植物组织培养总结.doc

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1、1 绪论1.1 植物组织培养的一般概念l 广义的组织培养，不仅包括在无菌条件下利用人工培养基对植物组织的培养，而且包括对原生质体、悬浮细胞和植物器官的培养。l Gamborg曾根据所培养的植物材料的不同，把组织培养分为5种类型，即愈伤组织培养，悬浮细胞培养、器官培养(胚、花药、子房、根和茎的培养等)、茎尖分生组织培养和原生质体培养。其中愈伤组织培养是一种最常见的培养形式。l 所谓愈伤组织，原是指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组织培养中，则指在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。l 愈伤组织培养所以是一种最常见的培养形式，是因为除茎尖分生组织培养和一部分器官培养以

2、外，其他几种培养形式最终也都要经历愈伤组织才能产生再生植株，此外，愈伤组织还常常是悬浮培养的细胞和原生质体的来源。l 在组织培养中，当我们把分化组织中的不分裂的静止细胞，放在一种能促进细胞增殖的培养基上以后，细胞内就会发生某些变化，从而使细胞进入分裂状态。一个成熟细胞转变为分生状态的过程叫做脱分化。l 在组织培养中，我们把由活植物体上切取下来以进行培养的那部分组织或器官叫做外植体。l 一个成熟的植物细胞经历了脱分化后之所以还能再分化而形成完整的植株，是因为这些细胞具有全能性。所谓全能性，就是说，任何具有完整的细胞核的植物细胞，都拥有形成一个完整植株所必需的全部遗传信息。对已分化的细胞的全能性的

3、实验研究表明，至少在某些情况下，发育和分化过程并不导致细胞中遗传信息的丢失或不可逆的钝化，所涉及的只是这些遗传信息表达调控机制的改变。l 有关全能性的肯定实验证据是Steward等人(1958)在以胡萝卜根组织为外植体的组织培养实验中得到的。当他们把栽培胡萝卜次生韧皮部薄片培养在一种含有椰子汁的固体培养基上时，产生了由简单的薄壁细胞组成的愈伤组织。把这些愈伤组织转入到成分相同的液体培养基中并不断振荡，又产生了由单个细胞和小细胞团组成的悬浮液。l 经过对这些细胞和大小不同的细胞团的显微镜检确定，细胞团是那些从愈伤组织上散落下来的单个细胞发生分裂后但子细胞没有分离的产物。若不继代，由于这些细胞团在

4、培养基中继续生长，结果就会在上面出现根原基。当把长了根的细胞团转到固体培养基表面上以后，随着茎芽的出现形成了一个完整的小植株，从而证实了细胞的全能性。l 全能性只是一种可能性，由以上的介绍我们可以看到，要把这种可能性变为现实性必须满足两个条件：一是要把这些细胞从植物体其余部分的抑制性影响下解脱出来，也就是说必须使这部分细胞处于离体的条件下，二是要给予它们适当的刺激，即给予它们一定的营养物质，并使它们受到一定的激素的作用。l 一个已分化的细胞要表现它的全能性，必须经历上面所说的两个过程，即首先要经历脱分化过程，然后再经历再分化过程。l 脱分化是指植物在组织培养时，在激素调节下由成熟组织的细胞（如

5、叶细胞）转变为分生状态的过程。l 再分化是指在植物组织培养过程中，分生状态的细胞在激素的作用下分化转变为成熟组织或器官的过程。l 脱分化后的细胞进行再分化的过程有两种不同的方式，一种是器官发生方式，其中茎芽和根是在愈伤组织的不同部位分别独立形成的，形成的时间可能也不一致，它们为单极性结构，里面各有维管束与愈伤组织相连，但在不定芽和不定根之间并没有共同的维管束把二者连在一起，另一种是胚胎发生方式，即在愈伤组织表面或内部形成很多胚状体，或称体细胞胚，它们经历的发育阶段与合子胚相似，成熟胚状体的结构也与合子胚相同。胚状体是双极性的，有共同的维管束贯穿两极，可脱离愈伤组织在无激素培养基上独立萌发。l

6、一般认为，愈伤组织中的不定芽起源于一个以上的细胞，而体细胞胚只起源于一个细胞，因此由体细胞胚长成的植株各部分的遗传组成应当是一致的，不存在嵌合现象，不过也有些作者在这类再生植株中同样发现了嵌合现象，因此认为体细胞胚也起源于一个以上的细胞。l 胚状体：在愈伤组织形成以后，培养的细胞团中开始形成结构紧实，解剖结构类似于胚的单细胞来源的培养物。我们称之为胚状体。l 在很多植物中，胚状体的结构都是相当典型的，但在有些植物如小麦中，幼龄胚状体的盾片往往变大变绿，形成通常所描述的“叶状结构”，并且常常出观早熟萌发的现象。l 胚状体与不定芽的区别最根本的特征是具有两极性，在发育的早期阶段，从其方向相反的两端

