现状,特别是 百钧达科技发展（北京）有限公司进两年来在猪冷冻精液保存技术研发取得突破性进展。 解冻后猪精子的活力使用只能容下单层精子活动空间的专用

7、精子计数板在显微镜同一焦距视野下，活力已经达到80%以上。38条件下可存活56小时。通过对近一年的冷配母猪进行统计，发情正常健康的母猪情期受胎率胎率达88.5%，平均产仔数11.2头（百钧达公司提供）。已经达到常温液态精液的繁育水平。,14年9月英国养猪协会出口负责人克瑞斯.杰克逊先生来访百钧达公司，参观猪冻精项目技术成果并给予高度肯定。,14年9月省农业厅张钰副厅长莅临百钧达公司指导猪冷冻精液技术项目，并给予后备支持,14年11月 河北省生猪产业体系首席专家张杰英所长、河北省畜牧站苗玉涛处长来百钧达公司考察猪冻精项目技术成果,14年种猪网董事长、国家猪常温精液生产与保存技术规范制定者孙德林教

8、授，多次来百钧达公司实地考察猪精液的冷冻技术及准胎成果，给予商品猪冻精技术为猪人工授精的第二次革命！,14年12月猪病研究专家、华中农业大学倪德斌教授来百钧达公司考察猪冷冻精液技术成果并给予高度的肯定,15年1月农业部畜牧总站资源保护中心、国家种畜禽质量监督检验测试中心刘丑生主任、赵俊金主任、朱芳贤总工程师来百钧达公司考察猪冻精项目技术,15年3月亚盛投资公司总裁、家育种猪集团创始人毛区健丽女士来访百钧达公司，参观猪冷冻精液项目技术成果，并与公司达成友好合作协议,15年4月美国mofa公司亚洲市场部主任、基础科技部主任吴卫东博士来百钧达公司考察猪冻精项目技术，给予“酷似鲜精”的好评！,15年5

9、月加拿大加裕集团亚太区商务总监林瑞先生来百钧达公司参观猪冻精项目技术,稀释液组成的分类 1、营养剂 如葡萄糖、果糖等 精子在保存过程中不停地进行着新陈代谢作用，为了补充精子的能量消耗，向精液中添加的能量物质。 2、抗冷冻保护剂 如甘油、DMSO、白蛋白等 保护精子在冷冻解冻过程中因温度变化造成的损伤，包括渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂。 3、其他保护剂 如各种抗氧化成分和抗生素等 保护精子不受各种不良环境因素的危害而添加的物质，包括缓冲物质、抗氧化物质和抑菌物质。 4、其他添加剂 如渗透压、酸碱平衡调节物质 改善精子所处环境的理化特性，以及提高精子存活率和受精能力。,三、冷冻稀释液配方的

10、研发,抗冷冻保护剂的研究 1、分类：渗透性冷冻保护剂、非渗透性冷冻保护剂 2、原理： 1）渗透性冷冻保护剂：在溶液中易结合水分子，发生水合作用。在细胞冷冻液完全凝固之前，渗透到细胞内，降低细胞内外结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤，同时细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水。 2）非渗透性冷冻保护剂：能溶于水，但不能进入细胞，因此能够提高细胞外渗透压，在冷冻过程中使细胞内的水分向细胞外渗出，引起细胞脱水而皱缩，减少细胞内冰晶的形成，从而保护细胞免受破坏。,三、冷冻稀释液配方的研发,抗冷冻保护剂的研究 3、常用渗透性冷冻保护剂 甘油、二甲基亚砜 (DMSO) 、乙二

