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1、罗布麻对红细胞膜脂质过氧化损伤的保护作用【关键词】 ,罗布麻摘 要 目的 研究罗布麻提取物对红细胞膜脂质过氧化损伤的保护作用。方法 采用三种活性氧产生体系诱发脂质过氧化为实验模型，设立模型对照组（MC），正常对照组（NC），以及剂量分别为0.1，0.2，0.4，0.8 mg/mL的四个罗布麻提取物给药组，观察比较各组的丙二醛（MDA）含量。结果 同MC组相比，四组罗布麻提取物对黄嘌呤黄嘌呤氧化酶系统，H2O2及UV照射三种方法引起的细胞膜脂质过氧化产物丙二醛（MDA）的生成增加均有抑制作用，且有一定的剂量依赖关系。结论 罗布麻醇提物对自由基引起的细胞膜脂质过氧化损伤有保护作用。关键词 罗布麻；
2、自由基；红细胞膜；脂质过氧化、细胞膜具有维持细胞完整性和功能的作用。因其富含饱和脂肪酸最易受自由基攻击，自由基对细胞膜的损伤主要是产生脂质过氧化反应，从而引起膜结构和功能的改变。因此，抗氧化剂可有效地防止自由基对细胞膜脂质的过氧化损伤。罗布麻属于夹竹桃科植物（Apocynum venetum）,又名红麻，是生长在盐硷沙荒地区的野生植物，我国罗布麻的资源非常丰富，分布范围小，用罗布麻作茶饮及药用有悠久的历史。现代研究认为其可预防和治疗老年高血压、感冒、气管炎，对增强机体抗病能力均有一定的作用。罗布麻提取物的主要成分为黄酮类化合物1，而黄酮类化合物由于含有还原性酚羟基，可直接清除氧自由基，抑制脂质
3、过氧化。本文观察了罗布麻提取物对体外黄嘌呤黄嘌呤氧化酶、过氧化氢（H2O2）和UV照射等三种自由基产生体系诱导细胞膜脂质过氧化的影响，报道如下。1 仪器与材料1.1 药物与试剂罗布麻叶购自武汉市药材公司，经鉴定为Folium apocyni Veneti。黄嘌呤（Xan）和黄嘌呤氧化酶（XO）为Sigma公司产品，考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒和丙二醛（MDA）测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所，其他试剂均为国产分析纯。1.2 动物大白兔购于华中科技大学同济医学院动物实验室1.3 仪器UV-2201紫外分光光度计（日本岛津）、高速冷冻离心机（Sigma 公司）1.4 实验药物的制备2罗布麻叶100
4、 g，用=70乙醇回流提取2次，每次1 h，合并提取液，回收溶剂后，得到浸膏20.9 g。取该浸膏，用蒸馏水配成浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL的溶液，经02 m微孔滤膜过滤，4 保存备用。2 方法与结果2.1 方法2.1.1 红细胞膜的制备兔全血在04 用低渗溶血法3制备，膜蛋白含量用考马斯亮蓝试剂盒测定，得膜蛋白浓度0.098 g/L4。2.1.2 Xan-XO 体系诱导细胞膜脂质过氧化各取细胞膜悬液（0.098 g/L）0.5 mL，分别加待测药物01 mL（对照加pH 7.8磷酸盐缓冲液），置37 水浴15 min，再加1.0 mmol/L Xan溶液0.3 mL，
5、0.4 U/mL XO 0.1 mL, 立即将反应管置37 水浴1 h待测。2.1.3 H2O2诱导细胞膜脂质过氧化以2 mol/L H2O2 (终浓度为18 mmol/L) 代替 Xan-XO，用pH7.8磷酸盐缓冲液补充反应体系的体积至1.0 mL，其余条件同“2.1.2”项。2.1.4 UV照射诱导细胞膜脂质过氧化反应终体积为1 mL，内含细胞膜0.5 mL及不同浓度的药物或等体积的磷酸盐缓冲液，反应管置紫外灯下照射1 h后待测。2.1.5 脂质过氧化物的检测采用MDA试剂盒测定,测定过氧化脂质降解产物中的丙二醛（MDA）含量以反映脂质过氧化程度。 以下式计算罗布麻对反应体系诱导MDA生