7、分化出茎端和根端，而不定芽或不定根都为单向极性。胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系，而不定芽或不定根往往总是与愈伤组织的维管组织相联系。胚状体的维管组织的分布是独立的“v”字形，而不定芽的维管组织无此现象。l 胚状体与合子胚的比较合子胚胚状体质量萌发率高，质量好萌发率低，质量差来源受精卵体细胞胚柄有，明显即使有也不明显形态固定，体积相对较小复杂，常有两个以上的子叶体积相对较大变异率低高l 通过胚状体途径产生再生植株有3个显著的优点，首先，在一个培养物上所能产生的胚状体数目往往比不定芽的数目多(例如在一个离体培养的烟草花药上可以产生200个以上的胚状体);其次，胚状体形成的速度

8、快，第三，胚状体结构完整，一旦形成，一般都可直接萌发形成小植株，因此成苗率较高。12 植物组织培养的发展简史l 虽然组织培养技术的蓬勃发展只是近五十年来的事，但它的整个历史可以追溯到十九世纪末和二十世纪初。l 从那时起到现在，组织培养的发展过程大致可以分为三个阶段：121 探索阶段(二十世纪初至30年代中)l 本世纪初，在Schleiden和Schwann所发展起来的细胞学说的推动下，德国植物生理学家Haberlandt提出了高等植物的器官和组织可以不断分割，直至分到单个细胞的观点。为了论证这一观点，他在加入了蔗糖的Knop溶液中培养单个离体细胞，所选用的材料是小野芝麻和凤眼兰的栅栏组织和虎眼

9、万年青属植物的表皮细胞等。遗憾的是，虽然在栅栏细胞中他明显看到了细胞的生长、细胞壁的加厚和淀粉的形成等，但没有一个细胞在培养中能够发生分裂。l Haberlandt实验失败的原因，现在看来主要在于两点：第一，他所选用的实验材料都是已经高度分化了的细胞，第二，所用的培养基过于简单，特别是培养基中没有包含诱导成熟细胞分裂所必需的生长激素，这是因为生长激素在当时还没有发现。然而，做为植物组织培养的先驱者，Haberlandt的贡献不仅在于首次进行了离体细胞培养的实验，而且在其1902年发表的“植物离体细胞培养实验”的报告中，还提出了胚囊液在组织培养中的作用和看护培养法等科学的预见。l 自Haberl

10、andt的实验之后，直到1934年White培养番茄离体根尖的成功，在其间的32年时间里，植物组织培养技术几乎没有什么进展，只是在以下两个方面进行了一些初步的探索。l Laibach(1925，1929)把由亚麻种间杂交形成的不能成活的种子中的胚剖出，在人工培养基上培养至成熟，从而证明了胚培养在植物远缘杂交中利用的可能性；122 奠基阶段(30年代中至50年代末)l 到了30年代中期，植物组织培养领域里出现了两个重要的发现，其一是，认识了B族维生素对植物生长的重要意义，二是发现了生长素是一种天然的生长调节物质。l 导致这两个发现的主要是White和Gautheret的实验。1934年，Whit

11、e由番茄根建立了第一个活跃生长的无性系，使根的离体培养实验首次获得了真正的成功。起初，他在实验中使用的培养基包含无机盐、酵母浸出液和蔗糖。后来(1937)，他用3种B族维生素，即吡哆醇，硫胺素和烟酸，取代酵母浸出液获得成功。l 在这个以后被称为White培养基的合成培养基上，他把某些于1934年建立起来的根培养物一直保存到1968年他逝世前不久。与此同时，Gautheret(1934)在山毛柳和黑杨等形成层组织的培养中发现，虽然在含有葡萄糖和盐酸半胱氨酸的Knop溶液中，这些组织也可以不断增殖几个月，但只有在培养基中加入了B族维生素和IAA以后，山毛柳形成层组织的生长才能显著增加。l 由于这些

12、实验揭示了B族维生素和生长素的重要意义，又直接导致了1939年Gautheret连续培养胡萝卜根形成层获得首次成功。同年，White由烟草种间杂种的瘤组织，Nobecourt由胡萝卜，也建立了类似的连续生长的组织培养物。因此，Gautheret， White和Nobecourt一起被誉为植物组织培养的奠基人。l 40年代和50年代初期，活跃在植物组织培养领域里的研究者以Skoog为代表，研究的主要内容是利用嘌呤类物质处理烟草髓愈伤组织以控制组织的生长和芽的形成。Skoog(1944)以及Skoog和崔澂等(1951)发现，腺嘌呤或腺苷不但可以促进愈伤组织的生长，而且还能解除培养基中生长素(IA

