第9章真菌及其毒素.doc

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1、第9章 真菌及其毒素 真菌性食物中毒是指人或动物吃了含有真菌产生的真菌毒素（Mycotoxin）的食物引起的中毒现象。由真菌毒素引起的人或动物的疾病统称为真菌毒素中毒症（Mycotoxicoses）。9.1 黄曲霉菌及其毒素9.1.1 产毒菌及其特性 产毒菌主要是黄曲霉菌该菌属真菌门、半知菌亚门丛梗孢科曲霉属。本菌为需氧菌，最适培养温度3033，相对湿度8090。花生、玉米、大米和小麦是其较好的生长基质。寄生曲霉及青霉、毛霉和根霉等真菌也能产生AFT，但产毒量甚微。9.1.2 黄曲霉毒素的性质、来源、毒性及在食品中限量标准9.1.2.1 黄曲霉毒素的性质黄曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）

2、是黄曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）的代谢产物。目前已发现的AFT有20余种。是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。AFT在紫外线照射下能产生荧光，根据荧光颜色不同，将其分为B族和G族两大类及其衍生物，黄曲霉毒素B1和B2可发出蓝紫色荧光，G1和G2可发出黄绿色荧光。纯净的黄曲霉毒素为无色晶体，耐热，100、2 h也不能将其全部破坏。可溶于多种有机溶剂如氯仿、甲醇、乙醇等，不溶于水、己烷、乙醚和石油醚。AFT对氧化剂不稳定，如次氯酸钠溶液、氯、过氧化氢、高锰酸钾、漂白粉等均可使AFT分解破坏，并随氧化剂浓

3、度的增大，AFT分解速度加快。人及动物摄入黄曲霉毒素B1和B2后，在乳汁和尿中可检出其代谢产物黄曲霉毒素M1和M2。黄曲霉毒素的化学结构如图9-1所示。图9-1 黄曲霉素的化学结构9.1.2.2 黄曲霉毒素的来源AFT主要污染粮油食品、动植物食品等。如花生、玉米，大米、小麦、豆类、坚果类、肉类、乳及乳制品、水产品等容易被黄曲霉毒素污染。其中以花生和玉米污染最严重。家庭自制发酵食品也能检出黄曲霉毒素，尤其是高温高湿地区的粮油及制品种捡出率更高。9.1.2.3 黄曲霉毒素的毒性及在食品中的限量标准AFT的毒性极强，属于剧毒毒物，毒性比氰化钾大10倍，为砒霜的68倍。其中以B1毒性最大，LD50为0

4、.294g/kg（口服）。当人摄入量大时，可发生急性中毒，黄曲霉毒素有很强的肝脏毒性，可导致肝细胞坏死、胆管上皮增生、肝脂肪浸润及肝内出血等急性病变。少量持续摄入则可引起肝纤维细胞增生、肝硬化等慢性病变。当微量持续摄人，可造成慢性中毒，表现为生长障碍，亚急性或慢性肝损伤。AFT的致癌力也居首位，是目前已知最强致癌物之一。它的诱癌力是二甲基偶氮苯的900倍以上，比二甲基亚硝胺诱发肝癌的能力大10倍，与人类肝癌有直接的关系。我国和其他许多国家的流行病学调查表明，人群膳食中黄曲霉毒素的水平与原发性肝癌的发生率之间有不同程度的正相关关系，即食品中黄曲霉毒素含量越高，摄入量越多，肝癌的发病率也越高。黄曲

5、霉毒素具有很强的毒性，特别是它的强致癌性，世界各国对于其污染食品的情况都很重视，并对其在食品中含量进行了严格限制，FAO/WHO在1993年提出的指导性标准为：食品中黄曲霉毒素M10.05g/kg，奶牛饲料中的黄曲霉毒素B15g/kg。我国于1981年作为正式国家标准，颁布了食品中黄曲霉毒素B1最高允许量标准：玉米、花生仁、花生油为20g/kg；玉米及花生仁制品为20g/kg；大米和其他食油10g/kg；其他粮食、豆类、发酵食品5g/kg；婴儿食品中不得检出。9.1.3 黄曲霉毒素的测定黄曲霉毒素的测定方法有多种，主要有薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）和ELISA法等。薄层层析

6、法是国内外测定食品及饲料中AFTB1的主要方法，此法灵敏度较高（15ppb），主要用于AFTB1的测定，随后的薄层色谱分离、荧光分光光度计，灵敏度达到（0.11.0ppb，甚至高达0.01ppb），可单独测定AFTB1或B2、G1、G2、M1等。近几年采用单克隆免疫亲和柱一高效液相色谱法测定了牛奶中的AFM1 ，其检出低限达到0.05g/kg、测定果仁中的AFB1 ，其检出低限达到0.1g/kg。2003年，Rodrtguez Velasco M L等，用ELISA和HPLC法对西班牙里昂农场牛奶中AFTM1的含量进行了检测，这两种检测方法的检测限都为10 ng/g，这两种方法都行之有效。但H

