酶工程复习提纲2009.doc

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1、酶工程复习提纲第二章 酶的定义、组成、特征及分类 一、从化化学本质上讲酶到底是一种什么物质？二、一般催化剂的特性：1.只能进行热力学上允许进行的反应；2.可以缩短化学反应到达平衡的时间，而不改变反应的平衡点；3.通过降低活化能加快化学反应速度。4.它本身的数量和化学性质在化学反应后不发生改变。三、酶作为催化剂的显著特点：高效、专一、温和、可调节四、酶的分类(一)、酶的组成分类单纯酶:它们的组成为单一的蛋白质。 结合酶（全酶）: 蛋白质（酶蛋白）+辅因子酶蛋白决定反应的特异性，辅因子决定反应的类型与性质。辅因子： 辅酶：与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去的辅因子。 辅基：与酶蛋白结合紧密

2、，不能可用透析或超滤的方法除去的辅因子。(二)、酶的结构分类(1)、单体酶(monomeric enzyme) :仅具有三级结构的酶，即只由一条肽链组成的酶。 (2)、寡聚酶(oligomeric enzyme)：两个或两个以上的相同或不同亚基以共价键方式连接而形成的酶。 (3)、多酶复合体(多酶体系，multienzyme system):由几种功能不同的酶聚合在一起，分工合作。共同催化一个生化反应过程。 (4)、多功能酶(multifunctional enzyme)：一些多酶体系在进化的过程中由于基因融合，致使多种不同催化功能存在于一条多肽链上，这种一条肽链具有多种催化功能的酶叫多功能酶

3、。（三）、酶的功能组成酶的活性中心 酶的活性中心：与底物结合并进行催化反应的特殊的必需基团。 结合基团：决定酶的专一性活性中心内的必需基团必需基团： 催化基团：决定酶的催化性质活性中心外的必需基团：维持酶的空间结构和催化功能所必需的基团五、酶的专一性;第三章 酶的作用机理一、酶作用专一性的机制(一)“三点结合”的催化理论三点结合”的催化理论认为酶与底物的结合处至少有三个点，只有当三点完全结合的情况下。催化作用才能实现，酶促反应才能进行。（二）锁钥学说锁钥学说认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样，那把钥匙开那把锁。也就是说，只有当

4、底物的形状与酶的活性中心的构象完全匹配时，酶与底物才能结合，催化反应才能进行。(三)诱导嵌合学说(Induced fit model）酶活性中心的结构有一定的灵活性，当底物（激活剂或抑制剂）与酶分子结合时，在底物的诱导下，酶蛋白的构象发生了有利于与底物结合的变化，使反应所需的催化基团和结合基团正确地排列和定向，这样酶与底物才能很好地结合，酶促反应才得以进行。二、酶高效催化的机制 (一)、酶为什么能催化化学反应、分子发生化学反应的必要条件：活化能和能障在化学反应体系中，并不是所有的分子都能参加化学反应，只有那些所含能量达到或超过一定限度（平均能量）的分子才能参与反应。这些能参与反应的分子称为活化

5、分子，由常态分子转变为活化分子所需的能量称为活化能。活化分子含有的能参与化学反应的最低限度的能量称为化学反应的能阈或能障。因此，只有那些所含能量大于能障的分子才能参与化学反应。在一个化学反应体系中，活化分子越多，反应就越快。所以，设法增加活化分子数，就能加速化学反应。、增加活化能（活化分子）的途径增加活化分子有两种可能的途径：一是加热或光照射增加能量，使一部分分子获得能量而活化，直接增加活化分子数目，以加速化学反应的进行。另一种途径是降低活化能的阈值，间接增加活化分子数目。催化剂的作用就是降低反应的活化能。酶是如何降低化学反应的活化能的呢？（二）、有关酶高效率机理的假说 1、中间产物学说中间产

6、物学说是目前较公认的解释酶作用机理的理论。这个理论认为：在酶促反应中，底物先与酶结合，形成不稳定的中间产物ES复合物，然后再分解释放出酶与产物。ES的形成，改变了原来反应的途径。酶的活性中心与底物分子通过短程非共价键(如氢键,离子键和疏水键等)的作用，形成ES复合物，使底物的价键状态发生形变或极化，从而激活底物分子和降低过渡态活化能，使底物的活化能大大降低，结果使反应加速。 2.趋近效应(approximation)和定向效应(orientation)通常底物浓度与化学反应速度成正比。若在反应系统的某一局部区域，底物浓度增高，则反应速度也随之提高。趋近效应指由于活性中心的立体结构和相关基团的诱

