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1、 反胶束法萃取玉米胚芽蛋白及其性质研究学 院： 食品与生物工程学院 专业班级： 食品质量与安全092班 姓 名： 叶洪雨 学 号： 2009057045 指导教师： 任健 教授 反胶束法萃取玉米胚芽蛋白及其性质研究摘 要玉米胚芽是一种优质的蛋白质资源，其蛋白含量在20%以上，但是目前尚未得到有效地利用。本文以玉米胚芽为原料，经过超临界CO2流体萃取技术脱脂后，采用反胶束萃取其中的蛋白质，并对提取工艺条件进行了优化，研究了玉米胚芽分离蛋白的结构性质和功能性质，并对其改善火腿肠品质进行了应用研究。反胶束萃取玉米胚蛋白分为前萃取和后萃取两个过程。经过对萃取工艺条件的优化，得出最佳前萃取工艺条件为：前
2、萃取条件为AOT浓度为2.19g/50mL异辛烷、萃取pH值7.17、萃取温度38，此条件下前萃取率为58.36%；通过响应面分析得出最佳后萃取工艺条件为： KCl浓度为1.14mol/L、萃取pH值为10.14和萃取时间为53min，此条件下后萃取率为64.57%，计算得蛋白总萃取率为36.15%。经浓缩、脱盐、冷冻干燥、洗涤等处理后，玉米胚芽分离蛋白蛋白纯度可达81.26%。研究了玉米胚芽分离蛋白的功能性质。结果表明：玉米胚芽分离蛋白溶解度在pH4时最低。在考察范围内，温度的升高和氯化钠浓度的增加有助于玉米胚芽分离蛋白的溶解。在等电点附近和碱性范围、温度在3050时，玉米胚芽分离蛋白黏度较
3、好。在温度在3050、NaCl浓度为0.15 mol/L时，玉米胚芽分离蛋白持水性较好。玉米胚芽分离蛋白在蛋白浓度较低、蔗糖浓度较高时表现出良好的起泡性和泡沫稳定性；蛋白浓度较低时，其起泡性优于大豆分离蛋白。玉米胚芽分离蛋白的吸油性、乳化性和乳化稳定性优于大豆分离蛋白，凝胶形成性略差。研究了玉米胚芽分离蛋白的化学组成和结构性质。结果表明：玉米胚芽分离蛋白中必需氨基酸含量丰富，其中Thr、Val、Phe和His的含量均高于FAO/WHO成人推荐值和儿童推荐值，Lys、Ile、Leu含量高于成人推荐值，略低于儿童推荐值。玉米胚芽分离蛋白中含有较多的疏水性氨基酸，是一种酸性蛋白质。凝胶层析分析表明玉
4、米胚芽分离蛋白主要含有五个组分，分子量分别为359109Da、81203Da、47750Da、31225Da、13352Da。玉米胚芽分离蛋白具有良好的耐热性和热稳定性，经差式量热扫描（DSC）分析表明玉米胚芽分离蛋白热变性温度为90.39，变性热为122.4 J/g。FT-IR图谱分析表明其二级结构中-折叠-转角和-螺旋含量分别是43.55、23.91和11.85。将玉米胚芽蛋白应用于火腿肠中，可明显提高火腿肠得率，并且可显著改善火腿肠感官品质和质构特性。关键词： 反胶束法；萃取；玉米胚芽分离蛋白；性质；应用目 录摘 要I目 录1 绪论11.1 玉米胚芽资源及其现状11.2 玉米胚芽粕资源及
5、其现状21.3 玉米胚芽蛋白研究现状31.3.1 玉米胚芽蛋白的分离提取31.3.2 玉米胚芽蛋白的研究进展41.3.3 玉米胚芽蛋白在食品中的应用研究51.4 反胶束法萃取蛋白质及研究现状61.4.1 反胶束法的提出与发展61.4.1 反胶束法原理61.4.1 反胶束法在食品中的应用91.5 本论文研究的目的和意义101.5.2 主要研究内容112 反胶束法萃取玉米胚芽分离蛋白的工艺研究122.1 引言122.2 材料与方法122.2.1 实验材料与仪器设备122.2.2 脱脂玉米胚芽粉制备132.2.3 脱脂玉米胚芽粉基本化学组成分析132.2.4 反胶束体系制备52132.2.5 反胶束