13、A)对芽形成的抑制作用，诱导芽的形成，从而确定了腺嘌呤与生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。l 这些实验结果导致了激动素的发现和以后利用激动素和生长素在组织培养中控制器官分化工作的开展。l 在40年代，组织培养技术的另一项发展是Overbeek等(1941)首次把椰子汁做为补加物引入到培养基中，使曼陀罗的心形期幼胚能够离体培养至成熟。到50年代初，由于Steward等在胡萝卜组织培养中也使用了这一物质，从而使椰子汁在组织培养的各个领域中都得到了广泛应用。l 50年代开始以后，植物组织培养的研究日趋繁荣，10年当中引入注目的进展就有以下6项：1952年，Morel和Martin首次证实，

14、通过茎尖分生组织的离体培养，可以由已受病毒侵染的大丽花中获得无毒植株。l 19531954年，Muir进行单细胞培养获得初步成功。方法是把万寿菊(Tagetes erecta)和烟草的愈伤组织转移到液体培养基中，放在摇床上振荡，使组织破碎，形成由单细胞和细胞聚集体组成的细胞悬浮液，然后通过继代培养进行繁殖。Muir等还用机械方法由细胞悬浮液和容易散碎的愈伤组织中分离得到单细胞，把它们置于一张铺在愈伤组织上面的滤纸上培养，使细胞发生了分裂。这种“看护培养”技术揭示了实现Haberlandt培养单细胞这一设想的可能性。l 1955年，Milier等由鲱鱼精子DNA中分离出一种首次为人所知的细胞分裂

15、素，并把它定名为激动素(kinetin)。现在，具有和激动素类似活性的合成的或天然的化合物已有多种，它们总称为细胞分裂素(cytokinin)。应用这类物质，我们就有可能诱导已经成熟和高度分化的组织(如叶肉和干种子胚乳)的细胞进行分裂。l 1957年，Skoog和Miller提出了有关植物激素控制器官形成的概念，指出在烟草髓组织培养中，根和茎的分化是生长素对细胞分裂素比率的函数，l 通过改变培养基中这两类生长调节物质的相对浓度可以控制器官的分化：这一比率高时促进生根，低时促进茎芽的分化，二者浓度相等时，组织则倾向于以一种无结构的方式生长。l 1958年，Wickson和Thimann指出，应用

16、外源细胞分裂素可促成在顶芽存在的。l 后来，Murashige发展了这一方法，制订了一系列标准程序，把这一方法广泛用于由蕨类植物到花卉和果树的快速繁殖上。l 19581959年，Reinert和Steward分别报道，在胡萝卜愈伤组织培养中形成了体细胞胚。这是一种不同于通过芽和根的分化而形成植株的再生方式。现在知道有很多物种都能形成体细胞胚。在有些植物如胡萝卜和毛茛中，事实上由植物体的任何部分都可以得到体细胞胚。123 迅速发展阶段(60年代至现在)l 60年代以来组织培养技术所以得到了迅速发展，l 一方面是由于有了前60年建立的理论和技术基础，l 另一方面是由于这项技术开始走出了植物学家和植

17、物生理学家的实验室，通过与常规育种、良种繁育和遗传工程技术相结合，在植物改良中发挥了重要的作用，并且在若干方面已经取得了可观的经济效益。60年代以来组织培养技术的发展，概括起来可以分为三个方面：(1)原生质体培养取得重大突破l 1960年，Cocking等人用真菌纤维素酶分离植物原生质体获得成功，大大激发了人们对原生质体培养的热情。l 1971年，Takebe等在烟草上首次由原生质体获得了再生植株，这不但在理论上证明了除体细胞和生殖细胞以外，无壁的原生质体同样具有全能性，而且在实践上可以为外源基因的导入提供理想的受体材料。l 在1985年以前，作为粮食和饲料主要来源的禾谷类植物的原生质体培养鲜

18、有突破，只是最近几年间，水稻、玉米、小麦、高梁、谷子和大麦等的原生质体培养才相继告捷。在这方面，中国学者做出了重要贡献。l 原生质体培养的成功，促进了体细胞融合技术的发展。 (2)花药培养取得显著成绩l 1964年，Guha和Maheshwari报道，在南洋金花中通过离体花药培养由小孢子直接发育成胚。l 1967年，Bourgin和Nitsch通过花药培养获得了完整的烟草植株。由于单倍体在突变选择和加速杂合体纯合化过程中的重要作用，这一领域的研究在整个70年代得到了迅速发展，获得成功的物种数目增加到160余种，其中包括很多种重要的栽培植物。烟草、水稻和小麦等的花培育种在中国取得了引人注目的成就

