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1、禽流感病毒中和实验及其他方法（一）实验材料1、中和反应实验材料(1)病毒：一般为鸡胚尿囊病毒液，进行中和实验前，需要进行病毒滴度（TCID50）的滴定。(2)血清样品包括待检血清和阳性以及阴性对照血清。人血清实验前需要56 30分钟灭活，动物血清需RDE处理。20储存，避免多次反复冻融。(3)MDCK细胞和细胞培养试剂1)MDCK细胞（狗肾上皮细胞）2)MDCK细胞培养液：DMEM+5%牛血清+抗生素，过滤除菌500毫升 DMEM（修饰的Eagles培养基）5.5毫升 100抗生素（100单位/毫升青霉素+100微克/毫升链霉素）5.5毫升 100LGlutamine（2毫摩尔）25.5毫升
2、56、30分钟加热灭活的牛血清3)胰酶 / EDTA(4)其它1)平底96孔微量培养板2)病毒稀释液：DMEM+1%牛血清白蛋白+抗生素，即配即用。 429毫升 DMEM 66毫升 7.5%牛血清白蛋白（BSA） 5毫升 100抗生素3)TPCK胰酶（使用浓度为2微克/毫升）4)固定液：80%的丙酮，即配即用，4保存 400毫升 丙酮 100毫升 PBS，PH 7.22、ELISA实验材料(1)抗体1：鼠抗流感病毒甲型核蛋白克隆抗体(2)抗体2：辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(3)洗涤液：PBS+0.05%TWEEN20 4升 PBS，PH 7.2 2毫升 TWEEN20(4)封闭液：PBS
3、+1%牛血清白蛋白+0.05TWEEN20 867毫升PBS，PH 7.2 132毫升牛血清白蛋白 1毫升TWEEN20(5)底物和底物溶液： 常用的辣根过氧化物酶（HRP）所用底物为磷苯二胺（OPD） 底物溶液为PH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液（0.05M） 底物和底物溶液：10毫克OPD 20毫升柠檬酸缓冲液（含0.015%双氧水） 即配即用 磷酸盐柠檬酸缓冲液，PH5.0 58.8克柠檬酸三钠 1升蒸馏水 用盐酸调节PH为5.0 加0.015%双氧水，（临用前加入） * 如果使用磷酸盐柠檬酸缓冲液胶囊（Sigma）1个胶囊加入100毫升蒸馏水，临用前配制(6)终止反应液：1N硫酸（28毫升浓
4、硫酸+1升蒸馏水）3、其他细胞培养和酶联免役吸附实验的常用设备和仪器（参照英文讲义）备注：A.以上实验材料购自Gibco,，Hyclone，Dynatech，Kirkegaard&Perry和Sigma公司，材料编号（CAT#）参照英文讲义。B.实验材料的配制，例如0.25%的胰酶等，请参照黄桢祥主编的医学病毒学基础及实验技术一书。（二）质量控制病毒中和实验技术是一个相当复杂的过程，参与中和反应的因素有病毒、抗血清和宿主细胞。这些因素的变化都会影响中和实验的结果。因此，对中和实验的整个过程进行严格的质量控制。每次测定必须设立阳性和阴性血清对照，阳性和阴性细胞对照，以及对病毒使用剂量进行滴定。1
5、、血清对照血清对照包括人或动物血清阳性和阴性对照。即血清中含有（阳性对照）或不含有（阴性对照）对测定病毒特异性的中和抗体。血清对照一般分装成多份，20保存，并避免反复冻融使用。(1)阴性血清对照1）动物血清一般来自未免疫或未感染动物，即与待检血清同种动物的正常血清。2）人血清一般来自与待检血清年龄相同的正常人群，该人群未曾暴露于待检病毒。3）测定过程中，阴性对照血清与待检血清应处于相同稀释水平。(2)阳性血清对照1）动物血清一般来自免疫后或感染后动物。2）人血清一般采用急性期和恢复期双份血清做对照。* 人血清使用前须经加热灭活处理，动物血清则须经霍乱滤液RDE（即受体破坏酶）处理，以排除非特异