7、PLC法对仪器设备的要求较高，消耗的成本也较高。酶联免疫吸附法（ELISA）测定食品中黄曲霉毒素B1（GB/T 5009.22-1996）9.1.3.1 主要设备与器材 酶标仪（内置490 nm滤光片）、酶标微孔板、微量加样器及配套吸头。9.1.3.2 试剂 1.抗黄曲霉毒素B1 单克隆抗体、2.人工抗原（AFB1-牛血清白蛋白结合物）、3.黄曲霉毒素B1 标准溶液：用甲醇将黄曲霉毒素B1配制成1 mg/ml溶液，再用甲醇-PBS溶液（20+80）稀释至约10 g/ml，紫外分光光度计测此溶液最大吸收峰的光密度值，代入式（9-1）计算： （9-1）式中：X该溶液中黄曲霉毒素B1 的浓度，g/m

8、l；A测得的光密度值；M黄曲霉毒素B1 的分子量，312；E摩尔消光系数，21 800；f使用仪器的校正因素。根据计算将该溶液配制成10 g/ml标准溶液，检测时，用甲醇-PBS溶液将该标准溶液稀释至所需浓度。4.牛血清白蛋白（BSA）；5.辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗鼠IgG。6.ELISA缓冲液：（1）包被缓冲液（pH9.6碳酸盐缓冲液）的制备：Na2CO3 1.59 g 、NaHCO3 2.93 g 加蒸馏水至1 000 ml。（2）磷酸盐缓冲液（pH7.4 PBS）的制备： KH2PO4 0.2 g Na2HPO412H2O 2.9 g NaCl 8.0 g KCl 0.2 g 加

9、蒸馏水至1 000 ml。（3）洗液（PBS-T）的制备：PBS加0.05%（V/V）吐温-20。（4）抗体稀释液的制备：BSA 1.0 g加PBS-T至1 000 ml。（5）底物缓冲液的制备。 甲液（0.1 mol/L柠檬酸水溶液）：柠檬酸（C6H8O7H2O）21.01 g，加蒸馏水于1 000 ml。乙液（0.2 mol/L磷酸氢二钠水溶液）：Na2HPO412H2O71.6 g，加蒸馏水至1 000 ml。用前按甲液+乙液+蒸馏水为24.3+25.7+50的比例（体积比）配制。（6）封闭液的制备：同抗体稀释液。9.1.3.3 测定原理 样品中的黄曲霉毒素B1经提取、脱脂、浓缩后与定量

10、特异性抗体反应，多余的游离抗体则与酶标板内的包被抗原结合，加入酶标记物和底物后显色，与标准比较来测定含量。9.1.3.4 步骤1.提取 不同食品提取方法各异，以下就主要食品提取过程作简单介绍。（1）大米、小米 样品粉碎后过20目筛，称取20.0 g，加入250 ml具塞锥形瓶中。准确加入60 ml三氯甲烷，盖塞后滴水封严。150 r/min振荡30 min。静置后，用快速定性滤纸过滤于50 ml烧杯中。立即取12 ml滤液（相当4.0 g样品）于75 ml蒸发皿中，65水浴通风挥干。用2.0 ml 20%甲醇-PBS分三次（0.8 ml、0.7 ml、0.5 ml）溶解并彻底冲洗蒸发皿中凝结物

11、，移至小试管，加盖振荡后静置待测。此液每毫升相当于2.0 g样品。 （2）玉米的提取（脂肪含量3.0%5.0%） 样品粉碎后过20目筛，称取20.0 g，加入250 ml具塞锥形瓶中，准确加入50.0 ml甲醇-水（80+20）溶液和15.0 ml石油醚，盖塞后滴水封严。150 r/min振荡30 min。用快速定性滤纸过滤于125 ml分液漏斗中。待分层后，放出下层甲醇-水溶液于50 ml烧杯中，从中取10.0 ml（相当于4.0 g样品）于75 ml蒸发皿中。以下按（1）自“65水浴通风挥干”起，依法操作。 （3）花生的提取（脂肪含量15.0%45.0%） 样品去壳去皮粉碎后称取20.0

12、g，加入250 ml具塞三角瓶中，准确加入100.0 ml甲醇-水（55+45）溶液和30 ml石油醚。盖塞后滴水封严。150 r/min振荡30 min。静置15 min后用快速定性滤纸过滤于125 ml分液漏斗中。待分层后，放出下层甲醇-水溶液于100 ml烧杯中，从中取20.0 ml（相当于4.0 g样品）置于另一125 ml分液漏斗中，加入20.0 ml三氯甲烷，振摇2 min，静置分层（如有乳化现象可滴加甲醇促使分层）。放出三氯甲烷于75 ml蒸发皿中。再加5.0 ml三氯甲烷于分液漏斗中重复振摇提取后，放出三氯甲烷一并于蒸发皿中，以下按（1）自“65浴通风挥干”起，依法操作。 （4