19、。 (3)微繁技术得到广泛应用l 1960年，Morel提出了一个离体无性繁殖兰花的方法，繁殖系数极高。由于这一方法有巨大的实用价值，很快被兰花生产者所采用，迅速建立起“兰花工业”，目前，用这种方法繁殖的兰花至少已有35个属150余种。l 除兰花外，在其他很多观赏植物和经济作物(如甘蔗和草莓等)中，微繁也已达到了工厂化的生产规模，在若干作物中与通过茎尖培养进行脱毒相结合，产生了可观的经济效益。13 组织培养与农业的关系组织培养一方面可为遗传工程提供理想的受体材料，另一方面又可为常规的植物改良程序提供一种新的手段，从而使很多用传统方法难以解决的问题迎刃而解，更多更快更好地创造出各种农作物和园艺植

20、物的新品种、新类型和新种质。例如：在自花授扮作物杂交育种中，或在异花授粉作物自交系选育过程中，采用花药培养技术不但可缩短杂合体纯合化所需的时间，而且还可以节省土地面积，假定两个杂交亲本在n个独立遗传的位点上彼此不同，通过花药培养，在理论上只要有2n个F1代花粉植株，就有可能得到一个所需要的基因组合，而利用传统育种方法，则至少要有4n个F2植株才能得到这样一个组合。在远缘杂交中，通过离体授粉或原生质体融合有可能克服受精前障碍，通过幼龄合子胚培养可以克服受精后障碍，通过体细胞融合还有可能制造出细胞质杂种。对于无药可治的病毒病，可通过茎尖培养消除病毒，这对解决马铃薯种薯退化问题能发挥重要作用，在其它

21、很多植物中也可用以建立无毒原种。通过离体诱导不定芽或促进腋芽生枝，可对很多重要的园艺植物和名贵花卉、树种进行快速繁殖。应用在细胞水平上进行突变体选择的技术，可以在一定程度上使高等植物的育种程序微生物化，从而大大提高选择效率，节省时间和土地面积，并且不受季节的限制。体细胞无性系变异是除有性杂交和理化诱变之外的第三个变异来源，这种变异在育种中的利用价值已经引起人们的广泛注意。通过用人工种皮包被体细胞胚制造人工种子，为某些稀有和珍贵物种的繁殖提供了一种高效的手段。利用药用植物进行组织培养，生产有价值的次生代谢产物。如人参，三七中的药用成分（皂苷）可以大量生产。特别是在无性繁殖植物中，通过对茎尖分生组

22、织等离体材料进行超低温保存，不但可以大大节省空间，而且还不致受到病虫害的侵袭，并便于无毒种质的国际交换。2 实验室的基本设备和一般技术21 引言 一个组织培养实验室的面积大小和装备程度取决于两个因素：一是所要进行的实验的性质，二是所能得到的经费的多少。 然而，一个标准的组织培养实验室应当具备的设施：玻璃器皿、塑料器皿和其他实验器皿的清洗和贮存； 培养基的制备、灭菌和贮存； 植物材料的无菌操作； 将培养物保持在温度、光照、可能时还有湿度的可控条件下； 培养物的观察。 为此至少需要有两个隔开的房间：一间用于玻璃器皿的清洗和贮存，以及培养基的制备(培养基室)，第二间用于放置培养物(培养室)。培养室内

23、应放一张桌子，上置双筒解剖镜和所需的光源，以便对培养物进行镜检。22 设 备221 培养基室 配制培养基所需的一般设备包括： 工作台其高度应适合于站着工作，低温冰箱用以贮存贮备液和椰子汁等，若无低温冰箱，在普通冰箱内也可短期贮存，普通冰箱用以贮存各种化学药品、植物材料，和短期贮存贮备液等；大塑料瓶用以贮存蒸馏水；天平；电热磁搅拌器用以溶解化学药品，酸度计吸气机或真空泵用以辅助过滤灭菌；恒温水浴锅用以融化琼脂，高压灭菌锅或家用压力锅 用以进行培养基灭菌。222 培养容器 各种不同类型的容器都可用来培养植物材料。 玻璃试管 广口玻璃瓶牛奶瓶和罐头瓶塑料容器 耐高温高压的透明塑料封口，橡皮圈箍扎22

24、3 培 养室 培养室的温度应当是可控的，一般是用空调或热风机使温度保持在252。 培养一般是在散射光下进行的，但有些情况下也需要较强的光照或完全黑暗，设备上对此应当有所准备。 当培养室的相对湿度降到50以下时，应采取措施增加湿度。一般应75%相对湿度。 进行悬浮培养，培养室内还应设有摇床 最好设置一台备用发电机 在培养室内应设有若干培养架以放置培养物，每层分别装有日光灯管，小风扇。23 技 术231 玻璃器皿和塑料器皿的清洗 传统办法是用洗液(重铬酸钾和浓硫酸混合液)浸泡约4h 现在都使用特制的洗涤剂 放入高压锅中灭菌 超声波洗涤柜232 灭 菌 培养基的污染有几个可能的来源：1培养容器，2培