6、性反应因素。2、病毒和细胞对照每次实验必须设立阳性和阴性细胞对照，以及对加入病毒工作液进行滴定检查，以便获得准确可靠的实验结果。(1)阳性和阴性细胞对照一般设立4个重复孔为阳性细胞对照，即将细胞与100倍组织细胞半数感染剂量（100TCID50）的病毒进行混合培养。同时设立4个孔为阴性细胞对照，即将细胞与病毒稀释液进行混合培养。阳性细胞对照：50微升病毒稀释液+50微升病毒+100微升MDCK细胞。阴性细胞对照：100微升病毒稀释液+100微升MDCK细胞(2)病毒工作液滴度检查一般第1孔加入含有200TCID50的100微升病毒液，然后进行2倍稀释，再与MDCK细胞进行混合培养。病毒滴度检查
7、：50微升2倍系列稀释病毒液（第1孔为100TCID50） +50微升病毒稀释液+100微升MDCK细胞（1.5104细胞/孔）（三）实验步骤1、病毒滴度测定（组织培养半数感染量TCID50滴定） (1)流感病毒制备利用鸡胚尿囊腔接种法制备流感病毒，收获尿囊液，血凝实验测定病毒的存在，分装后70冻存。(2)病毒的稀释1)取1管冻存病毒尿囊液，1:100稀释（100微升病毒液+9.9毫升稀释液）2)第1排孔加入146微升1:100稀释过的病毒液，然后做系列半对数稀释，使之成10-2、10-2.5、10-3、10-3.510-7。每孔含100微升病毒液，每个稀释度重复4孔，详细操作参见图1。* 人
8、流感病毒一般在胰酶存在的条件下才能感染MDCK细胞，因此病毒稀释液中需加入2微克/毫升的TPCK胰酶。某些毒性很高的禽流感病毒在无胰酶存在的条件下即可感染MDCK细胞，因此在测定新病毒滴度时，最好配制含有和不含有胰酶的两种稀释液，以获得最佳结果。(3)MDCK细胞的准备1)使用前2天将MDCK细胞1:100传代，使之7090%成片，处于对数生长期的细胞对病毒具有最大的敏感性，细胞过度生长以及代数太高（大于30代）将使细胞对病毒的敏感性降低。2)弃去细胞培养液，用5毫升胰酶 / EDTA洗细胞一次，然后弃去。3)加4到5毫升胰酶 / EDTA覆盖细胞（162cm2的细胞培养瓶）37 5%CO2温
9、箱中消化1020分钟。4)待细胞开始脱落时，加510毫升MDCK细胞培养液，吹打分散细胞，并将细胞转入离心管中，用PBS洗2次，以去除牛血清。5)将细胞悬浮于病毒稀释液中，用1毫升吸管充分吹打分散细胞，在细胞计数板上计数细胞数量。6)用病毒稀释液将细胞稀释成1.5105细胞/毫升。7)加100微升细胞（1.5104细胞/孔）于已稀释好病毒的微量细胞培养板中。8)在37 5%CO2温箱中培养1822小时。(4)测定组织细胞半数感染剂量（TCID50）1)弃去微量培养板中的细胞液，250微升PBS洗细胞一次。2)弃去PBS（不要让细胞干燥），加入100微升/孔固定液。3)覆盖微量培养板，于室温固定
10、细胞10分钟。4)弃去固定液，让微量培养板室温干燥。5)用ELISA检测细胞感染（参见ELISA部分）6)利用ELISA检测仪，于490纳米波长，测定每孔吸光度（OD）值，计数细胞阴性对照孔的平均OD值。7)若含有不同稀释度病毒孔平均OD值是细胞阴性对照孔平均OD值的2倍以上，则判断为病毒生长阳性。8)根据Reed和Muench方法对病毒滴度进行计算，最终获得TCID50/100微升（参见附录和表2）。9)在进行中和实验前，稀释病毒液，使之50微升中含有100TCID50流感病毒。2、病毒微量中和实验(1)待检血清的准备和稀释1)检测对一种病毒的中和抗体需要10微升血清，每份血清需要进行至少1
