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1、酶工程复习资料酶工程复习资料第一章：绪论1、酶的概念：酶是由生物体产生的具有催化功能的生物大分子。按照其化学组成，可以分为蛋白类酶（P酶）和核酸类酶（R酶）两大类别。酶具有蛋白质的哪些属性：组成成分 两性电解质 亲水胶体基团 结构 水解成氨基酸 变性（受物、化影响）2、酶的生产、改性与应用的技术过程成为酶工程。3、酶的生产是指通过各种方法获得人们所需的酶的技术过程，主要包括微生物发酵产酶、动植物培养产酶和酶的提取与分离纯化等。4、酶的改性是通过各种方法改进酶的催化特性的技术过程，主要包括酶分子修饰、酶固定化、酶非水相催化和酶定向进化等。5、酶工程的主要内容包括：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培
2、养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞、原生质体固定化，酶非水相催化，酶定向进化，酶反应器和酶的应用等。6、酶的特性：酶催化作用的专一性强；酶催化作用的效率高；酶催化作用的条件温和；酶的催化活力可受各种因素的调节；酶的催化活力与辅酶、辅基及金属离子有关。7、酶的专一性是指在一定的条件下，一种酶只能催化一种或一类结构相似的底物进行某种类型反应的特性。分为绝对专一性和相对专一性。8、绝对专一性是一种酶只能催化一种底物进行一种反应，这种高度的专一性称为绝对专一性。9、相对专一性：一种酶能够催化一类结构相似的底物进行某种相同类型的反应，这种专一性称为相对专一性。相对专一性分为：键专一性和基团
3、专一性。 10、酶催化反应的效率之所以这么高，是由于酶催化反应所需的活化能显著降低。11、提高反应效率的因素：邻近效应与定向效应；底物分子的敏感键发生形变；共价催化；酸碱催化；微环境的影响。12、影响酶催化作用的因素：底物浓度的影响 酶浓度的影响 温度的影响 pH的影响 激活剂的影响 抑制剂的影响13、 Km为米氏常数，是酶催化反应速度等于最大反应速度一半时的底物浓度。14、pH之所以影响酶的催化作用，只要是由于在不同的pH条件下，酶分子和底物分子中基团的解离状态发生改变，从而影响酶分子的构象以及酶与底物的结合能力和催化能力。在极端的pH条件下，酶分子的空间结构发生改变，从而引起酶的变性失活。
4、15、抑制作用包括可逆抑制剂和不可逆抑制剂。16、竞争性抑制是指抑制剂和底物竞争与酶分子结合而引起抑制作用。竞争性抑制的特点：是酶催化反应的最大反应速度Vm不变，而米氏常数Km增大。17、非竞争性抑制是指抑制剂与底物分别与酶分子上的不同位点结合而引起酶活性降低的抑制作用。非竞争性抑制的特点：最大反应速度Vm减小，而米氏常数Km不变。18、反竞争性抑制：在底物与酶分子结合生成中间复合物后，抑制剂再与中间复合物结合而引起的抑制作用称为反竞争性抑制。反竞争性抑制的特点：最大反应速度Vm和米氏常数Km同时减小。19、能够增加酶的催化活性或使酶的催化活性显示出来的物质称为酶的激活剂或活化剂。20、蛋白类
5、酶分为：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、合成酶或连接酶。根据酶催化反应类型，可以将核酸类酶（R酶）分为剪切酶、剪接酶和多功能酶。核酸类酶分为（了解）：分子内催化R酶（分为自我剪切酶、自我剪接酶）和分子间催化R酶（分为RNA剪切酶、DNA剪切酶、多肽剪切酶、多糖剪接酶、氨基酸酯剪切酶、多功能酶）。21、酶活力是指在一定条件下，酶所催化的反应初速度。在外界条件相同的情况下，反应速度越大，意味着酶活力越高。22、酶活力单位：在特定条件下（温度可采用25，PH等条件均采用最适条件），每1min催化1mol的底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位，这个单位称为国际单位（IU）。23、国际上
6、另一个常用的酶活力单位是卡特（Kat）。在特定条件下，每秒催化1 mol底物转化为产物的酶量定义为1卡特（Kat）。24、两种酶活力单位之间可以互相换算。即：1Kat=1mol/s=60mol/min=60106mol/min=6107IU25、酶的转换数Kp，又称为摩尔催化活性，是指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。即每摩尔酶每分钟催化底物转化为产物的摩尔数。26、固定化酶的活力测定方法：振荡测定法 酶柱测定法 连续测定法。酶结合效率和酶活力回收率的测定：27、酶结合效率又称为酶的固定化率，是指酶与载体结合的百分率。酶活力回收率是指固定化酶的总活力与用于固定化的总酶活力的百分率。28、酶