6、法萃取玉米胚芽蛋白工艺流程132.3 反胶束法前萃取玉米胚芽蛋白工艺研究142.3.1 前萃取单因素实验152.3.2反胶束法前萃取玉米胚芽蛋白响应面试验设计53152.4 反胶束法后萃取脱脂玉米胚芽蛋白工艺研究162.4.1 后萃取单因素实验162.4.2 反胶束法后萃取玉米胚芽蛋白响应面实验设计172.5 脱脂玉米胚芽分离蛋白的制备182.6 结果与讨论182.6.1 脱脂玉米胚芽粉基本化学组成分析182.6.2 反胶束法前萃取玉米胚芽蛋白工艺研究182.6.3 反胶束法前萃取玉米胚芽蛋白工艺优化212.6.4 反胶束法后萃取玉米胚芽蛋白工艺研究232.6.5 反胶束法后萃取玉米胚芽蛋白工
7、艺优化252.6.6 玉米胚芽分离蛋白的制备282.7 本章小结283 玉米胚芽分离蛋白功能性质研究293.1 引言293.2 材料与方法293.2.1 实验材料与仪器设备293.2.2 可溶性蛋白含量的测定303.2.3 溶解性的测定303.2.4 黏度的测定303.2.5 持水力（WHC）的测定68313.2.6 起泡性及泡沫稳定性的测定313.2.7 乳化性及乳化稳定性的测定323.2.8 凝胶形成性和吸油性的测定323.3 结果与讨论333.3.1 可溶性蛋白标准曲线测定333.3.2 溶解性测定333.3.3 黏度的测定363.3.4 WHC的测定393.3.5 FA及FS的测定42
8、4.3.6 EAI及ESI的测定463.3.7 凝胶形成性和吸油性的测定513.4 本章小结524 反胶束法萃取玉米胚芽蛋白结构性质研究544.1 引言544.2 实验材料与仪器设备544.3 玉米胚芽分离蛋白基本成分分析554.4 玉米胚芽分离蛋白氨基酸组成分析75554.5 玉米胚芽分离蛋白的营养指标估算554.6 凝胶层析法测定玉米胚芽分离蛋白的分子量分布564.7 玉米胚芽分离蛋白变性温度测定564.8 玉米胚芽分离蛋白FT-IR分析564.9 结果与讨论574.9.1 玉米胚芽分离蛋白基本成分分析574.9.2 玉米胚芽分离蛋白氨基酸组成分析574.9.3 玉米胚芽分离蛋白的营养指标
9、估算584.9.4 凝胶层析法测定玉米胚芽分离蛋白的分子量分布594.9.5 玉米胚芽分离蛋白变性温度测定614.9.6 玉米胚芽分离蛋白FT-IR分析624.10 本章小结635 玉米胚芽分离蛋白在火腿肠中的应用研究655.1 引言655.2 材料与方法655.2.1 实验材料与仪器设备655.2.2 火腿肠制作工艺流程655.2.3 加工制作方法73665.2.4 质量评价标准675.2.5 火腿肠得率的测定675.2.6 火腿肠质构性质的测定675.3 结果与讨论675.3.1 感观评价分析675.3.2 玉米胚芽分离蛋白对火腿肠得率的影响685.3.3 玉米胚芽分离蛋白对火腿肠质构性质
10、的影响685.4 本章小结72结 论73参考文献75-79-1 绪论1.1 玉米胚芽资源及其现状玉米胚芽的质量虽然仅占籽粒重量的10%15%，但是其营养价值远远高于胚乳，籽粒中22 %的蛋白质、84 %的脂肪和83%的矿物质都集中在玉米胚芽当中。与此同时，由于包含了籽粒中一半以上的油脂，因此玉米胚芽亦被作为一种油料资源，用于制取玉米胚芽油1。玉米胚芽油的油酸和亚油酸占80%以上，维生素含量也十分可观，同时具有预防皮肤病、提高肌体免疫力、促进伤口愈合的功能，具有很好的实用价值2。我国现有玉米淀粉厂年产量百万吨以上的厂家五百多家，对玉米淀粉副产物的综合利用水平很低，致使资源白白流失，降低了经济效益
11、，而且还带来环境污染。淀粉工业是国民经济中占重要地位的产业，生产淀粉时伴生了大量的副产品，这其中就包括营养价值较高的玉米胚芽。通常，作为玉米淀粉生产副产物的玉米胚芽未经加工或简单加工后，作为饲料饲喂畜禽，在一定程度上造成了植物蛋白资源的浪费3。玉米胚蛋白主要由白蛋白和球蛋白构成，含量超过60。其中有多于7.3水溶蛋白，79.9的碱溶蛋白，含醇溶蛋白1，4.6盐溶蛋白4。通过酶解测定，玉米胚芽蛋白质的生物学价值以及总蛋白或主要组成碱溶蛋白，均不低于酪蛋白和鸡蛋白。玉米胚芽蛋白的氨基酸构成符合国际卫生组织全价蛋白的规定值，近似于人奶和鸡蛋生物学价值5。玉米胚芽主要成分及玉米胚芽蛋白的必需氨基酸组成