7、导和定向作用，使底物分子中参与反应的基团相互接近，底物在酶活性中心的有效浓度大大增加，并被严格定向定位，从而降低了进入过渡态所需的活化能。使酶促反应具有高效率。酶的活性中心部位，一般都含有多个起催化作用的基团，这些基团在空间有特殊的排列和取向，可以对底物价键的形变和极化及调整底物基团的位置等起到协同作用，从而使底物达到最佳反应状态。3、张力作用(distortion or strain)底物的结合可诱导酶分子构象发生变化，比底物大得多的酶分子的三、四级结构的变化，也可对底物产生张力作用，使底物扭曲，促进ES进入活性状态。4、酸碱催化 (acid-base catalysis)酸和碱是有机反应中

8、用途最广和最普遍的催化剂。酸-碱催化可分为狭义的酸-碱催化和广义的酸-碱催化。酶参与的酸-碱催化反应一般都是广义的酸碱催化方式。广义酸碱催化是指通过质子酸提供部分质子,或是通过质子碱接受部分质子的作用，达到降低反应活化能的过程。酶的活性中心具有某些氨基酸残基的R基团，这些基团往往是良好的质子供体或受体，在水溶液中这些广义的酸性基团或广义的碱性基团对许多化学反应是有力的催化剂。如氨基、羧基、巯基、酚羟基及咪唑基等。影响酸碱催化反应速度的因素有两个：第一个因素是酸碱的强度。第二个因素是这些功能基供出质子或接受质子的速度。共价催化：催化剂通过与底物形成反应活性很高的共价过渡产物，使反应活化能降低，从

9、而提高反应速度的过程，称为共价催化。某些酶与底物结合形成一个反应活性很高的共价中间产物，这个中间产物以较大的机率，转变为过渡态，因此反应的活化能大大降低，底物可以越过较低的能障而形成产物。5、共价催化作用可分为亲核催化作用和亲电子催化作用两大类。 亲核催化作用：亲核催化是指具有一个非共用电子对的基团或原子，攻击缺少电子具有部分正电性的原子，并利用非共用电子对形成共价键催化反应。酶分子中具有催化功能的亲核基团主要是：组氨酸的咪唑基、丝氨酸的羟基、半胱氨酸的巯基。此外，许多辅酶也具有亲核中心。酶中参与共价催化的基团主要包括 His 的咪唑基，Cys 的硫基，Asp 的羧基，Ser 的羟基等。 亲电

10、子催化作用：在亲电子催化作用中，催化剂和底物的作用与亲核催化相反，就是说，亲电子催化剂缺少电子，从底物中吸取一个电子对形成共价键催化反应。酶分子亲电子的基团有亲核碱基被质子化的共轭酸，如NH3+。在酶的亲电子催化过程中，有时其必需的亲电子物质不是上述的共轭酸，而是由酶中非蛋白组成的辅因子提供，其中金属阳离子是很重要的一类。6、金属离子催化作用（1）、提高水的亲核性能：金属离子可以和水分子的OH-结合，使水显示出更大的亲核催化性能。 （2）、电荷屏蔽作用（3）、电子传递中间体 第四章 影响酶促反应速度的因素一、底物浓度对酶反应速度的影响 （一）、单底物反应 1、米氏方程 底物浓度较低时，增加底物

11、浓度可加快酶促反应速度。当底物饱和时，酶促反应速度不会再随底物浓度的增加而加快。底物浓度与酶促反应速度的关系通常用米氏方程来表示： 2、米氏常数的定义米氏常数是酶促反应速度达到最大反应速度的一半时的底物浓度。 Km是一个物理常数。 米氏常数的单位是mM。3、米氏常数的意义 （1）Km是酶的一个特征性常数，只与酶的性质有关，与酶的浓度无关。 （2）如酶能催化几种不同的底物，对每种底物都有一个特定的Km值，其中Km值最小的称该酶的最适底物。 （3）Km除了与底物类别有关，还与pH、温度有关。 （4）Km表示酶和底物的亲和力。 Km越大，表示和底物的亲和力越小。判断代谢反应的方向、途径和限速步骤等。