13、）植物油的提取 用小烧杯称取4.0 g样品，取20.0 ml石油醚，将样品移于125 ml分液漏斗中，用20.0 ml甲醇-水（55+45）溶液分次洗烧杯，再一并移入分液漏斗中（精炼油样品4.0 g为4.525 ml，直接用移液器加入分液漏斗，加入溶剂后振摇），振摇2 min。静置分层后，放出下层甲醇-水溶液于75 ml蒸发皿中，再用5.0 ml甲醇-水溶液重复振摇提取一次，提取液一并加入蒸发皿中，以下按（1）自“65水浴通风挥干”起，依法操作。2. 包被微孔板 用AFB1-BSA人工抗原包被酶标板，150 L/孔，4过夜。3. 抗体抗原反应 将黄曲霉毒素B1 纯化单克隆抗体稀释后分别与等量不

14、同浓度的黄曲霉毒素B1标准溶液用2 ml试管混合振荡后，4静置。此液用于制作黄曲霉毒素B1 标准抑制曲线。再按相同方法配制待测样品。 4. 封闭 已包被的酶标板用洗液洗3次，每次3 min，加封闭液封闭，250 L/孔，置37下1 h。 5. 测定 酶标板洗33 min后，加抗体抗原反应液（在酶标板的适当孔位加抗体稀释液或Sp2/0培养上清液作为阴性对照）130 L/孔，37，2 h。酶标板洗33 min，加酶标二抗（1：200，V/V）100 /孔，1 h。酶标板用洗液洗53 min。加底物溶液（10 mgOPD）加25 ml底物缓冲液加37 L 30% H2O2，100 L/孔，37，15

15、 min，然后加2 mol/L H2SO4，40 L/孔，以终止显色反应，酶标仪490波长 nm测出OD值。6. 计算 黄曲霉毒素的含量按以下公式（9-2）进行计算。 （9-2） 式中：C黄曲霉毒素B1 含量，ng，对应标准曲线按数值插入法求得； V1样品提取液的体积，ml； V2滴加样液的体积，ml； D稀释倍数； m样品质量，g。 由于按标准曲线直接求得的黄曲霉毒素B1浓度（C1）的单位为ng/ml，而测孔中加入的样品提取的体积为0.065 ml，所以式（9-2）中 C=0.065C1而V1=2 ml，V2=0.065 ml，D=2，m2=4 g 代入式（9-2），则 （9-3）从标准曲线

16、直接求得的数值C1，即为所测样品中黄曲霉毒素B1 的浓度（ng/g）。9.2 赭曲霉菌及其毒素的检验赭曲霉毒素（Ochratoxin，OTC）在自然界中分布广泛，可寄生在食品、粮食及饲料中并产毒。9.2.1 赭曲霉菌毒素的产生菌及其特性赭曲霉毒素的产毒菌有：赭曲霉（Aspergillus ochraceus），硫色曲霉（A.sulphureus）、蜜蜂曲霉（A.melleus）及鲜绿青霉（Penicillium viridicatum）、普通青霉（P.commune）等。一般产毒霉菌在2528，高湿度、阴暗静置条件下培养1 2周产毒较高。9.2.2 赭曲霉菌毒素的性质、来源、毒性及在食品中的允

17、许含量标准9.2.2.1 赭曲霉菌毒素的性质赭曲霉毒素包括A、B、C（简称OA、OB、OC）等几种衍生物，其化学结构也类似香豆素。OCT是一种相当稳定的化合物，在乙醇溶液中置冰箱保存一年以上不破坏。赭曲霉毒素微溶于水，溶于有机溶剂和稀的碳酸氢钠水溶液（如5碳酸氢钠）中。在紫外光下OA呈兰绿色荧光，OB呈兰色，OC呈亮绿色。因OCT的分子量小，故无免疫原性，只有与蛋白质或多肽载体结合后，才能刺激机体产生相应抗体。图9-2赭曲霉毒素的结构9.2.2.2 赭曲霉菌毒素的来源赭曲霉毒素可污染玉米、大麦、小麦，大米、荞麦、大豆花生、棉籽等各种食品原料及其制品，火腿、鱼制品以及饲料也有一定程度的污染。在谷

18、物上2025、含水率高于16时污染更严重。污染饲料中的毒素在动物的肝、肾、 脂肪中的蓄积较多，这是肉食污染的重要原因。9.2.2.3 赭曲霉菌毒素的毒性及在食品中的限量标准OCT中的OA的含量最高，且毒性最强，主要侵害肾脏，是一种强烈的肾脏毒，当人和畜禽持续摄入含毒食物或饲料时，不仅会出现急性症状，而且导致严重的慢性中毒、致癌、致畸等。急性毒性主要损害肾脏，病理变化包括肾小管萎缩，肾间质纤维化及肾小球透明样病变等。慢性毒性，症状为肝脏可见实质细胞变性、透明变性、灶性坏死等，脾、淋巴结，扁桃体等组织也可观察到坏死性病变。致癌性和致畸性：Broun等人用妊娠大白鼠作的实验证明有致畸性，用小白鼠作实