11、次重复测定（共需至少20微升血清/每种病毒），每块板可检测11份样品。2)人血清需56加热灭活30分钟。3)实验设计请参照图2。4)每孔中加入50微升病毒稀释液。5)第1排中（A1A11）再加入40微升病毒稀释液，使之成为90微升/孔。6)加入10微升待检血清于第1排A1A11。7)将待检血清作系列倍比稀释（AH）使之成为1:10、1:20、1:401:1280。(2)病毒的准备1)稀释病毒至100TCID50/50微升。根据病毒特性选择是否在病毒稀释液中加入TPCK胰酶（大约5毫升/每板）。2)除细胞阴性对照孔（4孔）外，每孔加入50微升病毒工作液。3)加50微升病毒稀释液于细胞阴性对照孔。
12、4)选择1列孔做病毒工作液滴度核实。第1孔加入200TCID50/100微升病毒工作液，做系列倍比稀释，使之成100TCID50，50，25，12，60.7。然后每孔加入50微升病毒稀释液，使体积至100微升/孔。5)摇匀病毒血清混合物，放37温箱作用2小时。(3)MDCK细胞的准备。（参见病毒滴定测定部分）加100微升细胞液（1.5104细胞/孔）于含有病毒血清混合物以及倍比稀释病毒工作液的微量板中，37温箱孵育1822小时。* 当测定大量样品时，每叠培养板一般不超过45块，各叠板之间要保持一定距离，以确保混合物受热均匀，从而达到良好的中和效果。(4)细胞的固定1)弃去微量培养板中的细胞液。
13、2)250微升PBS洗细胞一次。3)弃去PBS（不要让细胞干燥），加入100微升/孔固定液。4)覆盖微量培养板，于室温固定细胞10分钟。5)弃去固定液，让微量培养板室温干燥。3、酶联免疫吸附实验（ELISA）ELISA的基本原理是：酶结合物与相应抗体或抗原特异性结合，再遇酶底物时，在酶的强烈催化下使原来无色的底物产生化学反应，即形成有色的产物，便可用肉眼或分光光度计定量检测其含量。该方法具有特异性、敏感性、快速性和简易性等优点。在流感病毒微量中和实验中，酶结合物（HRP标记的羊抗鼠IgG抗体）与存在于MDCK细胞膜上的病毒核蛋白抗原-核蛋白单克隆抗体复合物结合，HRP酶催化OPD，使无色底物形
14、成橙黄色化合物，再由ELISA检测仪测定吸光度值，从而获得中和抗体滴度。(1)实验操作1)用250微升PBS洗涤微量培养板3次，以去除残余的丙酮。2)用封闭液1：4000（或最佳稀释度）稀释抗体1（抗流感病毒核蛋白-NP单克隆抗体）3)每孔加入稀释后的100微升抗体1，室温作用1小时。4)用250微升洗涤液洗板4次以除去抗体1。5)用封闭液1:2000（或最佳稀释度）稀释抗体2（HRP标记的羊抗鼠IgG）。6)每孔加入稀释后的100微升抗体2，室温作用1小时。7)用250微升洗涤液洗涤板6次以除区抗体2。8)每孔加OPD底物100微升（10毫升OPD+20毫升柠檬酸缓冲液+10微升30%双氧水
15、，即用即配）。9)室温放10分钟左右显色，直至细胞阳性对照孔变橙黄色，而细胞阴性对照孔尚未变色时，每孔加1M硫酸100微升终止反应。10)在ELISA测定仪上（490纳米）读出每孔OD值。(2)结果判定下列公式用于判定中和反应结果（细胞阳性对照平均OD值细胞阴性对照平均OD值）2+细胞阴性对照平均OD值=XX=细胞半数感染阈值，每孔OD值低于X值时，判定为中和反应阳性，中和反应阳性的血清最高稀释度即为血清中的和抗体滴度。 * 在特殊情况下可用目测法判定结果，即加底物后，肉眼下出现橙黄色反应的为阴性。 无色为阳性。待检系列稀释血清中无色孔的最高稀释度即为血清的中和抗体滴度。 * 流感病毒中和实验