12、 二、酶的抑制作用和抑制作用动力学 （一）、什么是抑制作用（inhibition）? 某些物质使酶活力下降的作用叫抑制作用，这些使酶活力下降的物质，称为抑制剂（Inhibitor, I)（二）、抑制作用的种类 1、不可逆抑制（irreversible inhibition）：抑制剂与酶的必需基团以共价键结合，不能用稀释或透析去除抑制剂使得酶活力恢复。 2、可逆抑制作用(reversible inhibition)及其动力学（1）竞争性抑制作用（competitive inhibition） 定义：抑制剂与底物竞争酶的活性结合部位竞争性抑制作用的特点：Km增加、Vmax不变（2）非竞争性抑制作用

13、（noncompetitive inhibition） 定义： I与S同时结合到酶的不同部位上 特点：Km不变、Vmax降低（3）反竞争性抑制作用（uncompetitive inhibition）定义：只有酶和底物结合之后，抑制剂才与酶和底物的 复合物结合。特点：Km降低、Vmax降低（三）一些重要的抑制剂及其实际意义 有机磷化合物 ：有机磷化合物能抑制某些蛋白酶及酯酶的活力，特别是强烈抑制胆碱酯酶。 巯基酶抑制剂 ：A、烷化剂：B、有机汞、有机砷化合物 重金属抑制剂 ：Ag+、Cu2+、Hg2+、Pb2+等金属盐能使大多数酶失活。 第五章 核酶和抗体酶一、核酶的发现1982年Cech等发现

14、四膜虫细胞大核期间26SrRNA前体具有自我剪接功能，并于1986年证明其内含子L-19IVS具有多种催化功能。1995年Cuenoud等发现有些DNA分子亦具有催化活性。称之为脱氧核酶。 二、核酶作用的特点 1、化学本质：RNA 2、底物：RNA 3、反应特异性(专一性）碱基 4、催化效率 低 5、核酶是一种金属依赖酶。金属离子起以下的作用： （1）、特异的结构作用，或参与活性部位的化学过程 （2）、促进RNA的总体折叠 （3）、二价金属离子（如Mg 2+ ）与底物活性部位直接相互作用，参与过渡中间复合物的形成三、核酶的应用1、核酶抗肝炎病毒的研究 目前人们已进行了核酶抗甲型肝炎病毒（HAV

15、)、乙型肝炎病毒（ HBV）、丙型肝炎病毒（ HCV）以及HDV作用的研究。人工设计核酶多为锤头状结构，少部分是采用发夹状核酶。 2、抗人类免疫缺陷病毒型（HIV- )。核酶免疫源性低，很少引起免疫反应。 1998年，美国加利福尼亚大学Wong-Staal等利用发夹核酶抑制HIV- 基因表达，并率先进入临床期。 3、抗肿瘤治疗 核酶能在特定位点准确有效地识别和切割肿瘤细胞的mRNA,抑制肿瘤基因的表达，达到治疗肿瘤的目的。4、抑制疾病基因的表达和基因治疗 通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，抑制效率高，专一性强。针对锤头核酶而言，催化结构域小，既可作为转基因表达产物，也可以直接以人工合成的寡

16、核苷酸形式在体内转运。 5、 在其他领域的应用 防治动、植物 病毒侵害：马铃薯纺锤形块茎类病毒负链的多价核酶构建，马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的突变核酶的克隆等。四、核酶技术面临的问题1、核酶催化切割反应的可逆性问题，定向反应2、催化效率较低，设法提高催化效率3、寻找合适载体将核酶高效、特异地导入靶 细胞4、使核酶在细胞内有调控地高效表达5、增强核酶在细胞内的稳定性6、对宿主的损伤问题有待进一步考察五、抗体酶（abzyme） （一）、抗体酶的定义： 抗体酶或催化抗体（Catalytic antibody)是指具有酶催化活性的抗体。是一种新型人工酶制剂，是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋

17、予了酶的属性。它是利用现代生物学与化学的理论与技术交叉研究的成果，是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物。抗体：与抗原特异结合的免疫球蛋白。抗体酶：指具有催化功能的抗体分子，在抗体分子的可变区 （即肽链的N端）是识别抗原的活性区域，这部分区域被赋予了酶的属性。（二）、抗体酶的催化特征1、抗体酶的特点（与天然酶相比）：（1） 能催化一些天然酶不能催化的反应（2）有更强的专一性和稳定性（3）催化作用机制不同 2、抗体酶和非催化性抗体作用的比较（1）更高的反应特异性（2）反应的可逆性（3）反应的量效性（4）反应过程（三）、抗体酶的催化作用机理1、过渡态理论与抗体酶2、抗体酶催化的三种重要

18、反应机制 水解作用机制 基团转移 连续反应机制3、抗体酶催化反应的介质效应 酯解反应中介质效应 ：抗体酶在有机溶 剂中具稳定性。 脱羧反应中介质效应 ；有机溶剂引起脱羧反应速率增加。 酰基转移反应中介质效应 ：在疏水溶剂中，活性较高。（四）、抗体酶的制备 1、细胞融合法：2、抗体结合位点化学修饰法：对抗体酶进行结构修饰的关键是找到一种温和的方法在抗体结合位置或附近引入具有催化功能的基团。游离巯基就是适合的基团之一，它具有高亲核性，易于氧化，及能通过二硫化物进行交换反应或亲电反应而选择性修饰的特点。3、引入辅助因子法：将此半抗原通过共价键连接在载体蛋白免疫动物产生的抗体，在金属离子复合物作为辅因

19、子的参与下，这些抗体酶能选择性水解甘氨酸和丙氨酸之间的肽键 .4、用生物工程的方法产生抗体：将编码具有抗体酶活性的Fab片断的基因是通过细菌的形式表达出来的。5、拷贝法：用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，再将此抗体免疫动物并进行单克隆化，获得单克隆的抗抗体。对抗抗体进行筛选，获得具有原来酶活性的抗体酶。6、共价抗原免疫法：这是在亲和标记抑制剂基础上发展起来的新的抗体酶制备方法。以亲和标记剂为半抗原，则抗体结合部位将产生与亲和基团电荷性质相反的基团，如亲核性，亲电性氨基酸，酸性氨基酸，碱性氨基酸等。 第六章 酶的分离纯化一、沉淀分离：1、沉淀剂的类型2、使用注意事项沉淀分离方法分离原理 盐析沉

20、淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离等电点沉淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离有机溶剂沉淀法利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离选择性变性沉淀法选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，从而使酶与杂质分离二、层析分

21、离 层析方法分离依据吸附层析利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离分配层析利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离离子交换层析利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的凝胶层析以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离亲和层析利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化层析聚焦将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离 （一）离子交换层析1、如何根据酶的特性选择离子交换介质？2、如何根据离子交换介质的特性选择缓冲体系？ （二）凝胶层析操作（装柱、

22、洗涤及洗脱）过程中要注意那些问题？ （三）亲和层析的原理及操作要点第七章 固定化酶一、什么是固定化酶？通过化学方法将水溶性酶与不溶性载体铰链而形成的不溶性酶称为固定化酶。与天然酶比较，固定化酶具有可多次重复使用、可以装塔连续反应、 纯化简单、 能提高产物质量、应用范围广 等多种优点。二 固定化酶的优缺点优点： 可多次重复使用 可以装塔连续反应 纯化简单 提高产物质量 应用范围广 缺点： 首次投入成本高 大分子底物较困难三、影响固定化酶性质的因素 1 酶本身的变化： 主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。 2 载体的影响 （1） 分配效应 （2） 空间障碍效应 （3）

23、扩散限制效应 3. 固定化方法的影响四、固定化后酶性质的变化1 固定化对酶活性的影响：酶活性下降，反应速度下降。 原因：酶结构的变化空间位阻2 固定化对酶稳定性的影响 （1） 操作稳定性提高 （2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高。 (3 ) 对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。 (4 ) 对分解酶的稳定性提高。 （5） 对变性剂的耐受力升高固定化后酶稳定性提高的原因：a. 固定化后酶分子与载体多点连接。 b. 酶活力的释放是缓慢的。 c. 抑制自降解，提高了酶稳定性。3、米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化（1） 载体与底物带相同电荷，KmKm固定化酶降低了酶的亲和力。 （2） 载体与底