19、验证明对肾脏有致癌性，按248276ug天持续投毒15周（总量为2629mgOA），即有肾细胞癌的发生。另外，给孕期712天的小白鼠腹腔注射5mgkg体重的OA，出现胎鼠死亡率增加，胎鼠重量降低、畸形等。基于OTA的潜在致癌性，WHO于1991年暂定谷物中OTA的限量标准为5ug/kg ，并于1995年暂定每周允许摄入量为100ng/kg体重。CAC/FAO在2002年的第34次CCFAC会议上，为了保护消费者的健康和国际间的公平贸易同意CAC在生小麦和大麦中OTA的最高限量标准为5 ug/kg。我国对配合饲料、玉米中OTA的限量标准不超过100 ug/kg。9.2.3 赭曲霉菌毒素的测定TL

20、C法是最早用来分析真菌毒素其中包括OA的方法，是美国分析化学家协会（AOAC）用于检测谷物中的OA的最早方法，其检测限为10 ug/kg，高效液相色谱法（ HPLC）的灵敏度达到0.005 ug0.1ug/kg。HPLC与其他方法的联合使用如HPLC联合质谱（Ms）或电喷雾电离的串联质谱（MSMS）分析检测酒中存在的OTA，可达ppb浓度水平。目前市场上有各种ELISA试剂盒如荷兰EumDiagnostica公司和美国NEOGEN公司生产的赭曲霉毒素检测试剂盒。我国江涛等于2004年利用B细胞杂交瘤技术建立了能够分泌抗OTA的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并获得了抗OTA单克隆抗体，并利用抗0TA

21、的单克隆抗体建立了ELSIA试剂盒，并用于大米、小麦中的OTA检测，最低检测限为0.5ug/kg。9.2.3.1主要设备及器材 薄层涂布器、微量注射器、具0.2ml尾管的10ml小浓缩瓶。注：所有玻璃仪器均需用稀盐酸浸泡，用自来水、蒸馏水冲洗。9.2.3.2试剂 1.石油醚、甲醇、三氯甲烷、甲苯、乙酸乙酯、甲酸、冰乙酸、乙醚、苯-腈（98+2）、0.1mol/L磷酸、2mol/L盐酸溶液、40g/L氯化钠溶液、0.1mol/L碳酸氢钠溶液、硅胶G、赭曲霉毒素A标准品（OA）2.赭曲霉毒素A标准贮备液 用苯-冰乙酸（99+1）配成40g/ml赭曲霉毒素A标准贮备液，并用分光光度计测定其浓度。置冰

22、箱中避光保存。3.赭曲霉毒素A标准使用液 精密吸取贮备液，用苯稀释成0.5g/ml的赭曲霉毒素A，置冰箱中避光保存。9.2.3.3 测定原理样品中赭曲霉毒素A经提取、净化、浓缩、薄层展开后，在波长254nm紫外光下产生黄绿色荧光，根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定含量。1.提取 称取过20目筛的样品（花生果10目筛）20g，置于200ml具塞锥形瓶中，加30ml石油醚和100ml甲醇-水溶液（55+45），在瓶塞上涂一层水封防漏。振荡30min后，通过快速定性滤纸滤入分液漏斗中，待下层甲醇水层分清后，取出20ml，滤液置于100ml分液漏斗中，加25ml三氯甲烷振摇2min，静置分层后放

23、出三氯甲烷层于一分液漏斗中，甲醇水层再用10ml三氯甲烷重复振摇提取（在三氯甲烷振摇提取时若发生乳化现象，可滴加甲醇促使其分层），三氯甲烷层合并于同一分液漏斗中，加入50100ml4%氯化钠溶液（加入量视样品不同而异，黄豆加100ml、面粉加7080ml、其余则加50ml左右），振摇放置（如为黄豆提取液还需轻轻反复倒转分液漏斗，使乳化层逐渐上升，如乳化严重，可以加入少量甲醇），待三氯甲烷层澄清后，用脱脂棉擦干分液漏斗下端，放三氯甲烷层于25ml蒸发皿中（如为黄豆样品，则再加10ml三氯甲烷振摇，三氯甲烷层合并于同一蒸发皿中），将蒸发皿放在通风柜内于65水浴上通风挥干；然后放在冰盒上冷却23mi

24、n后，准确加入1ml苯-乙腈混合液。用约8ml三氯乙烷分次将蒸发皿中的残渣溶解，转入具尾管的10ml浓缩瓶中，置80水浴锅上用蒸气加热吹氮气（N2）浓缩至干，加0.2ml苯-乙腈溶解残渣，供薄层色谱点样用。2.薄层板的制备 称取4g硅胶G，加10ml蒸馏水于研钵中研磨至糊状，立即倒入涂布器内制成5cm20cm、厚度0.3cm的薄层板三块，在空气中干燥15min，再在105110 活化2h，取出，放入干燥器中保存。一般可保存23天，若繁殖时间较长，可再活化后使用。3.点样 取薄层板2块，在距薄板左右边缘1.7 cm处滴加8L 赭曲霉毒素A 标准溶液（0.5g/ml）。在距板左边缘2.5cm处滴加