25、养基本身，3外植体，4接种室的环境，5在接种和继代时用以操作植物材料的器械，6培养室的环境。下面讨论防止由这些来源造成污染的各种措施。1培养基 置于高压灭菌锅中，由培养基达到要求温度的时刻算起，在106kgcm2的压力下(121)消毒1540min。灭菌作用取决于温度，而不是直接取决于压力。 所需的时间随着要进行消毒的液体的容积而变化 当冷却被消毒的溶液时必须十分当心，如果压力急速下降，超过了温度下降的速率，就会使液体滚沸，从培养容器中溢出。 只有当高压灭菌锅的压力表指针回到零(温度不高于50)时，才能打开灭菌锅。表2.1 培养基蒸汽灭菌的最少时间 某些生长调节物质(如GA，、玉米素，ABA)

26、，尿素以及某些维生素等，遇热时容易分解，不能进行高压灭菌。 热分解化合物溶液的灭菌是通过滤膜过滤进行的，然后再将之加入高压灭菌过的培养基中。 在进行溶液过滤消毒时，可使用孔径为045微米或更小的细菌滤膜。 过滤器的灭菌温度非常重要，不应超过121 把一个装有需要灭菌的溶液的带刻度注射器(不必消毒)安到已灭过菌的过滤器组件的一端，缓慢地推动溶液使之穿越安在这个过滤器组件中间的细菌滤膜，过滤后的溶液由过滤器组件的另一端滴下来，直接加入培养基中。2玻璃器皿、塑料器皿和器械 玻璃培养容器常常与培养基一起灭菌 对于无菌操作所用的各种器械，如镊子、解剖刀、解剖针和扁头小铲等，一般的消毒办法是把它们先在95

27、酒精中浸一下，然后再置火陷上灼烧，待冷却后使用。3植物材料 有若干种灭菌剂可用来进行植物组织消毒， 应当正确选择消毒剂的浓度和处理时间，以尽量减少组织的死亡。 一般来说，如果外植体较硬较大，容易操作，可直接用灭菌剂进行处理。 若要培养柔嫩的茎尖或花粉粒，须分别把茎芽或花蕾进行表面消毒，然后在无菌条件下取出外植体。这类外植体一般都不带污染微生物。表2.2 一些表面消毒剂的消毒效果4接种区 最后必须特别强调的一点是，无论是接种还是继代，当培养容器敞着口的时候，必须从各方面注意防止任何污染物进入容器，为此所有的操作都必须在严格的无菌条件下进行。近年来多数实验室都使用各种类型的超净工作台进行无菌操作。

28、 超净工作台-内都装有一个小电动机,粗过滤器,细过滤器,空气的速度大约是273mmin。l 植物组织无菌培养的一般步骤 置于一个有螺丝盖的玻璃瓶中浓度适当的消毒液无菌蒸馏水34次将材料取出，置于一个已经灭过菌的培养皿中对所要使用的器械进行消毒使用这些消过毒的器械外植体接种到培养基上瓶口置酒精灯火焰上烘烤数秒钟，然后迅速用瓶盖或瓶塞封严第三章培养基1 培养基的种类及组成n 由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质、有机附加物、水和介质等几大类组成，为培养物提供营养、水分和固定场所。n 对于培养基的命名，一般采用“发明人发表年份”或“培养基代号发表年份”表示， n 培养基的类别，依据形态不同可分为

29、固体培养基和液体培养基， n 依据培养基中是否加有生长调节物质和附加物质，则可将培养基分为基本培养基和完全培养基，n前者只含有无机营养物（包括大量元素和微量元素）、维生素、氨基酸、碳水化合物和水。后者在前者，即基本培养基的基础上，根据各种不同试验要求，附加一些物质，如各种植物生长调节剂 n 培养基(Medium)是外植体生长的营养和基质。n 培养基提供的营养包括碳水化合物、无机氮和有机氮、其他矿质营养，维生素等等。n 在配制培养基时，还应考虑离子平衡和物质平衡问题，n 大多数植物离体培养中所用的培养基都是由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等几大类组成.n 无机营养物主要包括大

30、量元素和微量元素。大量元素包括N、P、K、Ca、Mg、S，n N通常为硝态氮或铵态氮，在培养基中多以KNO3或NH4NO3的形式提供，氮素不仅为培养物的生长提供营养，而且是胚胎发生的必需条件之一。n P是植物的必需元素之一，参与生命活动中核酸及蛋白质合成、光合作用、呼吸作用以及能量的贮存、转化与释放等重要的生理生化过程，在离体培养中需要大量的P；K是主要的阳离子， n 微量元素是指Fe、Cu、Mn、B、Zn、Mo和Cl等，其需要量很少，一般用10-510-7mol.L-1,过多则产生毒害。n 有益元素是指非必需的、但对培养物的生长发育有益的一些元素，如硅（Si）、碘（I）、（Se）、钴（Co）