12、见表1.1及表1.2。表1.1 玉米胚芽的成分（干基）Tab.1.1 Components of corn germ(dry basis)成分粗蛋白脂肪淀粉灰分粗纤维含量1324%3536%1822%716%25%表1.2 玉米胚芽蛋白的必需氨基酸组成（g/100g）Tab.1.2 Components of essential fatty acids on corn germ protein（g/100g）氨基酸鸡蛋玉米胚芽蛋白赖氨酸7.05.9色氨酸1.71.3苏氨酸4.74.1异亮氨酸5.44.0组氨酸2.23.4亮氨酸8.68.3苯丙氨酸酪氨酸9.36.7蛋氨酸半胱氨酸5.73.7缬氨
13、酸6.66.121世纪以来，国内外对玉米胚芽的综合利用研究逐步加深，以其为原料制备蛋白质添加剂，在实验研究中广泛应用于肉制品、焙烤食品中，在膨化小食品生产方面、医药、化妆品等领域也有所运用。但迄今为止，玉米胚芽粕的主要用途还是作为饲料或者是饲料添加剂，在食品中的应用实例很少6。1.2 玉米胚芽粕资源及其现状我国每年处理玉米量逾两千万吨，每百万吨玉米约能够分离出近七百吨玉米胚芽，玉米胚芽产量相当可观。作为玉米油厂的主要副产物，玉米胚芽粕是一种以蛋白质和玉米纤维为主的高营养物质。玉米胚芽粕中粗蛋白含量约为为23%25 %7，生物效价PER值与WHO/FAO推荐值相近，与大豆酪蛋白的营养价值相似，高
14、于大米和精制面粉，是一种优质的植物蛋白资源8，因此人类对玉米胚芽粕的重视日益加强。玉米胚芽榨油后，除油脂含量降低外，其他营养成分基本全部保留在胚芽粕中，但国内工厂一般对玉米胚芽粕做饲料处理，并没有较大发挥其潜在的生物价值9。玉米胚芽粕中各种氨基酸含量见表1.3。在世界资源日益消耗，蛋白资源日益缺乏的今天，积极采取有效措施加强对玉米胚芽粕的综合利用，将廉价的玉米胚芽蛋白转化为优质食品蛋白质具有较大的社会和经济意义。表1.3 玉米胚芽粕中各种氨基酸含量Tab.1.3 The content of fatty acids on defatted corn germ氨基酸类别占胚芽粕/%（干基）占胚芽
15、粕中蛋白质/%（干基）丙氨酸1.4 6.5 精氨酸1.3 5.8 天冬氨酸1.4 6.5 胱氨酸0.4 1.8 谷氨酸3.2 14.2 甘氨酸1.1 4.9 组氨酸0.7 3.1 异亮氨酸0.7 3.1 亮氨酸1.8 8.0 赖氨酸0.9 4.0 蛋氨酸0.6 2.7 苯丙氨酸0.9 4.9 脯氨酸1.3 5.8 丝氨酸1.0 4.4 苏氨酸1.1 4.9 色氨酸0.2 0.9 酪氨酸0.7 3.1 缬氨酸1.2 5.3 1.3 玉米胚芽蛋白研究现状1.3.1 玉米胚芽蛋白的分离提取（1）水相法采用纯水或者浓度较低的盐、酸、碱等水相将玉米胚芽蛋白从原料中分离出来，后续经过酸沉法、离心分离、低温
16、干燥等一系列的加工步骤，最终可得到玉米胚芽浓缩蛋白。加工工艺具有过程简单、低成本、操作方便等特点，但同时在大规模生产中也存在提取过程中蛋白容易变性、酸碱消耗量大、容易造成水资源浪费、污染环境等缺点，。（2）水相酶法是将水相法与酶技术两者联合应用于蛋白质提取，以达到提高蛋白提取率的方法。玉米胚芽酶解后，更有利于人体吸收，可作为消化系统功能不健全的特定人群的膳食蛋白来源。此方法中酶、酶制剂的成本较高。（3）有机溶剂法利用乙醇等有机试剂将原料中的植酸等非蛋白杂质除去而得到蛋白质的萃取方法。此方法弊端较多，例如工艺复杂、成本偏高、容易发生安全事故以及对产品空间结构及功能性质有不利影响等等，因此难以应用
17、于工业化生产。（4）双液相萃取法王车礼10等以粒度小于0.2 mm的菜籽粕为原料，采用水溶液：CaCl2和二氯乙烷为液选剂对原料进行处理，得到含量58菜籽蛋白。（5）渗滤、超滤法利用超滤膜对分离组分选择性，可达到浓缩、分离蛋白质的目的，并将其保留在截留物中，最终产品具有氨基酸组成较佳。但是，在加工过程中，超滤膜易被堵塞，分离效率不高，且超滤和渗滤处理盐溶球蛋白，使球蛋白沉淀。1.3.2 玉米胚芽蛋白的研究进展Zayas等比较了不同脱脂方式的玉米胚芽蛋白的溶解性，与传统的正己烷脱脂方式相比，采用CO2超临界萃取脱脂，玉米胚芽蛋白的溶解性明显提高11。同时，经实验证明玉米胚芽蛋白具有良好的乳化能力