7、的生产是指通过人工操作而获得所需的酶的技术过程。（与酶的发酵生产比较）30、酶的生产方法包括提取分离法、生物合成法、化学合成法。31、酶的提取：是指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程。主要的提取方法有：盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取和有机溶剂提取等。32、利用微生物细胞的生命活动所需酶的方法称为发酵法。根据细胞培养方式的不同，发酵法可以分为液体深层培养发酵、固体培养发酵、固定化细胞发酵、固定化原生质体发酵等。课后习题：1、酶有哪些显著的催化特性？答案见本章第6点。2、测定酶活力时，为什么要测酶反应初速度？P6图答：酶促反应中，产物的生成量对反应时间的图形是
8、一条曲线。曲线的斜率表示单位时间内产物生成量的变化，所以曲线上任何一点的斜率就是该相应时间的反应速率。可以看出在反应开始的一段时间内，斜率几乎不变，也就是初始速度不变。随着时间的延长，曲线逐渐平坦，斜率降低，反应速度也降低，显然这时候测得的酶活力不能代表真实的酶活力。引起酶促反应速率随时间延长而降低的原因很多，如底物浓度降低，产物浓度增加加速了逆反应进行，产物对酶的抑制等。因此，测定酶活力应该测定酶促反应的初速率，从而避免上述各种干扰因素对反应速率的影响。最后，酶量和反应初速率呈线性关系，所以可以用初速率来测定制剂中的酶含量。3、酶催化效率高的分子机制:（1）邻近效应与定向效应：邻近效应是由于
9、具有与底物较高的亲和力，从而使游离的底物集中于酶分子表面的活性中心区域，使活性中心的底物有效浓度得以极大的提高，并同时使反应基团之间互相靠近，增加亲核攻击的机会，从而自由碰撞机率增加，提高了反应速度。定向效应是指底物的反应基团和催化基团之间或底物的反应基团之间正确地取向所产生的效应。因为邻近的反应分子基团如能正确地取向或定位，使得这些基团的分子轨道交盖重叠，电子云相互穿透，分子间反应趋向于分子内反应，便于分子转移，增加底物的激活，从而加快反应。（2）底物分子的敏感键发生形变: 酶受底物诱导发生构象改变，特别是活性中心的功能基团发生的位移或改向，呈现一种高活性功能状态。加之，由于酶的活性中心关键
10、性电荷基因可使底物分子电子云密度改变，产生张力作用使底物扭曲，削弱有关的化学键，从而使底物从基态转变成过渡态，有利于反应进行（3）共价催化: 酶对底物进行的亲核、亲电子反应。酶催化时，亲核的酶或亲电子的酶分别释出电子或吸取电子作用于底物的缺电子中心或负电中心，迅速形成不稳定的共价中间复合物，降低反应活化能以加速反应进行。（4）酸碱催化: 指质子供体和质子受体的催化。酶之所以可以作为酸碱催化剂，是由于很多酶活性中心存在酸性或碱性氨基酸残基，例如羧基、氨基、胍基、巯基、酚羟基和咪唑基等，它们在近中性pH范围内，可作为催化性质的质子受体或质子供体，有效地进行酸碱催化（5）微环境的影响: 酶活性中心内
11、是一个疏水的非极性环境，其催化基团被低介电环境所包围，某些反应在低介电常数的介质中反应速度比在高介电常数的水中的速度要快得多。第二章：微生物发酵产酶1、酶的发酵生产：经过预先设计，通过人工操作，利用微生物的生命活动获需酶的技术过程称为酶的发酵生产。2、酶的发酵生产根据微生物培养方式的不同，可以分为固体培养发酵、液体深层发酵、固定化微生物细胞发酵、固定化微生物原生质体发酵。3、固体培养发酵：优点：设备简单，操作方便，酶的浓度较高，特别适用于各种霉菌的培养和发酵产酶。缺点：劳动强度大，原料利用率较低，生产周期较长。4、液体深层发酵：优点：酶的产率较高，质量较稳定，产品回收率较高。缺点：机械化程度较
12、高，技术管理较严格，成本较高。5、固定化微生物细胞发酵：优点：细胞密度大，可提高产酶能力；发酵稳定性好，可以反复使用或连续使用较长的时间；细胞固定在载体上，流失较少，可以在高稀释率的条件下连续发酵，利于连续化，自动化生产；发酵液中含菌体较少，利于产品分离纯化，提高产品质量等；6、固定化原生质体发酵：优点：固定化原生质体由于除去了细胞壁这一扩散屏障，有利于胞内物质透过细胞膜分泌到细胞外；采用固定化原生质体发酵，使原来存在于细胞间质中的物质，如碱性磷酸酶等，游离到细胞外，变为胞外产物；固定化原生质体由于有载体的保护作用，稳定性较好，可以连续或重复使用较长的一段时间。缺点：制备较复杂，培养基中需要维
13、持较高的渗透压，防止细胞壁的再生。7、转录是以DNA为模版，以核苷三磷酸为底物，在依赖DNA的RNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNA的过程。8、以mRNA为模版，以各种氨基酸为底物，在核糖核蛋白体上通过各种tRNA、酶和辅助因子的作用，合成多肽链的过程称为翻译。9、有的酶在细胞中的量比较恒定，环境因素对这些酶的合成速率影响不大，这类酶称为组成型酶。10、有些酶在细胞中的含量变化很大，其合成速率明显受到环境因素的影响，这类酶称为适应型酶。11、调节控制包括转录水平的调节、转录产物的加工调节、翻译水平的调节、翻译产物的加工调节和酶降解的调节。其中，转录水平的调节对酶的生物合成是最重要的环节。1