16、的质量控制a.阴性血清对照孔的OD值应该与阳性细胞对照孔的OD值无明显差别。b.病毒工作液滴度检测孔，上数35孔呈阳性反应，显示正常病毒量。 孔序12345678TCID50100502512631.50.7OD值+ 若超过5孔阳性，则为病毒过量，若少于3孔阳性，则为病毒量不足。c.阴性细胞对照孔的OD值一般小于0.2，阳性细胞对照孔的OD值一般在1左右。d.每次测定中，阳性血清对照的中和抗体滴度应该在2倍之内波动。4、操作注意事项(1)待检人血清需5630分钟灭活，动物血清需RDE处理。(2)待检血清需要重复测定时，应分装后冻存，以免反复冻融。(3)每管病毒只使用一次，若重复使用，或血清阳性
17、对照结果过高或过低，以及细胞阳性对照OD值过低，须对病毒进行重新滴定。(4)MDCK细胞应处于对数生长期，严禁细胞过度生长或老化（代数过高）。因此，必须在10代前进行细胞冻存，保存于液氮中备用。(5)牛血清有中和病毒感染力的作用。试验过程中切勿将细胞培养液与病毒稀释液混淆使用。(6)病毒与抗血清混合，常规采用37作用1小时，该实验采用37作用2小时，但针对不同耐热性的病毒，孵育温度和时间应有所增减。(7)在ELISA过程中，每步都要洗涤，以保证结果可靠。(8)选择合适的抗体稀释浓度，一般预先将不同稀释度的抗体以及酶结合抗体进行ELISA测定，以获得最佳稀释度。(9)正确控制显色时间，以降低背景
18、染色。(10)大量测定时，为稳定培养液的PH值，可用HEPES增加溶液的缓冲能力，减少PH变化对细胞的不利影响。(11)在缺少病毒特异性抗体的情况下，可用细胞病变观察或测量培养板中每孔血凝活性来替代ELISA方法，但细胞培养时间须从1822小时增至24天。4、病毒TCID50 滴度的计算组织培养半数感染量是病毒感染一半组织细胞时的病毒稀释度，一般使用ReedMuench方法计算。(1)计算各病毒稀释度阳性孔数目（1）和阴性孔数目（2）(2)计算阳性和阴性孔的累积数。阳性孔累积数由下向上累计（3）；阴性孔累积数由上向下累计（4）(3)计算阳性孔的百分比：比率（5）=（3）/（3）+（4），（6）
19、=（5）100(4)计算距离比例距离比例=（大于50%的阳性百分比50）/（大于50%的阳性百分比小于50%的阳性百分比）=（7550）/（750）=0.3TCID50的对数=大于50%的阳性百分比的最高稀释对数 + 距离比例稀释系数的对数=5+0.30.5=5.15TCID50=10-5.15/100微升100TCID50/50微升10-2.8100TCID50/50微升=1:631稀释(5)稀释系数的对数1:10稀释为1，半对数稀释为0.5，倍比稀释为0.3，1:5稀释为0.7。五、流感实验室检测中应注意的若干问题1、禁止在同一实验室，更不应在同一接种柜中，同时处理接种未知临床标本和已知阳
20、性标本。2、禁止在同一实验室，同一时间处理，接种采自不同动物的标本；动物标本（如禽、猪等）必须与人的标本分别保存。3、接种后剩余原始标本，尤其分离出病毒的标本需暂时冻存，有条件的应置-70或以下保存，以便需要时可进行复查，待分离物经国家流感中心鉴定完后方可处理掉。分离阴性的标本应随时弃之。4、严禁实验室交叉污染：在病毒分离时严禁设阳性对照及操作在人群中已消失的流感病毒。5、向国家流感中心送毒株时，量至少需5 ml，同时需自己保存一些，以便寄送过程发生意外时可继续补送。6、流感病毒在-20-40 时不稳定，故不宜在此温度下长期保存。7、鸡胚中分离出的流感病毒，应尽量别在MDCK细胞上传代。因当今国内所用的MDCK细胞属肿瘤细胞系，一旦病毒通过它传代就无法用于疫苗制备。8、寄送毒株时一定需附上送检表。寄送毒株需及时，尤其鉴定不出的，异常的毒株应尽快向国家流感中心寄送。寄送时用快速直送国家流感中心。