18、和乳化稳定性，可以做为一种蛋白质添加剂用于食品中，用以改善食品性质、提高营养价值。Hung68等的研究表明：玉米胚芽蛋白的吸油性与脱脂乳粉和大豆浓缩蛋白相近，与乳清浓缩蛋白和酪蛋白钠盐相比要低12。因此，可将其作为做碎肉制品中的蛋白质添加剂，以提高产品品质，降低生产成本。通过比较大豆粉、脱脂乳粉、小麦胚芽蛋白粉、玉米胚芽蛋白粉的泡沫稳定性和发泡性，Bolnedi Vani发现玉米胚芽蛋白粉发泡能力最大，在30 min内，泡沫稳定性最好；蛋白质浓度、pH对玉米胚芽蛋白粉的发泡性和泡沫稳定性有所影响13。山东省农业科学院农产品研究所刘丽娜，王文亮14等在单因素试验的基础上采用响应面分析方法研究料液
19、比、温度、pH值和时间4个因素对玉米胚芽蛋白提取率的影响。通过中心组合试验设计，建立玉米胚芽蛋白提取数学模型。结果表明，影响玉米胚芽蛋白提取的主要因素依次是pH值、料液比、温度、时间；得到优化组合条件为：料液比1:10、温度55、pH10、时间120min。在此工艺条件下，玉米胚芽蛋白最高提取率为34.28%。陕西科技大学杨丽，王联结15等以玉米油副产物玉米胚芽粕为原料，采用高压蒸煮法对原料进行处理，经过处理后测定蛋白提取率。结果表明，经高压蒸煮处理后，蛋白质提取效果与浸泡48h再酶解的效果相当。处理后蛋白质含量均可达到42%。通过对比发现，高压蒸煮法比浸泡法大大节省了处理时间。江南大学李珺，
20、段作营16等玉米胚芽蛋白的提取以及水酶法提油的工艺进行了研究，研究结果表明，浸提时间、固液比、浸提温度分别为60min、110和45时蛋白抽提率最高，达到63.9%。齐齐哈尔大学王文侠17以干法玉米胚芽为原料，对玉米胚芽蛋白饮料的生产工艺进行了优化研究。结果表明：碱性蛋白酶对玉米胚芽蛋白质及其水解物提取具有明显促进作用。最佳工艺条件为：酶加量0.2%（质量百分比），料液比1：6，浸提pH7.0，浸提时间5h，浸提温度60。经过两次浸提后，取率可高达65.38%。东北农业大学肖志刚18等，利用5Na2SO3、70C2H5OH、0.4NaOH溶液和水，分步提取玉米胚芽中的分离蛋白质，对分离蛋白提取
21、工艺进行了优化。得出以下结论：反应时间40min，反应温度40，蒸馏水添加量35mL，清蛋白的提取率达39.35%41.17%；反应温度40，浸提时间30min，Na2SO3溶液添加量30mL，球蛋白的提取率达30.78%32.67%。1.3.3 玉米胚芽蛋白在食品中的应用研究（1）在肉制品中的应用脂肪与瘦肉在一定条件下可以形成乳化肉糜19，肉糜所具有的热稳定性可以保证在加热情况下水分和脂肪仍然能够保留在乳化肉糜中，因此，在肉制品中加入一定量的蛋白质可以提高肉糜稳定性。目前，应用较为广泛的蛋白添加剂有大豆蛋白、酪蛋白以及乳清蛋白等；在碎肉制品生产中，国内主要以大豆分离蛋白作为蛋白添加剂。李晶等
22、对玉米胚芽蛋白在乳化性碎肉制品中的应用进行了研究，并与大豆分离蛋白进行了对比，结果表明：玉米胚芽蛋白的凝胶型以及乳化稳定性由于大豆分离蛋白；对乳化性碎肉产品的得率、质构性能等影响效果类似于大豆分离蛋白20。Brown等在制作牛肉馅过程中，分别加入不同比例的玉米胚芽蛋白粉，研究发现肉馅的持油性和持水性有所增加，并且乳化稳定性得到了有效提高，产品组织特性有所改善；同时，感官评价表明：肉馅咀嚼性显著提高21。（2）在焙烤食品中的应用由于自身氨基酸组成均衡、必需氨基酸含量高，玉米胚芽蛋白可作为生产食品营养添加剂的原料，添加到焙烤食品中可以补充苏氨酸和赖氨酸、强化蛋白质22。籍保平等将玉米胚芽粉应用于面