14、2、转录水平的调节主要有三种模式：分解代谢阻遏作用、酶合成的诱导作用、酶合成的反馈阻遏作用。13、分解代谢物阻遏作用（实验结果、经过、分析、分子作用机制）：是指有些物质（主要是指葡萄糖和其他容易利用的碳源等）分解代谢的产物阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。有些物质经过分解代谢放出能量；腺苷酸环化酶的活化受到抑制而使cAMP的生成受阻，从而导致细胞内cAMP的浓度降低；细胞生长和新陈代谢的进行，ATP的浓度降低，细胞内ADP、AMP和cAMP的浓度增加。在培养环境中控制好某些容易降解物质的量，或在必要时添加一定量的cAMP，均可减少或解除分解代谢物阻遏作用。酶生物合成的诱导作用：加进某些
15、物质，使酶的生物合成开始或加速进行的现象，称为酶生物合成的诱导作用，简称诱导作用。酶的生物合成的反馈阻遏作用又称为产物阻遏作用，是指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象。14、酶生物合成的诱导作用的调节机制：乳糖操纵子的诱导过程：乳糖操纵子是负调节的代表，因在缺乏乳糖等诱导物时，其由调节基因编码的调节蛋白（即lac阻遏物）一直结合在操纵基因上，抑制这结构基因上转录的进行，当有诱导物乳糖存在时，乳糖和lac阻遏物 相结合，后者发生构象的变化，结果降低了lac阻遏物与操纵基因间的亲和力，使它不能继续结合在操纵子上。操纵子的“开关”打开后，转录、翻译就可顺利进行了。当诱
16、导物耗尽后，lac阻遏物可再次与操纵基因相结合，这时转录的“开关”被关闭，酶就无法合成，同时，细胞内已转录好的mRNA也迅速地被限制性内切核酸酶所水解，所以细胞内酶的合成速度急剧下降。色氨酸操纵子的诱导过程：色氨酸操纵子的阻遏对合成代谢酶类进行正调节的例子。启动基因位于操纵子的开始处，结构基因上有5个基因，分别为“分支酸邻氨基苯甲酸磷酸核糖邻氨基苯甲酸所苯氨基脱氨核糖磷酸吲哚甘油磷酸色氨酸”途径中的5种酶编码。其调节基因（trpR）远离操纵基因，编码一种称作阻遏物蛋白的效应物蛋白，末端产物色氨酸起着辅阻遏物的作用，因与阻遏蛋白有极高的亲和力，故两者间形成了一个完全阻遏物，由这种完全阻遏物来阻止
17、结构基因的转录。反之，当降低色氨酸的溶度的浓度时，就会导致这一完全阻遏物的解离，并脱离操纵基因，使操纵基因“开关”打开，因此结构基因的mRNA又可正常合成。阿拉伯糖的调控蛋白具有两种形态的调控作用：与阿拉伯糖结合时被激活，结合到操纵基因上促进转录；不与阿拉伯糖结合时也（注意）结合到操纵基因上阻遏转录。这和乳糖不同，乳糖操纵蛋白不与半乳糖结合时阻遏转录，但是一旦与之结合，并不是象阿拉伯糖一样的与操纵基因结合，而是与操纵基因脱离。15、酶生物合成的反馈阻遏作用：组氨酸操纵子：与His降解代谢有关的两组酶类被称为hut酶，控制这些酶合成的操纵子被称为hut operon。由一个多重调节的操纵子控制，
18、有两个启动子，两个操纵区及两个正调节蛋白。Hut操纵子共编码4种酶和一个阻遏物。4种酶分别由hutG、hutH、hutI及hutU基因编码，阻遏物则由hutC基因编码。在产气克氏菌中，以上基因构成两个转录单位，hutI、hutG、hutC和hutU、hutH分别被转录合成两条mRNA长链。这两个转录单位各自都有一个启动子和一个操纵区，其转录过程都是从左向右进行的，hutC阻遏物能与每个操纵区相结合。16、酶生物合成的模式P36-39：特点、区别、运用什么措施处理 通过分析比较细胞生长与酶产生的关系, 可以把酶生物合成的模式分为4种类型，即同步合成型，延续合成型，中期合成型和滞后合成型。同步合成
19、型：酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式。该类型酶的生物合成速度与细胞生长速度紧密联系，又称为生长偶联型。特点：属于该合成型的酶，其生物合成伴随着细胞的生长而开始；在细胞进入旺盛生长期时，酶大量生成；当细胞生长进入平衡期后，酶的合成随着停止。大部分组成酶的生物合成属于同步合成型，有部分诱导酶也按照此种模式进行生物合成。延续合成型：酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成一段较长时间。属于该类型的酶可以是组成酶，也可以是诱导酶。 中期合成型：该类型的酶在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的生物合成也随着停止。滞后合成型：此类