25、25L样液，然后在第二块板的样液点上滴加8L的赭曲霉毒素A标准溶液（0.5g/ml）。由于滴加样液量较多故需边滴边用电吹风吹干。如天气潮湿，样液点在微量注射器尖端吸水影响点样，可冷热风交替使用。4.双向展开 包括横向和纵向展开两步。（1） 横向展开 在展开槽内加10ml乙醇或乙醚-甲醇-水混合溶剂（94+5 +1），将薄层板纵展至离原点23cm，取出通风，挥发溶剂12min后，在将该薄层板靠近标准点的长边置于同一展开槽内的溶剂中横展，如横展剂不够，可添加适量，展至板端，过1min，取出通风挥发溶剂23min。（2） 纵向展开：在另一展开槽内倒入10ml甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5+4+1）或苯-乙

26、酸（9+1）纵展剂，将经横展后的薄层板纵展至前沿距原点1315cm。取出通风，挥干至板面无酸味（约510min）。5.观察与评定 将薄层板置365nm波长紫外光灯下观察。在紫外灯下将两板互相比较，若第二块板的样液点在OA标准点的相应处出现最低检出量，而在第一板相同位置上未出现荧光点，则试样中的OA含量在本测定方法中的最低检测量10g/kg以下。如果第一板样液点在与第二板样液点相同位置上出现荧光点，则看第二板样液的荧光点与滴加的标准荧光点是否重叠，再进行以下的定量与确证试验。6.稀释定量 比较样液中OA与标准OA点的荧光强度，估计稀释倍数。薄层板经双向展开后，当阳性样品中OA含量高时，OA的荧光

27、点会被横向拉长，使点变扁，或分成两个黄绿荧光点，可根据OA黄绿色荧光的总强度与荧光强度比较，估计需将少的滴加微升数或所需稀释倍数。直至样液与两个标准0A荧光点的荧光强度一致。7.确证试验 用碳酸氢钠乙醇溶液（在100ml水中溶解6.0g碳酸氢钠，加20ml乙醇）喷洒色谱板，在室温下干燥，于长波紫外光灯下观察，这时OA荧光点应由黄绿色变为蓝色，而且荧光强度有所增加，可使该方法的检出限达5g/kg。8.计算 按下列公式计算其毒素含量 （9-4） 式中：V1加入苯-乙腈混合液的体积，ml； V2出现最低荧光样液的滴加体积，ml；n样液的总稀释倍数；m浓缩样液中所相当的样品质量，g。9.3 单端孢霉烯

28、族化合物9.3.1单端孢霉烯族化合物的产生菌及其特性单端孢霉烯族化合物（trichothecenes，TCTCs），是一组由镰刀菌属（Fusarium）中三线镰刀菌（F.tritinctum）、拟枝孢镰刀菌属（F.sporotrichioides）、雪腐镰刀菌（F.nivale）、梨孢镰刀菌（F.poae）、木贼镰刀菌（F.equiseti）、禾谷镰刀菌（F.graminearum）和黄色镰刀菌（F.culmorum）等产生的生物活性和化学结构相似的有毒代谢产物。9.3.2 单端孢霉烯族化合物的性质、来源、毒性及在食品中的限量标准9.3.2.1单端孢霉烯族化合物的性质TCTCs主要有T-2毒素

29、、二醋酸藨草镰刀菌烯醇（DAS）、雪腐镰刀菌烯醇（NIV）和脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）等。其化学结构如图9-3所示。 图9-3 单端孢霉烯族化合物的结构到目前为止，从真菌培养物及植物中已分离出化学结构基本相同的单端孢霉烯族化合物148种。根据相似的功能团可将其分为A、B、C和D四个型。A型的特点是在C-8上有一个与酮不同的功能团，这一型包括T-2毒素和二醋酸薰草镰刀菌烯醇（DAS）.B型在C-8上有一羧基官能团，以脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON） 和雪霉腐镰刀菌烯醇（NIV） 为代表。C型的特点是在C-7，8或C-9，10上有一个次环氧基团。D型在C-4和C-5之间有两个酯相连。天然污染谷物和饲

30、料的单端孢霉烯族化合物有A型中的T-2毒素、二醋酸薰草镰刀菌烯醇和B型的脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪霉腐镰刀烯醇。 TCTCs为无色结晶，该化合物非常稳定，难溶于水，溶于极性溶剂，在烹调等加热过程中不会被破坏。在紫外线下不显荧光。9.3.2.2 单端孢霉烯族化合物的来源镰刀菌属的菌种广泛分布于自然界，从土壤中可分离到50多种镰刀菌，世界各地均有污染。这些真菌及其毒素主要侵害玉米、小麦、大米、燕麦、大麦等谷物。9.3.2.3 单端孢霉烯族化合物的毒性及在食品中的限量标准 TCTCs的共同毒性特点是较强的急性毒性、细胞毒性和致畸作用，对人和动物有较强的致呕吐作用。还可损伤细胞膜，有较强的蛋白质合成抑制作