11、醇（EG）、丙二醇（PROH）、二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基乙酰胺（DMA）、木糖醇、阿东糖醇等。 4、常用非渗透性冷冻保护剂 蔗糖、海藻糖、聚蔗糖、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 、聚已二醇(PEG) 、白蛋白等,三、冷冻稀释液配方的研发,抗冷冻保护剂的研究 5、冷冻保护剂的应用研究 1）甘油 是最常用的浓度标准 2）各种冷冻保护剂中，以EG和DMA.混合作为冷冻保护剂效果最佳，解冻后精子活率最高，顶体异常率，尾部畸形率均较低（邰秀林，1998）。 3）20 mL/L DMF+10mL/L甘油混合冷冻保护剂比单一使用甘油或DMF能起到更好的冷冻保护作用（张树山，2009）。 4）DMA可

12、以代替甘油作为渗透性保护剂,且以1% DMA、50解冻最佳（郭堂玉，2010）。 5）甘油、DMSO、乙二醇3种抗冻剂作为猪冻精的保护剂,结果表明，甘油作为抗冻剂时精子冻后活率最高，效果最好（李青旺，2003）,三、冷冻稀释液配方的研发,抗冷冻保护剂的研究 6、冷冻保护剂应用研究的方向 1）甘油与其它冷冻保护剂联合应用。 2）是从稀释液中除去甘油。 糖类和一些氨基酸被视为将来有效的冷冻保护剂。糖类如棉子糖、乳糖、及像PVP这样的多聚体和亲脂亲水性的物质：谷氨酸盐、脯氨酸等被视为潜在的冷冻保护剂。,三、冷冻稀释液配方的研发,其它保护剂的研究 1、抗氧化剂研究 1）精子的氧化损伤是 ROS 产生和

13、清除活动不平衡的结果 正常情况下，精液中清除 ROS依赖于精浆( SP) 的抗氧化物质，但在精液冷冻保存过程中，一方面精液离心使精子失去了 SP 抗氧化剂的保护作用， 导致精子处于易受氧化攻击的条件下； 另一方面冷冻过程又能诱导精子产生ROS。其中有缺陷和死精子是冷冻期间ROS 的主要来源。因此，冷冻很容易造成猪精子质膜过氧化损伤，从而降低冷冻精液的质量。 2）常用的抗氧化添加剂 甲基黄嘌呤类、丁羟甲苯、谷胱甘肽、超氧化物歧化酶和过氧化物酶、褪黑素或维生素 E 及其类似物等。,三、冷冻稀释液配方的研发,其它保护剂的研究 1、抗氧化剂研究 3）抗氧化剂的应用研究 （1）单独或联合添加褪黑素、谷胱

14、甘肽，均能减少精液冷冻过程中ROS的生成，显著提高冷冻精子解冻后的质量，其中联合添加效果显著优于单独添加效果（李博玲，2011）。 （2）在猪精液的冷冻稀释液中添加丁羟基甲苯（BHT）能够有效抑制精子质膜过氧化反应（Roca等，2004）。 （3）在冷冻稀释液中添加谷胱甘肽，可以提高解冻精液的精子活力和活率，降低膜蛋白巯基基团改变的精子数（Gadea等，2004） （4）Roca等（2005）证实,超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（CAT）可降低解冻后猪精液中ROS含量,单独或混合添加SOD和CAT显著提高了解冻后的精子活率。,三、冷冻稀释液配方的研发,其它保护剂的研究 2、其它保护剂的研

15、究 1）环糊精(HBCD)：在猪精液冷冻稀释剂 BF5 中添加HBCD, 可提高精子顶体和质膜的完整性, 并且精子活力也随着 HBCD 浓度的增加而显著提高。 2）透明质酸(HA)：精液冷冻稀释液中添加 HA 也能显著改善解冻后猪精子的运动学参数, 并在保持质膜稳定性方面发挥作用。 3）受精促进肽(FPP)：在提高猪冷冻精液的精子体外受精能力和糖苷酶活性等方面的作用也日益受到关注 4）中药提取物：应用川穹嗪（四甲基吡嗪）不仅可以显著降低冻后猪精子的畸形率， 而且可以明显提高冻后猪精子的顶体完整率。另外，随着川穹嗪浓度的上升，冻后精子的质量有逐步改善的趋势。,三、冷冻稀释液配方的研发,承载工具