20、型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累。又称为非生长偶联型。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。措施：对于其他合成模式的酶，可以通过基因工程/细胞工程等先进技术,选育得到优良的菌株, 并通过工艺条件的优化控制, 使他们的生物合成模式更加接近于延续合成型。其中对于同步合成型的酶，要尽量提高其对应的mRNA的稳定性，为此适当降低发酵温度是可取的措施；对于滞后合成型的酶，要设法降低培养基中阻遏物的浓度 ，尽量减少甚至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用，使酶的生物合成提早开始；而对于中期合成型的酶，则要在提高mRNA的稳定性以及解除阻遏两方面下功夫，使其生物合成的开始时间提
21、前，并尽量延迟其生物合成停止的时间。17、碳源的选择：首先要从细胞的营养要求和代谢调节方面考虑碳源的选择；其次考虑原料的来源是否充裕，价格是否低廉、对发酵工艺条件和酶的分离纯化有否影响等因素；碳源对酶的生物合成具有代谢调节的功能。18、氮源：分为有机氮源和无机氮源。动物细胞要求有机氮源；植物细胞主要使用无机氮源；微生物细胞中，异养型细胞要求有机氮源，自养型细胞可以采用无机氮源。19、pH的调节：培养基的pH与细胞的生长繁殖以及发酵产酶关系密切，在发酵过程中必须进行必要的调节控制。不同的细胞生长繁殖的最适pH有所不同。细胞发酵产酶的最适pH与生长最适pH往往不同。有些细胞可以同时产生若干种酶，在
22、生产过程中，通过控制培养基的pH，往往可以改变各种酶之间的产量比例。随着细胞的生长、繁殖和新陈代谢产物的积累，培养基的pH往往会发生变化。20、温度的控制P48：有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同，而且往往低于生长最适温度。这是由于在较低的温度条件下，可以提高酶所对应的mRNA的稳定性，增加酶生物合成的延续时间，从而提高酶的产量。在细胞生长和发酵产酶过程中，由于细胞的新陈代谢作用，会不断放出热量，使培养基的温度升高，同时，由于热量的不断扩散，会使培养基的温度不断降低。 21、控制溶解氧方法：调节通气量 调节氧的分压 调节气液接触时间 调节气液接触面积 改变培养液的性质22、在
23、发酵生产过程中，应尽量控制使溶氧速率等于或稍高于好氧速率。23、提高酶产量的措施（大题）补料：是指在发酵过程中途补充添加一定量的营养物质，其作用是补充部分被消耗的营养物，延长产酶周期。添加诱导物：对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。诱导物一般可以分为3类：酶的作用底物、酶的催化反应产物、作用底物的类似物。控制阻遏物的浓度：是解除阻遏、提高酶产量的有效措施。阻遏作用根据机理不同可分为：产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用，应当控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度。可以采用其他较难利用的碳源如淀粉等，或者采用补
24、料、分次流加碳源，添加一定量的环腺苷酸（cAMP）。对于受代谢途径末端产物阻遏的酶，可以通过控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除。 添加表面活性剂：表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。将适量的非离子型表面活性剂，如吐温（Tween）、特里顿（Triton）等添加到培养基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产量增加。由于离子型表面活性剂对细胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性剂（如“新洁而灭”等）是消毒剂，对细胞的毒性较大，不能在酶的发酵生产中添加到培养基中。添加产酶促进剂：产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。产酶促进剂对不同细
25、胞、不同酶的作用效果各不相同，现在还没有规律可循，要通过试验确定所添加的产酶促进剂的种类和浓度。24、发酵动力学包括细胞生长动力学、产物生成动力学和基质消耗动力学。第三章：动植物细胞培养产酶1、动物细胞培养方式有悬浮培养、贴壁培养和微载体培养等。2、动物细胞可以采用离心分离技术、杂交瘤技术、胰蛋白酶消化处理技术等获得。3、植物细胞培养方式有固体培养、液体浅层培养、液体悬浮培养等，在次级代谢物的生产过程中通常采用液体悬浮培养。4、端粒是真核生物染色体的末端结构，是由含G和T的DNA简单重复序列不断重复而成。5、端粒是通过端粒酶的催化作用而生成的。端粒酶是催化端粒合成和延长的酶。6、抗体酶又称为催