6、成的抑制率：抑制率=对照组MDA含量-给药组MDA含量对照组MDA含量-正常组MDA含量1002.1.6 统计学处理MDA数值采用s的形式，多组资料间的两两比较用t检验，P0.05认为有显著性差异。2.2 结果2.2.1 罗布麻醇提物对Xan-XO体系诱导细胞膜脂质过氧化生成的影响结果表明，Xan-XO系统可诱导细胞膜发生脂质过氧化反应，使对照组的MDA含量明显升高（P 0.001）；四个罗布麻组的MDA值较对照组均有显著下降，并有一定的剂量依赖关系（P 0.001,P 0.01）。见表1。表1 罗布麻对Xan-XO诱导细胞膜脂质过氧化生成的影响（略）2.2.2 罗布麻醇提物对H2O2诱导细胞
7、膜脂质过氧化生成的影响结果表明，H2O2可诱导细胞膜脂质过氧化反应，使对照组的MDA含量明显升高（P0.001）；四个罗布麻组的MDA值较对照组均有显著下降，并有一定的剂量依赖关系（P0.001,P 0.01）。见表2。表2 罗布麻对H2O2诱导细胞膜脂质过氧化生成的影响（略）注：与对照组比较，*P 0.001, *P0.012.2.3 罗布麻醇提物对UV照射诱导细胞膜脂质过氧化生成的影响结果表明，UV照射可诱导细胞膜脂质过氧化反应，使对照组的MDA含量明显升高（P0.001）；四个罗布麻组的MDA值较对照组均有显著下降，并有一定的剂量依赖关系（P0001, P 0.01）。见表3。表3 罗布
8、麻对UV照射诱导细胞膜脂质过氧化生成的影响（略）注：与对照组比较，*P0.001, *P进入该公司展台考马氏亮蓝G250染色法使用方法【操作步骤】1、标准曲线的制备：按下表操作，在试管中分别加入0、20、40、80、100微克蛋白标准溶液，用水补足到100微升，加入3ml的染色液，混匀后室温放置15分钟。编号123456蛋白标准（ml）00.020.040.060.080.10蒸馏水（ml）0.100.080.060.040.020染色液（ml）333333在595nm波长比色，读出吸光度，以各管的标准蛋白浓度为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘出标准曲线。2、血清蛋白质测定稀释血清（或其它蛋白样品
9、溶液），准确吸取0.1ml血清，置入50ml容量瓶中，用生理盐水稀释至刻度（此为稀释500倍，其它蛋白样品酌情而定）。再取三只试管，分别标以1、2、3号，按下表操作。混匀后室温放置15分钟，在595nm波长比色，计算蛋白质浓度。 试剂（毫升）1（空白管）2（标准管）3（样品管）蒸馏水0.1蛋白质标准0.1稀释血清0.1染色液333【原 理】考 马氏亮蓝G250具有红色和青色两种色调、在酸性溶液中游离状度下为棕红色，当它通过疏水作用与蛋白质结合后，变成蓝色，最大吸收波长从465nm转移 到595nm处，在一定的范围内，蛋白质含量与 595nm的吸光度成正比，测定595nm处光密度值的增加即可进行
10、蛋白质的定量。【注意事项】1、常用试剂的干扰：有些常用试剂在测定中会受到不同程度的干扰。Tris、巯基乙醇、蔗糖、甘油、EDTA及少量去垢剂有较少影响，而1SDS、1 TritonX-100及1Hemosol的干扰严重。2、显色结果受时间与温度影响较大，须注意保证样品与标准的测定控制在同一条件下进行。3、考马氏亮蓝G250染色能力很强，特别要注意比色杯的清洗。颜色的吸附对本次测定影响很大。可将测量杯在0.1mol/L HCl中浸泡数小时，再冲洗干净即可。【试 剂】1、考马氏亮蓝G250染色液：称取100mg考马氏亮蓝G250溶解于50毫升95的乙醇中，加入100 毫升85的磷酸，加入稀释到1升。2、蛋白标准（0.1mg/ml）准确称取10mg牛血清白蛋白，在100ml容量瓶中加生理盐水至刻度，溶后分装，20冰箱保存。【计 算】每100毫升血清中蛋白质的含量（g）此方法是1976年Bradform建立。染料结合法测定蛋白质的优点是灵敏度较高，可检测到微量蛋白，操作简便、快迅，试剂配制极简单，重复性好，但干扰因素多。