31、用，可致免疫力低下。某些TCTCs有一定的致癌性。T-2毒素能在不同细胞系中诱发染色体畸变，增加姐妹染色单体交换频率和微核率。T-2毒素对小鼠具有胚胎毒性和致畸性，导致骨髓、内脏畸形和死胎。Corrier（1988）还通过实验发现，喂饲T-2毒素的小鼠肉瘤、艾氏腹水瘤和黑色素瘤的发生率均显著高于对照组。关于单端孢霉烯族化合物造成的人类食物中毒，全世界已有不少报道。19311947年发生在前苏联的食物中毒可能与摄食被镰刀菌污染的谷物有关，中毒者的主要表现为口腔、食管和胃的慢性损伤，严重的白细胞缺乏、骨髓再生障碍等。研究者从食物中分离出了镰刀菌.19451963年日本和韩国发生的赤霉病谷物中毒，主

32、要症状为恶心、呕吐、腹泻和腹痛。怀疑是由谷物中的禾谷镰刀菌引起。单端孢霉烯族化合物引起的食物中毒现象已引起世界各国的重视。目前，加拿大、美国等国已制订了小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的限量标准。中国于1996年制订了小麦、玉米及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的限量标准为：小麦、小麦面粉、玉米和玉米粉均1000g/kg。9.3.3 小麦中T-2毒素的酶联免疫（ELISA）吸附侧定9.3.3.1主要仪器与材料 所有的玻璃器皿均用硫酸洗液浸泡、用zolaishui、蒸馏水冲洗。酶标检测仪、酶标板（40孔或96孔）、具0.2ml尾管的10ml小浓缩瓶。9.3.3.2 试剂 1.抗T-2毒素单克隆抗体与辣根过氧化

33、氢酶结合物；2.抗原 T-2毒素与载体蛋白-牛血清白蛋白的结合物（T-2-BSA ）；3.ELISA缓冲液 包被缓冲液（pH9.6碳酸盐缓冲液）的制备：Na2CO3 1.59 g 、NaHCO3 2.93 g 加蒸馏水至1 000 ml。磷酸盐缓冲液（pH7.4 PBS）的制备： KH2PO4 0.2 g Na2HPO412H2O 2.9 g NaCl 8.0 g KCl 0.2 g 加蒸馏水至1 000 ml。4.洗液（PBS-T）的制备 PBS加0.05%（V/V）吐温-20。5.抗体稀释液的制备 BSA 1.0 g加PBS-T至1 000 ml。6.底物缓冲液的制备 甲液（0.1 mol

34、/L柠檬酸水溶液）：柠檬酸（C6H8O7H2O）21.01 g，加蒸馏水于1 000 ml。乙液（0.2 mol/L磷酸氢二钠水溶液）：Na2HPO412H2O71.6 g，加蒸馏水至1 000 ml。用前按甲液+乙液+蒸馏水为24.3+25.7+50的比例（体积比）配制。7.底物溶液 取50LTMB（10mgTMB溶于1ml二甲基甲酰胺中）溶液+10ml底物缓冲液+10 L30%H2O2，混匀。8.T-2毒素标准溶液 用甲醇配置1mg/mlT-2毒素贮备液，-20冰箱贮存。于检测当天，粳米吸取贮备液，用20%甲醇的PBS（配制方法同PBS-T，不加土温即可）稀释成制备标准曲线的所需浓度。9.

35、3.3.3 测定原理 将已知抗原吸附在固定载体表面，洗除未吸附的抗原，加入一定量的酶标记抗体与试样（含有抗原）提取液的混合液，竞争温育后，在固相载体表面形成抗原-抗体-酶复合物。洗涤多余部分，加入酶的底物。在酶的催化作用下，底物发生降解反应，产生有色物质，通过酶标检测仪，测出酶底物的降解量，从而推知被测试样中的抗原量。9.3.3.4 分析步骤1. 提取 样品粉碎后过20目筛，称取20.0 g，加入200 ml具塞锥形瓶中，加8ml水和100 ml三氯甲烷-无水乙醇（4+1），盖塞，振荡1h，用滤纸过滤，取25 ml滤液于蒸发皿中，置90水浴上通风挥干。用50 ml石油醚粉刺溶液蒸发皿中残渣，洗