16、1、颗粒：约0.1ml 2、细管：0.25、0.5ml小型细管和扁平管；5ml大型细管 3、5ml扁平塑料袋 冷冻解冻程序 1、颗粒精液的冷冻程序 1）新鲜精液在常温下，用不含甘油的I液稀释，然后平衡0.52小时 2）缓慢降温至15 维持4小时，再从15 经1小时降至5 3）用等温含甘油的II液进行稀释，然后用液氮熏蒸法制作冻精颗粒 高度：12cm，滴冻时间：60秒以内，平衡34分钟。,四、冷冻解冻技术的研发,冷冻解冻程序 2、细管和塑料袋的冷冻程序 1）新鲜精液在常温下，用不含甘油的I液稀释，然后平衡0.52小时 2）缓慢降温至15 维持3小时，然后离心（800g，10min），加入无甘油的

17、I液，缓慢降到5 ，平衡2小时，加入含甘油的II液，然后分装。 3）程序冷冻仪冷冻： 初始温度为5 ，以3/min降到- 5，保持1min，然后以50/min降到- 140，然后投入液氮保存。 4）液氮熏蒸冷冻： 高度5cm，时间20分钟。,四、冷冻解冻技术的研发,深部输精技术的分类 1、输卵管输精法（IOI） 主要指腹腔内窥镜人工授精技术，即利用腹腔内窥镜装置，通过微创手术，将精液直接输入到子宫与输卵管的连接部。是一种创伤较小的手术，但是，腹腔内窥镜相对于其它的人工授精器械较为复杂，成本也较高，需要较高的专业水平和极为熟练的技术操作，可以应用于要求较高的科研试验。,五、深部输精技术的应用,深

18、部输精技术的分类 2、子宫角输精法 又称子宫深部输精法（DUI）。子宫深部输精的输精管是将改良的柔韧纤维内窥镜管内置于常规的输精管而制成，这种DUI输精内管管长1.8m，外周直径4mm，内圈直径1.8mm。使用时先将商用常规输精管插入子宫颈形成子宫锁后，再在管内插入DUI输精内管，内管穿过子宫颈，能够顺着子宫腔前进，可将精子输送至子宫角近端1/3处。不仅节省精子量，还能够提高一些“脆弱”精子的使用效率，比如冷冻-解冻精子、性控分离精子等。早期的研究表明，母猪在发情到排卵的间隔时间上存在差异，使得一次子宫角输精方式在商业应用中极难操作，一般都采用两次输精的方法，或采用常规技术+子宫角输精技术相结

19、合的方式进行输精，母猪的产活仔数相近，可获得更高的妊娠率，也就是说子宫角输精法最好进行两次输精，并需结合常规输精技术。,五、深部输精技术的应用,深部输精技术的分类 3、子宫体输精法（IUI） 也称为子宫颈后人工输精（PCI），是将输入的精液越过母猪子宫颈直接送达子宫颈后的子宫体。现在常用的输精管有两种，一种是管内袋式，外观与普通输精管基本相似，但在输精管的顶部连接一个可延展的橡胶软管（置于输精管内部），在输精初期通过用力挤压输精瓶，使橡胶软管向子宫内翻出，穿过子宫颈而将精液导入子宫体内，如美国生产的AMG管；另一种是管内管式，在常规输精管内部加有一支细的、半软的、长度超出常规输精管约15cm的内导管，能够在常规输精管内部延伸以通过子宫颈进入子宫体。,五、深部输精技术的应用,部输精对环境刺激的要求 安静、放松，无需刺激。 解冻液的进一步研发 免疫抑制 人工授精后，子宫的免疫反应随之被激活，嗜中性粒细胞（PMNS）通过吞噬消化方式清除子宫内的精子。 在猪精液稀释液中可添加免疫抑制剂及其它成分，寻找调控人工授精诱导子宫局部免疫反应的方法，降低子宫局部免疫反应，增强精子获能和顶体反应，提高猪人工授精效率。,五、深部输精技术的应用,