24、物电荷相反，静电作用，KmKm 五、固定化酶的制备（一）、各类固定化方法的特点比较: 比较项目 吸附法 结合法 交联法 包埋法 物理吸附 .共价键结合 离子键结合 制备难易 易 难 易 较难 较难 固定化程度 弱 强 中等 强 强 活力回收率 较高 低 高 中等 高 载体再生 可能 不可能 可能 不可能 不可能 费用 低 高 低 中等 低 底物专一性 不变 可变 不变 可变 不变 适用性 酶源多 较广 广泛 较广 小分子底物、药用酶 （二） 选择方法依据： （1） 酶的性质 （2） 载体的性质 （3） 制备方法的选择（三）选择载体的原则 （1）要有巨大的比表面积 （2）要有活泼的表面（3）便于

25、装柱进行连续反应（四）载体活化的方法A重氮法 B叠氮法 C烷基化反应法 D硅烷化法 E溴化氰法（五）、固定化后酶的考察项目：（1） 测定固定化酶的活力，以确定固定化过程的活力回收率。 （2） 考察固定化酶稳定性 （2） 考察固定化酶最适反应条件第八章 化学酶工程第一节 酶分子的化学修饰一、酶化学修饰的定义用化学试剂对酶的侧链基团进行共价改造，从而赋予酶分子以特殊功能和提高酶的活力的方法，称为酶的化学修饰。二 酶的化学修饰原因1 稳定性不够，不能适应大量生产的需要。 2 作用的最适条件不符。 3 酶的主要动力学性质的不适应。 4 临床应用的特殊要求。三、酶化学修饰的目的1、改变活性部位的构象。酶

26、蛋白的主链经蛋白酶的水解作用，去掉部分肽段或者取代蛋白质一级结构上某些氨基酸残基，使活性部位的结构发生改变，以达到人们所需要的各种目的。 2、提高生物活性。酶分子侧链基团的化学转变，改变基团的电化学性质、分子内基团的相互作用力等，某些情况下能提高酶的生物活性。 3、增强酶的稳定性。一般酶反应条件基本接近中性，但在工业应用上，由于生产条件、底物等带来的影响，作用的pH常常不在中性；生产温度的提高，酶往往易变性失活。这些都直接影响酶作用的发挥。用双功能试剂让酶分子基团之间、内部侧链基团之间进行交联，可以达到提高酶的稳定性的目的。 4、降低酶类药物的抗原性。酶是蛋白质，作为药物使用时，这些异源蛋白进

27、入人体后可能成为抗原，诱导相应的抗体产生，这些酶类药物就会通过抗原抗体反应被清除掉，从而不能发挥药效，有的甚至还会产生过敏反应。通过对酶的化学修饰，可以降低酶类药物的抗原性。 5、改变酶学性质。利用有机小分子或大分子物质对活性部位或活性部位之外的侧链基团进行化学修饰，达到改变酶学性质的目的。四、 酶化学修饰的基本原理1 如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 2 如何保护酶活性部位与抗抑制剂 3 如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 4 如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境 因此，在酶的化学修饰过程中需要注意以下几个方面：（1）、充分了解被修饰酶。开始设计酶化学修饰反应时，对被修饰酶的活性部位、

28、稳定条件、侧链基团性质及酶反应的最适条件等应尽可能全面了解。（2）、修饰剂的选择 选择修饰剂时要求修饰剂具有较大的相对分子质量，对蛋白质的吸附有良好的生物相容性和水溶性，修饰剂分子表面有较多的活性基团，还要考虑修饰剂上的反应基团的活化方式和活化条件，以及修饰后酶活性的半衰期。（3）修饰反应条件的选择 修饰反应一般要选择在酶稳定的条件下进行，尽可能少破坏酶的必需基团，选择酶与修饰剂的结合率和酶活回收率都较高的反应条件。对反应体系中酶与修饰剂的分子比例、反应温度、pH、时间、溶剂性质和离子强度等在确定反应条件时也必须考虑。 五、 酶修饰方法（一）、 酶分子侧链基团的化学修饰 （二）、 酶分子表面的