36、入250ml分液漏斗中，再用20ml甲醇-水（4+1）分次洗涤，转入同一分液漏斗，加盖振荡1.5min，静置约15min后，取下层甲醇-水提取液过层析柱净化（层析柱的装备：在层析柱下端与小管相连结处塞约0.1g脱脂棉，尽量塞紧，先装入0.5g中性氧化铝，敲平表面，再加入0.4g活性炭，敲紧）。通过柱后的洗脱液 倒入蒸发皿中，并于水浴锅上浓缩至干，趁热加3ml乙酸乙酯，加热至沸，挥干，再重复一次，最后加3ml乙酸乙酯，冷至室温后转入浓缩瓶中。用适量乙酸乙酯洗涤蒸发皿，并入浓缩瓶中。将浓缩瓶置95水浴锅上，挥干冷却后，用含20%甲醇-PBS定容，供ELISA检测用。2.用T-2-BSA（4g/ml

37、）包被酶标板，每孔100L，4过夜。3.酶标板用PBS-T洗3次，每次3min后，加入不同浓度的T-2标准溶液（制作标准曲线）或样品提取液（检测试样毒素含量）与抗体-酶结合物溶液（1+100）的混合液（1+1，每孔100L，该混合应用于使用的前一天配好，4过夜），置371.5h。4.酶标板洗3次，每次3min后，加入底物溶液，每孔100L，置3730min。5.用1mol/L硫酸溶液终止反应，每孔50L，于450nm波长处测定吸光度值。9.3.3.5计算结果 （9-5） 式中：XT-2浓度，ng/g；c酶标板上所测得的T-2毒素的量，ng，根据标准曲线求得；V1试样提取液的体积，ml； V2滴

38、加样液的体积，ml；D样液的总稀释倍数；m试样质量，g。9.4 玉米赤霉烯酮9.4.1 玉米赤霉烯酮的产生菌及其特点玉米赤霉烯酮（Zearalenone ，ZEN），又称F-2毒素，是由镰刀菌产生的一种雌激素类真菌毒素。产生玉米赤霉烯酮最常见的是禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum，无性世代），此外还有三线镰刀菌（F.tritinctum）、串珠镰刀菌（F.moniliforem）、尖孢镰刀菌（F.oxysporum）、木贼镰刀菌（F.equiseti）等。禾谷镰刀菌在谷物上的生长繁殖最适温度为1624，相对湿度为85%。该菌能在大麦、小麦、元麦上发生病变，也能在玉米、稻谷、蚕

39、豆、甜菜叶上生长繁殖。9.4.2 玉米赤霉烯酮的性质、来源、毒性及在食品中的限量标准9.4.2 .1 玉米赤霉烯酮性质纯的ZEN为白色晶体，分子式C18H22O5，分子量3l8，熔点161 163，不溶于水、二硫化碳、四氧化碳，溶于碱性溶液、乙醚、苯及甲醇、乙醇等，微溶于石油、醚等。其甲醇溶液在紫外光下呈明亮的绿一蓝色荧光。ZEN是一种取代的2，4一二羟基苯甲酸内酯，具有雌激素活性。结构见图9-4。图9-4 玉米赤霉烯酮的结构9.4.2 .2 玉米赤霉烯酮的来源它广泛存在于霉变的玉米、高梁、小麦等谷类作物和奶类品中，王若军等从华南、华北和华中的饲料厂、仓库及客户手中等采集的109个样品，使用酶

40、联免疫法测定发现：在玉米饲料和全价料中玉米赤霉烯酮的检出率都高达到100。在蛋白质饲料中玉米赤霉烯酮的检出率高达92.9，而且超标严重。在被检饲料和饲料原料中，黄曲霉毒素并非主要的霉菌毒素，而ZEN的污染甚为严重。9.4.2.3 玉米赤霉烯酮的毒性及在食品中的限量标准ZEN具有很强的生殖毒性和致畸作用， Schweighardt（1980）认为lppm的低剂量就能导致猪和牛繁殖紊乱，Price et al（1993）认为50100ppm的剂量就会影响到排卵、怀孕、胎儿发育、新生儿的存活率等。在ll0nmol浓度时即能刺激雌激素受体的转录，还可以降低家畜的耗料量，导致生长下降，免疫抑制，繁殖障碍

41、，给畜牧业带来很大的经济损失，现在已经成为养猪业的第二杀手。对玉米赤霉烯酮的最高允许量标准，巴西规定玉米中不超过200g/kg；罗马尼亚规定所有食品中不超过30g/kg；前苏联规定谷物、油脂中不超过1000g/kg。我国国标规定配合饲料、玉米不超过500g/kg。9.4.3 玉米赤霉烯酮的薄层色谱法测定9.4.3.1 主要仪器与设备 薄层板涂布器、旋转蒸发器、慢速滤纸、展开槽、点样器、薄层色谱扫描仪（配有汞灯光源）。9.4.3.2试剂与材料1.展开剂:三氛甲烷一丙酮一苯一乙酸（18+2+8+1）。2.显色剂:20g氯化铝（AlCl36H20）溶于100 ml乙醇中3.薄层板:称取4g硅胶G，置