26、化性抗体，是一类具有生物催化功能的抗体分子。抗体：是由抗原诱导产生的能与抗原特异结合的免疫球蛋白。7、诱导法有半抗原诱导法和酶蛋白诱导法。8、半抗原：具有抗原性，但只有与载体结合才能引起机体产生免疫反应的抗原物质。9、植物、动物、微生物细胞的特性比较：细胞种类植物细胞微生物细胞动物细胞细胞大小/um20030011010100倍增时间/h120.3-615营养要求简单简单复杂光照要求大多数要求不要求不要求对剪切力敏感大多数不敏感非常敏感主要产物色素、药物、香精、酶等醇、有机酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶等疫苗、激素、单克隆抗体、酶等10、植物细胞培养的特点：提高产率缩短周期易于管理，减轻劳动强
27、度提高产品质量其他11、植物细胞的获取：（1）直接分离法：从外植体直接分离植物细胞的方法通常有机械法和酶解法两种。（2）愈伤组织诱导法（3）原生质体再生法12、动物细胞的特性（看熟）：动物细胞与微生物细胞核植物细胞的最大区别在于没有细胞壁，细胞适应环境的能力差，显得十分脆弱。动物细胞的体积比微生物细胞大几千倍，稍小于植物细胞的体积。大部分动物细胞在肌体内相互粘连以集群形式存在，在细胞培养中大部分细胞具有群体效应、锚地依赖性、接触抑制性以及功能全能性。动物细胞的营养要求较复杂，必须供给各种氨基、维生素、激素和生长因子等。动物细胞培养基中一般需要加进5%-10%的血清。13、动物细胞培养的特点（看
28、熟）：细胞生长速度慢（需添加抗生素）。细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感。反应过程成本高，产品价格贵。细胞具有锚地依赖性。原代细胞一般繁殖50代。14、动物细胞培养方式可以分为两大类：一类是来自血液、淋巴组织的细胞，如肿瘤细胞和杂交瘤细胞等，可以采用悬浮培养方式；另一类是存在于淋巴组织以外的组织、器官中的细胞，它们具有锚地依赖性，必需依附在带有适当正电荷的固体和半固体物质的表面上生长，采用贴壁培养。第四章：酶的提取与分离纯化1、酶的提取与分离纯化是指将酶从细胞或其他含酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获得所要求的酶制品的技术过程。2、细胞破碎是通过各种方法使细胞外层结构破坏的技术过程。3、
29、细胞破碎方法及其原理：4、温度差破碎法：对于那些较为脆弱、易于破碎的细胞（如革兰氏阴性菌等）有较好的破碎效果。5、压力差破碎法中的突然降压法对大肠杆菌等革兰氏阴性菌的破碎效果较佳，最好使用对数生长期的细胞。而渗透压变化法使用于膜结合酶、细胞间质酶等的提取，但是对革兰氏阳性菌不适用。这主要是由于革兰氏阳性菌的细胞壁由肽聚糖组成，可以承受渗透压的变化而不致细胞破裂。6、酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程，也称为酶的抽提。7、极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。8、
30、酶的主要提取方法：盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取、有机溶剂提取。9、影响提取的主要因素：温度 pH 提取液的体积 在酶的提取过程中，含酶的原料的颗粒体积越小，则扩散面积越大，有利于提高扩散速度。适当的搅拌可以使提取液中的酶分子迅速离开原料颗粒表面，从而增大两相界面的浓度差，有利于提高扩散速度。适当延长提取时间，可以使更多的酶溶解出来，直至达到平衡。在提取过程中，为了提高酶的稳定性，免致引起酶的变性失活，可适当加入某些保护剂。10、沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其他溶质分离的技术过程。沉淀分离方法分离原理盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓
31、度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离（大规模工业生产中用的最普遍，成本低）等电点沉淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离（生物分子很多都是两性电解质）有机溶剂沉淀法利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离选择性变性沉淀法选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响