29、化学修饰 （三）、 蛋白质类及其他对酶的化学修饰。六、 修饰酶的性质及特点1热稳定性提高 修饰剂与酶多点交联，固定了酶的分子构象，增强酶天然构象的稳定性减少了酶热失活，增强了酶的热稳定性。 2抗原性降低 当酶被修饰以后，酶分子表面上许多抗原决定簇在反应过程中被修饰剂结合，在空间结构上使这些抗原决定簇被屏蔽，从而降低了酶分子的抗原性或抗原抗体的结合能力。3体内半衰期延长经过化学修饰后，由于增强了抗蛋白水解酶、抗抑制剂和抗失活因子的能力以及对热稳定性的提高，所以其半衰期都比天然酶长。4最适pH变化 修饰酶的微环境更为稳定。5酶的动力学性质的改变A、米氏常数Km增大：交联于酶上的大分子修饰剂造成空间

30、障碍，影响了底物对酶的接近和结合，使米氏常数Km增大。B、修饰酶抵抗各种失活因子的能力增强。C、体内半衰期的延长6对组织的分布能力变化第二节 模拟酶一模拟酶概述（一）、模拟酶的概念： 用合成高分子来模拟酶的结构、特性、作用原理以及酶在生物体内的化学反应过程，它研究吸收酶中起主导作用的因素，利用有机化学、生物化学等方法设计和合成一些较天然酶简单的非蛋白质分子或蛋白质分子，以这些分子作为模型来模拟酶对其作用底物的结合和催化过程，也就是说，模拟酶是在分子水平上模拟酶活性部位的形状、大小及其微环境等结构特征，以及酶的作用机理和立体化学等特性。模拟酶又称人工酶或酶模型，它是生物有机化学的一个分支。 （二

31、）、模拟酶的研究目的：研究模拟酶主要是为了解决酶容易受多种物理、化学因素的影响而失活，所以不能用酶广泛取代工业催化剂等缺点。二、模拟酶的理论基础和策略 （一）酶学基础 酶的催化机制： Pauling的稳定过渡态理论(二)超分子化学基础 主-客体化学：主体和客体在结合部位的空间及电子排列的互补三、 模拟酶的分类四、模拟酶的制备第九章 生物酶工程第一节 酶基因的克隆和表达一、酶基因的克隆1、获得目的基因（target gene）（1）已知序列的目的基因的获取方法：同源克隆法（PCR）人工化学合成（2）已知探针的基因的获取方法构建基因组DNA文库构建cDNA文库（3）未知序列的基因的获取方法随机引物

32、PCR 差别显示PCR 代表性差式分析PCR 2、选择载体基因克隆载体的定义基因克隆载体是指可承载外源基因并将其带入受体细胞且得以稳定维持的DNA分子。理想克隆载体的的条件 分子小（ 10 Kb），以容纳较大的外源DNA。 有克隆位点（外源DNA插入点）即多个单一酶切位点； 是一个独立的复制子，有复制起始序列，可在宿主细胞中独立自主复制； 有足够的copy数 带筛选的标志：具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 克隆载体必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因。（3）常用的克隆载体（vector）n 质粒（plasmid：柯斯质粒和酵母质粒）n 噬菌体（phage）n 病毒（vi

33、rus）n 人工染色体3、目的基因与载体的重组（1）目的基因酶切/修饰 限制性核酸内切酶：一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶（2） 载体酶切（3） DNA连接酶连接目的基因和载体用T4或Ecoli DNA连接酶可连接具互补黏性末端的DNA片段；用T4 DNA连接酶连接具平末端的DNA片段； 先在DNA片段末端加人工接头，使其形成黏性末端，然后再行连接。常用的 DNA ligase：T4 DNA ligasen 只以双链DNA为底物，不能有核苷酸的缺失n 只催化3端带有羟基的断点与5带有磷酸基的断点的连接 n 既可连接粘性末端，又可连接平末端（是目前已知的唯一的可以连接平末端