31、和钠（Na）等， n 各种元素中，除Fe以螯合形式(如Fe-EDTA)供给、少部分的氮素由有机氮供给外，其它的元素一般以离子态提供。1.2 碳源（carbon sources）和能源n 需要在培养基中添加一些碳水化合物作为生长发育的能源，这些碳源物质包括糖类物质、醇类物质和有机酸，以糖类物质最为重要。n 一般地说，蔗糖是最好的糖源。其次，是葡萄糖和果糖n 对蔗糖的需求范围是15%.在幼胚培养、花药培养和原生质体培养时，需要较高浓度的糖类物质，一般为10%左右或更高。n 植物细胞壁中存在着各种水解酶。 n 在离体培养中通常以B族维生素为主，使用浓度一般为0.11.0mg.L-1。n 肌醇（环己六

32、醇）是一种特殊的物质， n 维生素类一般易溶于水，但耐热性差，高温下易降解。n 在一些培养基中加入一些氨基酸，除提高营养外，可起到缓冲和调节培养物的体内营养平衡的作用，能够促进离体根的生长，促进培养物的生长发育。 n 氨基酸的通常用量为23mg.L-1，水解酪蛋白和水解乳蛋白的用量一般为0.050.1%。n 生长调节物质是培养基中不可缺少的关键物质，其用量虽然极少，但对外植体愈伤组织的诱导和分化起着重要和明显的调节作用，其中最常用的是生长素类和细胞分裂素类。n它们的活性强弱顺序为2,4-DNAAIBAIAA。IAA的使用浓度一般为10-5-10-10mol.L-1，常用110mg.L-1， n

33、 IAA是生物合成的激素，见光或在酶促氧化作用下容易降解失活。故IAA的使用浓度一般较高（130mg.L-1），n 常用的细胞分裂素有激动素（KT）、6-卞基腺嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）、2-异戊烯腺嘌呤（2-iP）、n 其活性的强弱顺序为TDZ，4PUZT2-iP6-BAKTAD。n 最常用的分裂素是性质稳定、价格适中的6-BA和KT，使用浓度为10-610-7mol.L-1。n 赤霉素（GA），溶于甲醇、乙醇或碳酸氢钠溶液，在水中会迅速分解，故需用乙醇溶解并保存。（）脱落酸（ABA）n 脱落酸具有抑制蛋白质合成、抵消或抑制生长素、细胞分裂素和赤霉素发挥作用的功效，并能够诱导休眠、促进

34、衰老和脱落的发生。（）乙烯及其它生长抑制剂乙烯的生理作用有，促进果实成熟、促进脱叶和衰老；促进次生物质的排泌；促进菠萝开花、增加黄瓜等的雌花数量等。n离体培养中有时还会用n 琼脂纯化：为了得到更纯净的琼脂，可将干琼脂450g放在8L大瓶中，加蒸馏水5L和吡啶0.5L，20小时后滤去液体，用蒸馏水冲洗3次，再用95酒精浸泡12小时，取出并晾干。n 琼脂的凝固能力除与原料、厂家和加工方式有关外，还与高压灭菌的温度、时间、pH值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸及高温会使琼脂发生水解，失去凝固能力。存放时间过久，也会逐渐失去凝固力，在使用中应注意。活性炭具有强大的吸附能力，故使用的浓度不

35、宜过高，一般在0.10.5%。活性炭的吸附能力还与温度有关，低温下吸附能力强，高温下吸附能力减弱，甚至解吸附。n AgNO3中的Ag+通过竞争性地结合于细胞膜上的乙烯受体蛋白，能起到抑制乙烯活性的作用。需配制不同的培养基，或加入不同的植物激素，除了用铅笔或油笔标记外，一个可行的办法，是在培养基中滴加13滴1的活体染色剂，对于内生菌的情况，可使用抗生素类物质进行抑菌2 几类常用培养基的特性根据无机盐用量，培养基类型可以分为高盐型培养基，高KNO3型培养基，中盐型培养基， 低盐型培养基。 LS（1965）和RM（1964），把硝酸铵从1650mg.L-1升至4950mg.L-1，磷酸二氢钾从170

36、mg.L-1升至510mg.L-1，成为一个极高盐的配方。2.4 低盐型培养基低盐型培养基的特点是无机盐浓度低，约为MS的1/4，适用于生根培养、成熟胚胎培养或种质材料的保存，包括White（1943），改良White（1963），HB（1963），WS（1966）和Knop（1965）等，其中Knop（1965）仅包括4种成分，可用作水培的培养液，改良White（1963）则比较多用于木本植物。3 培养基的配制最好是蒸馏水或双蒸水，分析纯或化学纯级别的试剂， 药品的称量及定容都要准确，不同的化学药品需使用不同的药匙，国内化学试剂的分级与缩写分析纯试剂AR 红化学纯试剂CP 蓝优级纯试剂GR