23、包生产中，对玉米胚芽面包的面包团的发酵性能进行了研究，结果表明：玉米胚芽蛋白对面包团的发酵性能有显著影响。随着胚芽粉添加量的增加，面包发酵终体积现增加后减小；发酵时间减少23。Tsen等将玉米胚芽粉应用于营养强化面包生产中，研究发现，随着胚芽蛋白分添加量的增加，产品口感和外观与普通面包相似；随着添加量的继续增加，面包体积减小、膨松度下降24。（3）在饮料中的应用利用玉米胚芽进行蛋白饮料的生产，国内研究较多。无锡轻工大学的马晓军以玉米胚芽为原料，对玉米胚芽汁的生产工艺进行了研究。以玉米胚芽全胚为原料，直接生产玉米胚芽饮料，结果表明：产品口感细腻滑润、品质稳定、香味丰富25。高景华经过研究证明，将
24、脱脂玉米胚芽应用于蛋白饮料的生产开发是可行的，制作出的玉米胚芽蛋白饮料营养极其丰富，各项指标全部符合国家有关标准，制作过程中未添加防腐剂，是符合现代消费者心理的天然饮品26。（4）其他方面的应用陈雪梅等以大米胚芽、玉米胚芽、和小麦胚芽三种谷物胚芽为原料，添加比例为大米胚芽：玉米胚芽：小麦胚芽=0.665：0.024：0.311，选用papain进行酶解，水解度最高可达到12.28%。经评价，水解液口感良好，三种胚芽蛋白经酶解后，水解成氨基酸和小肽成分，便于人体吸收利用，可作为特定人群的膳食蛋白来源27。Peri等将牛奶蛋白、玉米淀粉与玉米胚芽粉（添加量85%，质量百分比）混合，生产的膨化小食品
25、，所得产品口感酥脆、营养丰富28。1.4 反胶束法萃取蛋白质及研究现状1.4.1 反胶束法的提出与发展传统的溶剂萃取方法难以满足生化分离的要求，而反胶束萃取技术的发展，为解决这一难题提供了一个可靠的途径。将反胶束技术用于蛋白质萃取分离这一设想最早是在上世纪80年代初期由Gitler和Montal29两位提出。几年后，Misiorowski30率先将酶成功增溶于反胶束中。1977年，Luisi等人首先提出用反胶束体系萃取蛋白质的概念，20世纪80年代，生物化学家对反胶束法萃取蛋白质的原理及工艺条件做了深入的研究。20世纪90年代，人们逐渐注意到反胶束萃取技术具萃取率高，条件温和，溶剂可重复利用，
26、具有成本低，操作简便，不会引起蛋白质和酶变性等优点，因此反胶束萃取法成为生物工程研究领域的热门技术31。在另一方面，反胶束萃取技术在酶系统中的应用也取得了较大进展，为酶反应提供反应场所，研究体系中酶的动力学特征、催化活性和稳定性等方面的基础理论；也可与化工染料等领域技术联用，应用于制备新的化工材料开发等方面。1.4.1 反胶束法原理反胶束(Reversed micelle)，也称逆胶束，是分散于有机相中的表面活性剂与连续的有机相相互作用，使得表面活性剂的亲水基和亲油基与有机相相互作用形成与正常胶束结构相反的含水聚合体。根据表面活性剂中基团的组成可以将其分为非离子型、阴离子性和阳离子型三种，它们
27、都可形成反胶束溶液3233。常用于形成反胶束的表面活性剂有AOT（2-乙基己基琥珀酸酯磺酸钠），CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）等，示意图见图1-2；而有机溶剂通常可用异辛烷、四氯化碳、环己烷、苯等34。在反胶束中，表面活性剂与水和平衡粒子共同构成一个球状体，活性剂极性头向内，与水分子结合，非极性尾向外与有机相结合，中间的水分子集合体成为“水池”(Water pool)，是蛋白质分离萃取或者酶催化固定的场所35，反胶束示意图见图1.1。图1.1 正常胶束与反胶束Fig 1.1 Micelles and reverse micelles反胶束法用于蛋
28、白质萃取分离时，可将分离萃取过程分为两步。第一步，萃取过程(forward extraction)，是目标从主体溶液转移至反胶束体系的过程；第二步，反萃取过程 (backwad extraction)，是目标产物从体系中转移至第二水相(或以固体的形式游离出来)的过程36。图 1.2 常用的三种表面活性剂分子Fig 1.2 structure of three types surfactantsa. AOT：阴离子表面活性剂 b. CTAB：阳离子表面活性剂 c. TritonX-100：非离子型表面活性剂蛋白质的表面电荷和反胶束内层表面电荷之间的静电作用、蛋白质的疏水性及反胶束的大小等因素影响