42、于乳钵中加10 ml 0.5%羧甲基纤维素钠水溶液研磨至糊状。立即倒人薄层板涂布器内制备成10 cmX20 cm、厚度0.3mm的薄层板，在空气中干燥后，用甲醇预展薄层板至前沿，吹干，标记方向，在105110活化1h，置于干燥器内保存备用。4.ZEN标准储备溶液 称取适量的ZEN标准品，用甲醇配制成约100 g/ml ZEN标准储备溶液。避光，于-5以下储存。标定储备液的浓度，用1 cm石英比色杯，以甲醇为参比，在ZEN的最大吸收峰波长314nm处，测定吸光度值A。储备液中ZEN的含量（X）以微克每毫升（1g/ml）表示，按下式计算。注意:凡接触ZEN的容器，需浸入4%次氯酸钠溶液，半天后清洗

43、备用。为了安全，分析人员操作时要带上医用乳胶手套。 （9-6） 式中:A- 测定的吸光度值；M- ZEN的摩尔质量（M=318 g/mol）；- ZEN在甲醇中的分子吸收系数（=600 m2/mol）； 比色杯的光径长度， cm。5.ZEN标准工作溶液 根据计算的标准储备液的浓度，精密吸取标准储备液适量，用三氯甲烷稀释成浓度为20g/ml的标准工作溶液9.4.3.3 原理 试样中ZEN用三氯甲烷提取，提取液经液-液萃取、浓缩，然后进行薄层色谱分离，限量定量，或用薄层扫描仪测定荧光斑点的吸收值，外标法定量。9.4.3.4 步骤1.试样处理 称取约20 g试样 （精确至0. 01 g），置于具塞锥

44、形瓶中，加人8 ml水和100 ml三氯甲烷，盖紧瓶塞，在振荡器上振荡1h，加入10g无水硫酸钠，混匀，过滤，量取50 ml滤液于分液漏斗中，沿管壁慢慢地加人氢氧化钠溶液10 ml，并轻轻转动1 min，静置使分层，将三氯甲烷相转移至第二个分液漏斗中，用氢氧化钠溶液10 ml，重复提取1次，并轻轻转动1 min，弃去三氯甲烷层，氢氧化钠溶液层并人原分液漏斗中，用少量蒸馏水洗第二个分液漏斗，洗液倒人原分液漏斗中，再用5 ml三氯甲烷重复洗2次，弃去三氯甲烷层。向氢氧化钠溶液层中加人6 ml磷酸溶液（1+9）后，再用磷酸溶液（1+19）调节pH值至9.5左右，于分液漏斗中加人15 ml三氯甲烷，振

45、摇，将三氯甲烷层经盛有约5g无水硫酸钠的慢速滤纸的漏斗中，滤于浓缩瓶中，再用15 ml三氯甲烷重复提取2次，三氯甲烷层一并滤于浓缩瓶中，最后用少量三氯甲烷淋洗滤器，洗液全部并于浓缩瓶中，真空浓缩至小体积，将其全量转移至具塞试管中，在氮气流下蒸发至干，用2ml三氯甲烷溶解残渣。摇匀，供薄层色谱点样用。2.点样 在距薄层板下端1.5cm2 cm的基线上，以1 cm的间距，用点样器依次点标准工作溶液2.5 L，5 L，10 L，20 L（相当于50 ng，100 ng，200 ng，400 ng）和试样液20 L，3.展开 将薄层板放入有展开剂的展开槽中，展至离原点13cm15cm处，取出，吹干。4

46、.观察与确证 将展开后的薄层板置于波长254 nm紫外光灯下，观察与ZEN（50 ng）标准点比移值相同处的试样的蓝绿色荧光点。若相同位置上未出现荧光点，则试样中的ZEN含量在本测定方法的最低检测量500g/kg以下。如果相同位置上出现荧光点，用显色剂对准各荧光点进行喷雾，130加热 1min，然后在365 nm紫外光灯下，观察荧光点由蓝绿色变为蓝紫色，且荧光强度明显加强，可确证试样中含有ZEN。于荧光点下方用铅笔标记，待扫描定量测定。5.测定（1）薄层扫描工作条件 光源为高压汞灯。激发波长为313 nm，发射波长为400 nm，检测方式为反射，可根据斑点大小进行调节，扫描方式为距齿扫描。（2

47、）标准曲线绘制 以ZEN标准工作溶液质量（ng）为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。6.计算 根据试样液荧光斑点峰面积积分值从标准曲线上查出对应的ZEN质量（ng），试样中ZEN的含量（X）以微克每千克（g/kg）表示，按下式计算。 （9-7）V 试样液（3.5. 1）最后定容体积（L）；Vz 试样液点样体积（L）；m 从标准曲线上查得试样液点上对应的ZEN质量（ ng ）；m0 最后提取液相当试样的质量（g）。计算结果表示到小数点后一位有效数字。9.5 杂色曲霉素9.5.1 杂色曲霉素的产生菌及其特性杂色曲霉素（Sterigmatocystin，简称ST），主要由杂色曲霉（Aspergillus versicolor）、构造曲霉（A