37、绿实验试剂LR 中黄n 培养基母液类型包括无机盐、维生素以及在水溶液中稳定的生长调节物质等。n母液的配制有两种方法：一种是配制成单一化合物母液，一种是配成几种不同化合物的混合母液。n 植物生长调节物质，配制成母液时，一般宜配制成0.5或1.0mg.mL-1的母液， n 由于多数生长调节物质难溶于水，因此配法各不相同。酸类物质可用少量的1mol.L-1 NaOH溶解， GA3用95酒精溶解，玉米素可先溶于少量95酒精。n所有的生长调节剂母液应贮于试剂瓶中，存放在冰箱内避光保存。植物生长调节物质浓度的表示有两种单位：以前常用ppm(或每升毫克数)，现状更提倡用mol.L-1， n 3.贴标签。配制

38、好的各种母液应分别贴上标签，写明母液名称、配制倍数、日期及配1L培养基时应吸取的量。培养基的pH值直接影响到培养物对离子的吸收，培养基的pH值还影响琼脂的凝固。所以，当培养基配制好后应立即进行pH值的调整。培养基若偏酸时用l mol.L-1的NaOH来调节，偏碱则用1 mol.L-1的HCl调节。一般将培养基的pH值调节到5.46.0。n 培养基分装后应立即进行热压灭菌处理。培养基凝固后，将其放到培养室中23d，若没有杂菌污染即可放心使用。暂时不用的培养基应放置于10下保存，而含有生长调节物质的培养基在45低温下保存更佳。培养基的配制过程小结培养基母液的配制与贮存n 大量元素4冰箱内贮藏n 微

39、量元素母液宜分装成1ml每管, 贮于-20, n 铁盐母液和维生素母液也适于此做法。生长调节剂的溶解n 脱落酸ABA 1mol/L NaOHn 苄基腺嘌呤BA 1mol/L NaOHn 2，4二氯苯氧乙酸2,4-D 乙醇/mol/LNaOHn 赤霉酸GA 乙醇n 吲哚乙酸IAA 乙醇/mol/LNaOHn 吲哚丁酸IBA 乙醇/1mol/L NaOHn 激动素KT 1mol/L NaOHn 萘乙酸NAA 1mol/L NaOHn 玉米素ZT 1mol/L NaOH生长调节剂配制过程n 先用有机溶剂或碱溶解, 溶解后将生长调节剂溶液倒入水中, 则不是反过来。含生长调节剂的培养基灭菌方法n高温灭菌

40、而活性不会明显丧失的有: 2,4-D, NAAn 再灭菌, 但活性会部分丧失的有: ABA, BA, GA3, IAA, IBA,KT, TDZ, ZTn 只采用过滤除菌的有: CPPU脲类细胞分裂素, GA4, GA7, JA茉莉酸甲酯抗生素的配制与贮存n 用甲醇或乙醇溶解的有：Rif利福平，Tet四环素等。n 抗生素用无菌水或有机溶剂配制后分装、冰冻保存。 影响固体培养基凝固的因素n 浓度， n pH， n 延长灭菌时间， 灭菌对培养基pH的影响n 一般认为，MS培养基经灭菌后pH下降0.10.3个单位。第四章 离体培养基本技术-外植体第一节外植体的类型及其选择与处理n 外植体是指用于接种

41、培养的各种离体的植物材料，包括胚胎材料、各种器官、组织、细胞甚至原生质体等。n 外植体是从植物体上取下的用于离体培养的材料， n 植物离体培养能否成功，既决定于培养基、培养条件等外在因素，也决定于外植体这一重要的内在因素。1 外植体的类型及选择依据同一植株的不同器官、组织或其它材料，以及植株的质量、年龄、生理状态、取材季节甚至天气状况等，都会直接或间接地影响离体操作和培养工作的成败。茎段、花茎或花梗（带节或不带节的材料）n 对假轴分枝型植物这一类植物可采用带节的茎段进行培养，促使节位上的腋芽萌发，实现植株的再生。也可采用不带节的茎段进行培养，还可以采用花茎或花梗这样的变态茎作为外植体，蝴蝶兰以

42、花梗侧芽、花梗节间作为外植体， B.花药用于单倍体植株的诱导。根尖、根段、块根、块茎、果实及汁胞都属于体细胞组织，除根尖外，分化程度都比较高，故一般需要脱分化形成愈伤组织和再分化的过程，才能实现植株再生，并且再生的难度可能比较大（如果实和汁胞材料）。1.2 外植体的选择依据n外植体的生理状态n木本植物的发育年龄n取材的季节n外植体的大小n其它方面 外植体的生理状态n幼嫩、生理状态活跃的材料比较容易培养，春天植物开始生长，芽膨大而鳞片未开裂时取材最为合适， n 不提倡采用处于休眠状态的外植体材料 木本植物的发育年龄n 发育年龄对培养材料的形态发生能力有较大的影响。下部的芽及其长成的枝条的再生能力