29、蛋白在反胶束“水池”内的溶解，进而对蛋白萃取率产生影响，对反胶束法萃取蛋白质萃取率产生影响的因素见表1.4。表1.4 影响反胶束萃取蛋白质的因素Tab.1.4 factors affected protein extraction rate by reverse micelles反胶束因素目标蛋白因素水相因素外在因素表面活性剂种类蛋白质的等电点pH值萃取体系的温度有机溶剂种类蛋白质的浓度离子强度萃取时间表面活性剂的浓度蛋白质分子的大小离子种类搅拌速度和方式助表面活性剂及浓度蛋白质表面电荷分布加水相的量其他物质的存在蛋白质在反胶束中的溶解模型通常有以下三种37：Luisi的水壳模型、Martin
30、ek的诱导契合模型以及固定尺寸模型，蛋白质在反胶束内部的溶解示意图见图1.3。图1.3 蛋白质在反胶束内的溶解模型Fig 1.3 model of protein dissolved in reverse micelles反胶束萃取蛋白质的主要动力来源有静电力（表面活性剂极性基团和蛋白分子之间相互作用力）、疏水作用以及空间位阻效应等38 ，并且已经通过试验得到证实。比如，Aires Barros、周富荣等经过研究证实了反胶束法萃取蛋白质的过程中蛋白质与表面活性剂和有机溶剂间的疏水相互作用39、蛋白质与表面活性剂之间的静电引力和亲和力40也起到了一定的作用。反胶束体系具有以下特征41：自发形成；
31、可溶解极性物质；热力学稳定；表面张力低（10-2mNm-1）；透明（反胶束的直径小于100nm）；粘度同普通有机溶剂相仿；比表面大。1.4.1 反胶束法在食品中的应用（1）分离蛋白质混合物由于蛋白质的种类来源不同，导致蛋白质分子在疏水亲水性、分子空间大小、表面电荷分布等方面产生差异，从而导致蛋白质在反胶束体系中的分配系数不同。根据蛋白质特异性的差别，可以相应的对萃取体系的相关参数进行调节，从而提高蛋白质的得率。Su等人42将反胶束体系应用于牛初乳乳清蛋白质的分离，结果表明：当蛋白质萃取缓冲液钠离子强度为0.1mol/L、pH 值为6.35时，可有效地将免疫球蛋白G与杂蛋白分离，使得90%以上的
32、免疫球蛋白G保留在后萃水相中。Goklen等43利用反胶束体系，成功地实现了细胞色素C、溶菌酶和-核糖核酸酶的分离。（2）同时分离油和蛋白质传统植物蛋白质提取方法工艺复杂，能源消耗大，而且提取过程中大量酸碱的加入容易导致蛋白质变性，极易造成资源浪费。反胶束法除了用于提取植物蛋白质之外，也可以用于油脂的分离。Leser等用以向日葵和大豆为原料，分别用反胶束法萃取其中的蛋白质44。结果表明：萃取过程中，蛋白质融入反胶束“水池”中，而油脂进入有机相中，有效地达到了蛋白和油脂同时分离的目的，然后再应用蒸馏法将油脂分离出来。陈复生等45用反胶束法同时萃取油脂和植物蛋白，并通过正交试验分析，得出最佳工艺条
33、件：萃取KCl溶液浓度 0.15 moL/L、萃取时间50min、AOT/异辛烷浓度16 g/100mL。（3）酶的分离和提取70年代，wells等首次提出反胶束中的酶蛋白仍具有活性，并在一定的pH值和离子强度等条件下，反胶束技术可提取酶蛋白46。其后，反胶束萃取酶蛋白的研究日新月异，发展迅速，国内外均有大量的研究报道。Chou等人47以鸡蛋为原料，采用AOT/异辛烷反胶束体系从中提取溶菌酶，溶菌酶活性可达天然状态的90%，酶活力达7.310-4 u/ mg。Krishnakant等人48采用AOT/异辛烷反胶束体系从全发酵液中提纯磷酸酯酶，经工艺优化后可使磷酸酯酶回收率达到29%。任虹等人4