34、的DNA连接酶）n 最适pH：7.2 - 7.8n 需要ATP参加反应 4、重组载体的转化 感受态细胞的制备 0-4 0.1mol/L CaCl2 冰浴15-30min 重组载体直接引入感受态细胞重组DNA导入原核细胞常用转化或转导，先制备细菌感受态细胞，然后用重组DNA分子转化感受态细胞，并培养筛选转化子重组DNA导入真核细胞常见的是导入酵母细胞，一般用蜗牛酶去除酵母细胞壁形成原生质体，再用CaCl2和聚乙二醇处理，重组DNA以转化方式导入酵母细胞原生质体，将其置于再生培养基上培养，使原生质体再生出细胞壁形成完整酵母细胞。导入哺乳动物细胞较简便的是电穿孔法和微量注射法。体积大的动物细胞可用微

35、量注射法将外源DNA注入细胞，如受精卵。5、重组子的筛选与鉴定根据重组载体的表型v 抗药性（Ampr 、Tetr）v 营养条件（自养、异养）v 其他marker（ a-互补筛选） 根据DNA限制性内切酶的酶谱分析利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定：原位杂交、Southern印迹 PCR法 DNA序列测定 免疫学法二、克隆基因的表达表达体系的建立表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化(一)外源基因在原核细胞中的表达 目前应用最广的是大肠杆菌表达系统。下面以大肠杆菌为例，讲述原核生物基因表达系统。 1原核生物基因表达系统的特点 原核生物基因表达系统的特点如下： 只有一种RNA聚合酶(真核细胞

36、有三种)识别原核细胞的启动子； 表达是以操纵子为单位的； 转录与翻译偶联，是连续进行的； 一般不含有内含子(intron)，缺少真核细胞转录后加工系统，故当含有内含子的真核基因在原核细胞中转录成mRNA前体后，其中内含子部分不能被切除； 原核生物基因的控制主要在转录水平，包括起始控制(启动子控制)和终止控制(衰减子控制)； 在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有真核基因缺乏的转译起始密码子及SD序列。 2. 真核表达体系 酵母、昆虫、乳类动物细胞优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累缺点：操作技术难、费时、经济方法：磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导

37、转染电穿孔 脂质体转染 显微注射 第二节 酶分子的改造一、概述1、为什麽要改造酶分子？ 多数天然酶在工业生产的条件下，难以具备商业价值的酶学特性，对天然酶进行分子水平的改造，以获得比天然酶活力更高或催化能力更强的新的非天然酶或改造天然酶。2、酶分子改造的内容 主要两方面：理性设计和非理性设计 （1）理性设计 在研究天然酶及其突变体时，通常先获得酶分子特征、空间结构以及结构与功能的关系等方面信息，这些用各种生物化学、光谱学、晶体学等方法来解决，然后根据这些信息进行酶分子的改造，这就是酶分子的理性设计，它包括化学修饰、定点突变等。 （2）非理性设计：不需准确知道酶蛋白结构与功能等信息，直接通过随机

38、突变、筛选等方法进行酶分子的改造，称为酶分子的非理性设计，如定向进化、杂合进化等。目前用于进行酶分子的改造方法主要是定点突变。二、改造酶分子的常用方法（一）、酶的定点突变 1、概念：定点突变(site-directed mutagenesis，SDM)指在基因的特定位点引入突变，即通过取代、插入或删除已知DNA序列中特定的核苷酸序列来改变酶蛋白结构中某个或某些特定的氨基酸，以此来提高酶对底物的亲和力，增强酶的专一性等。定点突变方式多样，有改变特定的核苷酸，也有对一段最可能影响酶的功能与性质的基因序列进行随机突变，从而产生一系列突变酶蛋白分子。 2、优点：突变率高、简单易行、重复性好的特点。 3

39、、应用：定点突变技术通常可以用于改变核苷酸序列获得突变基因，研究基因的结构与功能的关系；还能够通过改变特定的氨基酸获得突变酶蛋白，研究基因表达调控、基因结构与功能及蛋白质性质等，从微观水平来阐明正常状态下基因的调控机理以及疾病的病因和机理。在生物和医学领域，该技术已经得到广泛应用。（二）、常用方法1、寡核苷酸引物突变寡核苷酸引物突变法用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物合成DNA子链的一部分。 引物中除了所需的突变碱基之外，其余部分则应与目的基因编码链的特定区段完全互补。 这种突变的步骤如下： 将待突变基因克隆到突变载体上； 制备含待突变基因的单链模板； 突变寡核苷酸引物与待突变的核苷酸形成一小