43、较强， 这可能与DNA的甲基化；与细胞分裂的次数有关，n 成年态性一般是越来越强，离体培养也越加困难，对于这样的情况，需要改用幼年态材料或是对成年态材料进行返幼处理，使其恢复幼态性后再行培养。返幼处理的方式：选用根蘖苗材料；促其萌发桩苗、低位苗或徒长枝；生长激素处理。后果，是再生植株的幼年期（包括营养期）也会延长，一个较好的方法，是将植株种植于在温室内，从温室植株上取材，能够最大限度地克服季节与气候的干扰。 外植体的大小外植体越小，接种的成活率就越低，但过大的外植体，可能增加污染。脱毒培养时，又要求外植体尽量的小，以提高脱毒的效率。一般选取0.51.0cm的外植体为宜，其它方面：应选择优良的基

44、因型，并从健壮无病的植株上取材， 2 外植体的预处理及灭菌2.1 减少带菌的处理减少材料的初始带菌量是降低污染率的最有效的措施。最好是在长期晴朗的天气条件下取样、选择新萌发的幼芽或嫩梢、选择表面比较光滑的材料、对母株定期喷洒杀菌药剂、用纸袋或薄膜袋将枝条封套保护待其萌发新芽后取样、在室内采用水插促芽后采样，或是在温室植株上采样等， 2.2 消毒剂的杀伤力和材料对消毒剂的耐受力n对于坚硬致密的外植体材料（如成熟种子），可采用渗透力强的消毒剂（如75酒精）进行表面灭菌，然后用0.1升汞处理数十分钟。2.3 清洗的重要性外植体经消毒剂处理后，必须用无菌水洗去残存的消毒剂，否则其会对外植体造成长期的伤

45、害，尤其是那些附着力强、难以洗去的消毒剂如升汞等，一定要清洗多次。2.4 内生菌问题可在培养基中添加一定浓度的广谱抗生素， 2.5 切割与接种的技巧n 外植体的大小会影响成活率，故应将材料切分成适宜的大小后接种。n 接种的方向也比较重要，茎尖、茎段应保持直立、先端向上接种，叶片材料可用插接，也可平放于培养基表面，但平放时一般将叶背朝下，以利于对培养基的吸收。3 褐变的防止褐变问题已成为离体培养的三大难题之一（另两个问题是污染和玻璃化）。3.1 褐变的原理：多酚氧化酶催化酚类物质氧化成褐色的醌类3.2 影响褐变的因素 基因型n木本植物一般比草本植物容易发生褐变， n 同种植物的不同类型或基因型，

46、发生褐变的程度也有不同。3.2 影响褐变的因素 外植体的生理状态及发育年龄一般说来，随着年龄和组织木质化程度的增加，褐变会有所加强；另外，分化程度高的材料（如叶片）比分化程度低的材料（如茎尖）容易褐变；成熟度高的材料比幼嫩材料容易褐变。伤口创面大、外植体体积小的材料较易褐变，在取材和切割时应注意。n 液体培养基能有效地克服外植体的褐变，在液体培养基中加上滤纸桥n 培养基成分对褐变也有一定的影响，适当降低无机盐浓度有利于减轻褐变。3. 2 影响褐变的因素 培养基组份的影响n 此外，高浓度的蔗糖、丝氨酸、铵态氮、硼素及细胞分裂素类的BA、KT等可能具有促进多酚合成或刺激多酚氧化酶活性的作用，加剧褐

47、变发生，而生长素类如2，4-D和NAA则能延缓多酚合成，减轻褐变。n 事先对母株或枝条遮光处理后再取材接种，则褐变可以减轻；光照促进离体培养中酚的氧化，因此，采用暗培养或弱光照培养能够减轻褐变。3.2 影响褐变的因素 培养条件n 较高的培养温度能刺激PPO活性提高，从而加速培养物的褐变，代期长短与褐变也有关系，代期过长，加剧褐变的发生。3.2 影响褐变的因素 每代的培养时间3.3 防止褐变的措施选择适当的基因型和外植体选择适当的外植体材料及培养条件是克服褐变的最主要手段。3.3 防止褐变的措施 母株和外植体的预处理n遮光或将母株栽植于温室内， n 外植体的预处理方式可多种多样，如低温处理（5）、饥饿处理和热处理等，但最多用的是药剂处理， 3.3 防止褐变的措施在培养基中添加抗氧化剂、防褐变剂或解毒剂n 通常使用的药