34、9以CTAB/异辛烷反胶束体系萃取纤维素酶，经工艺优化后，酶的萃取率可达90%以上。（4）萃取氨基酸、维生素等功能性添加剂翁连进等50用二异辛基磷酸铵反胶团，在胱氨酸母液中萃取精氨酸和组氨酸。Ihara T等56用AOT/正戊烷体系萃取水溶性维生素。1.5 本论文研究的目的和意义我国是世界上主要玉米生产大国，总产量第二，玉米除少量食用外，大部分作玉米淀粉生产原料、饲料原料及酒精原料。玉米胚芽是玉米淀粉湿法加工的副产物，玉米胚芽蛋白质含量高，营养丰富，生物价PER值与WHO/FAO推荐值相近，高于大米和精制面粉，是一种优质蛋白资源。玉米胚芽蛋白的传统提取方法主要是水相法，生产过程中耗费大量酸碱，
35、容易造成蛋白质变性，并且水资源浪费现象严重；生产结束后排出大量含糖、纤维素等营养物质和酸碱废水，严重污染环境。因此，寻找一种提取率相对较高、不易造成蛋白变性、对环境污染较小的新方法，从而提高玉米胚芽蛋白的利用价值，开发新的蛋白资源，解决目前我国植物性蛋白资源不足的问题，是科研人员坚持不懈探索的课题之一。作为新型的分离技术，反胶束技术有液液萃取的传统优点，萃取条件温和，萃取效率高，不易引起生物活性物质的变性，具有高选择性，萃取成本低，溶剂可以重复利用，可以实现大规模操作，工业开发应用前景广阔。本论文以玉米胚芽为原料，经脱脂后用反胶束法萃取其中蛋白质，优化了萃取工艺，并对产品的结构性质、功能性质以
36、及在火腿肠中的应用进行了研究，为反胶束提取玉米胚芽蛋白的工业化提供理论依据和工艺参考。1.5.2 主要研究内容（1）分析玉米胚芽的组成成分；（2）反胶束法萃取（包括前萃取和后萃取）玉米胚芽分离蛋白的工艺研究；（3）研究玉米胚芽分离蛋白的组成及结构特性；（4）玉米胚芽分离蛋白功能性质的研究；（5）玉米胚芽分离蛋白在火腿肠中的应用研究。2 反胶束法萃取玉米胚芽分离蛋白的工艺研究2.1 引言反胶束萃取分离过程一般包括两步。第一步，萃取过程(forward extraction)，是目标从主体溶液转移至反胶束溶液中的过程；第二步，反萃取过程 (backwad extraction)，是目标从反胶束溶液
37、中转移至第二水相(或以固体的形式游离出来)的过程51。反胶束法萃取蛋白质主要受反胶束体系组成、反胶束的含水量w0、表面活性剂的浓度、外水相pH、离子强度、助表面活性剂、温度以及加料量等因素影响。本章节主要研究了玉米胚芽分离蛋白反胶束萃取的工艺及条件，同时分析了各因素对蛋白萃取的影响，进一步对萃取工艺进行了优化，确定了最佳萃取条件。2.2 材料与方法2.2.1 实验材料与仪器设备主要试剂：碳酸钠、氯化钠、盐酸、硫酸、氢氧化钠、硫酸铜、硫酸钾、异辛烷、AOT，均为国产分析纯药品。实验仪器分别见表2.1。 表2.1 主要实验设备Tab.2.1 Apparatuses in the experimen
38、ts仪器名称生产厂家722S可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司DVC数显粘度计美国Brookfield 公司透析袋（8000-10000）Sigma公司TGL-16G型高速离心机北京医用离心机厂PHS-Z型pH计上海第二分析仪器厂FD-1-54D冷冻干燥机德国伟利（LEYBOLD）全自动凯氏定氮仪瑞士步琪公司101-13S电热恒温鼓风干燥箱上海沪西仪器厂BS 124S电子天平北京塞多利斯仪器系统有限2.2.2 脱脂玉米胚芽粉制备玉米胚芽超微粉碎后，过100目筛，超临界CO2脱脂，CO2流速45kg/h，压力30MPa，温度45，脱脂时间5h，4下保存备用。2.2.3 脱脂玉米胚芽粉基本化学
39、组成分析粗蛋白的测定常量凯氏定氮法（GB 5511-85）；粗脂肪的测定索氏抽提法（GB 5512-85）；水分的测定105恒重法（GB 5497-85）；灰分的测定525灼烧法（GB 5505-85）;粗纤维的测定GB/T5009.10-85；总糖的测定蒽酮比色法。2.2.4 反胶束体系制备52称取一定质量的AOT，加入50mL异辛烷，室温下磁力搅拌器200r/min将其搅拌至溶解，再加入一定量的具有一定离子强度和pH值的缓冲液，继续搅拌30min，在 5000rmp下离心20min，得到的澄清透明的体系即为反胶束体系。2.2.5 反胶束法萃取玉米胚芽蛋白工艺流程准确称量一定量的脱脂玉米胚芽