40、段碱基错配的异源双链的DNA； 合成突变链：在DNA聚合酶的催化下，引物以单链DNA为模板合成全长的互补链，而后由连接酶封闭缺口，产生闭环的异源双链的DNA分子； 转化和初步筛选异源双链DNA分子转化大肠杆菌后，产生野生型、突变型的同源双链DNA分子该法是应用范围最广的突变方法，其保真度比后面提到的PCR突变法高，其缺点是携作过程环节复杂。2、PCR突变PCR介导的定点突变是应用PCR技术，置换DNA链上特定部位的氨基酸，插入特定几个或消除特定几个氨基酸。主要有经典的重组PCR定点突变法和大引物突变法。重组PCR定点突变法可在DNA区段的任何部位产生定点突变，这种方法，需要四种扩增引物，总共进

41、行三轮PCR反应。3、盒式突变概念：盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。这种突变的寡核苷酸是由两条寡核苷酸组成的，当它们退火时，产生克隆所需要的黏性末端，由于不存在异源双链的中间体，因此重组质粒全部是突变体。 优点：盒式突变法与前两者相比，更加简单易行、突变效率高，可以在一对限制酶切位点内进行一次突变而获得多个位点。 缺点：唯一不足的是靶DNA区段的两侧需存在一对限制酶单切位点。三、酶分子定向进化酶分子定向进化的关键是通过随机以诱变和体外重组产生分子多样性。其基本方法分三步进行： 1、通过随机诱变和体外重组创造基因多样性； 2、将突变或重组基因

42、导入适当载体后构建突变文库； 3、通过灵敏的筛选方法，选择样性突变子。第十章 有机介质中的酶反应一 有机相酶反应的优点：1 有利于疏水性底物的反应。 2 可提高酶的热稳定性. 3 能催化在水中不能进行的反应 4 可改变反应平衡移动方向 5 可控制底物专一性6 可防止由水引起的副反应。 7 可扩大反应pH值的适应性。 8 酶易于实现固定化。 9 酶和产物易于回收。 10 可避免微生物污染。二 有机相酶反应具备条件 1 保证必需水含量。 2 选择合适的酶及酶形式。 3 选择合适的溶剂及反应体系。 4 选择最佳pH值。三、分子印迹技术原理：1、竞争性抑制剂诱导酶活性中心构象发生变化，形成一种高活性的

43、构象形式，而此种构象形式在除去抑制剂后，因酶在有机介质中的高度刚性而得到保持。 2、酶蛋白分子在有机相中具有对配体的“记忆”功能。四、有机相中固定化后载体对酶的影响 1、载体能通过分配效应剧烈地改变酶微环境中底物和产物的局部浓度。2、载体影响酶分子上的结合水：通过选择合适的载体可使体系中的水进行有利分配。 3、通过载体与酶之间形成的多点结合作用，可稳定酶的催化活性构象。4、酶动力学影响一个酶同时催化的两个反应的相对速度例 在低水活度下把胰凝乳蛋白酶固定在聚酰胺载体上，水解反应被抑制却有利于醇解反应。五、酶促反应有机介质体系 （1） 单相共溶剂体系（水/水溶性有机熔剂） （） 两相体系（水/水不溶性有机溶剂） （） 低水有机溶剂体系（有机溶剂体系） （） 反胶束体系六、有机溶剂影响酶催化的方式 1、 有机溶剂能通过直接与酶相互作用：引起抑制或失活A 增大酶反应的活化能来降低酶反应速度 B 降低中心内部极性并加强底物与酶之间形成的氢键，使酶活性下降。 C 酶三级结构变化，间接改变酶活性中心结构影响失活。 2、有机溶剂与扩散的底物或产物相互作用而影响酶活 3、 有机溶剂直接与酶附近的必需水相互作用七、选择有机溶剂必须考虑因素1、 有机溶剂与反应的匹配性（即相容性）（包括反应产物与溶剂的匹配性，极性产物倾向于保留在酶附近，可能引起产物抑制或不必要的副反应