40、粉（精确到0.001g）一定温度下磁力搅拌（200rpm）反胶束体系制备5000rpm离心20min上清液（即前萃液）前萃取待确定单因素：1. 反胶束体系AOT添加量2. 脱脂玉米胚芽粉添加量3. 前萃取温度4. 前萃取缓冲液pH取等量的前萃取液和具有一定离子强度和pH值的KCl缓冲液等体积充分混合一定温度下磁力搅拌一定时间静置分层取下层水相（即后萃液）后萃取待确定单因素：1. 后萃取缓冲液pH2. 后萃取缓冲液KCl浓度3. 后萃取时间2.3 反胶束法前萃取玉米胚芽蛋白工艺研究按照2.2.5流程对脱脂玉米胚芽粉进行萃取，测定前萃液蛋白含量，并计算前萃取率，计算公式见公式2.1。同时以以萃取前
41、的反胶束溶液作为空白对照。玉米胚芽蛋白前萃率（%）= (2.1)2.3.1 前萃取单因素实验（1）AOT浓度对玉米胚芽蛋白质前萃取的影响按照表面活性剂：异辛烷=1g5g：50mL配制反胶束体系，搅拌溶解后加入3mLpH 8.0的缓冲溶液，继续搅拌0.5h，4000rmp离心20min，加入一定量脱脂玉米胚芽粉。39磁力搅拌1.5h，4000rmp离心20min，取上清液（即为前萃液）测定蛋白含量并计算蛋白前萃率。（2）温度对玉米胚芽蛋白质前萃取的影响按AOT：异辛烷：缓冲液=2g：50mL：3mL制备反胶束体系，萃取温度取30，35，40，45，50，其他条件不变，测定前萃液蛋白含量并计算蛋白
42、前萃率。（3）玉米胚芽粉加入量对玉米胚芽蛋白质前萃取的影响按AOT：异辛烷：缓冲液=2g：50mL：3mL制备反胶束体系，玉米胚芽粉添加量为0.5g，0.75g ，1.0g ，1.25g ，1.5g，其他条件不变，测定前萃液蛋白含量并计算蛋白前萃率。（4）pH对玉米胚芽蛋白质前萃取的影响按AOT：异辛烷：缓冲液=2g：50mL：3mL制备反胶束体系，缓冲液pH分别为6、7、8、9、10，其他条件不变，测定前萃液蛋白含量并计算蛋白前萃率。2.3.2反胶束法前萃取玉米胚芽蛋白响应面试验设计53以单因素实验结果为基础，选择温度，AOT浓度，pH值三个因素为自变量，以蛋白提取率为响应值，设计三因素三水
43、平的响应面分析实验，因素变量见表2.3。无量纲的xi与自变量Xi换算公式如公式2-2所示： （2-2）其中：Xi：自变量变化步长； Xi：自变量的真实值； Xo：自变量在中心点的真实值； xi：自变量的编码值。采用SAS(Version 8.1，SAS Institute，Cary，NC，USA) 实验数据进行回归分析以及回归方程的参数估计。对实验数据采用回归方程： （2-3）其中A0为常数项，Ai，Aii，Aij分别代表一次项，平方项和交互项的回归方程系数，Xi、Xj是自变量，Y（蛋白后萃取率）为响应值。实验共包含15个实验点，其中有分析因子12个，中心实验3个。试验以随机次序进行，重复三次
44、，取平均值。表2.2 试验因素水平的选取Tab. 2.2 Independent variable and their levels employed in Box-Behnken experimental design因素编码水平因素取值AOT质量/gpH温度/X1X2X3-101-101-1011236783035402.4 反胶束法后萃取脱脂玉米胚芽蛋白工艺研究取一定体积2.2.5所制备的前萃液和具有一定离子强度和pH值的KCl缓冲液按体积比1:1混合，40、200rpm磁力搅拌20min，静置分层后取下层水相（即为后萃液），测量体积，取5mL后萃液定氮（以未添加脱脂玉米胚芽粉的反胶束后萃取液作为空白对照）。蛋白后萃取率由下式计算：玉米胚芽蛋白后萃取率（%）= （2-4）2.4.1 后萃取单因素实验（1）萃取时间对脱脂玉米胚芽蛋白后萃率的影响按体积比1:1将前萃液与pH 10.0的后萃取缓冲液均匀混合，39下磁力搅拌一定时间（20、30、40、50、60min），静