32、所需的酶，从而使酶与杂质分离（耐高温，热稳定的蛋白）12、在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。13、在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶。14、离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。15、离心机分为：低速离心机、高速离心机、超速离心机。16、离心力的大小与转速的平方（n2）以及旋转半径（r）成正比。17、过滤是借助过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。18、过滤根据过滤介质不同分为：非膜过滤、膜过滤。19、根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同，过滤分为粗滤、微滤、超滤、
33、反渗透。20、借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。21、层析分离是利用混合液中各组分的物理化学性质（分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数）的不同，使各组分以不同比例分布在两相中。层析方法 分离依据吸附层析利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离分配层析利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离离子交换层析利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的凝胶层析以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离亲和层析利用生物分子与
34、配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化层析聚焦将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离23、洗脱方法：溶剂洗脱法、置换洗脱法、前缘洗脱法。24、分配层析主要有纸上层析、分配薄层层析、分配气相层析。25、颗粒在电场中的移动速度主要决定于其本身所带的净电荷量，同时受颗粒形状和颗粒大小的影响。此外，还受到电场强度、溶液pH值、离子强度及支持体的特性等外界条件的影响。 （1）电场强度（2）溶液的pH值（3）溶液的离子强度（4）电渗 （5）缓冲液的黏度和温度等也对颗粒的泳动速度有一定的影响。26、萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。按两
35、相的组成不同，分为有机溶剂萃取、双水相萃取、超临界萃取、和反胶束萃取。27、结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。28、酶结晶的方法：盐析结晶法、有机溶剂结晶法、透析平衡结晶法、等电点结晶法。29、常用的干燥方法：真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥、吸附干燥等。第五章：酶分子修饰1、通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的催化特性的技术过程称为酶分子修饰。2、把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。3、金属离子置换修饰的过程主要包括：酶的分离纯化 除去原有的金属离子 加入置换离子4、金属离子置换的作用：阐明金属离子对酶催
36、化作用的影响 提高酶活力 增强酶的稳定性 改变酶的动力学特性 5、采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生变化，从而改变酶的催化特性的方法称为大分子结合修饰。6、大分子结合修饰的作用：通过修饰提高酶的催化效率 通过修饰可以增强酶的稳定性 通过修饰降低或消除酶蛋白的抗原性7、采用一定的方法（一般为化学法）使酶蛋白的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法称为侧链基团修饰。8、了解氨基、羧基、巯基修饰、胍基修饰、酚基修饰、咪唑基、吲哚基修饰P143-145：（1）羧基：利用各种羧基修饰剂与酶蛋白侧链的羧基进行酯化、酰基化等反应，使蛋白质的空间构象发生改变的方法称
37、为羧基修饰。如：碳化二亚胺、重叠基乙酸盐、乙醇-盐酸试剂、异噁唑盐。（2）氨基：采用某些化合物使酶分子侧链上的氨基发生改变，从而改变酶蛋白的空间构象的方法称为氨基修饰。如：亚硝酸、2,4-二硝基氟苯、丹磺酰氯、醋酸酐、二硫化碳、乙亚胺甲酯、顺丁烯二酸酐、琥珀酸酐等。（3）巯基：采用巯基修饰剂与蛋白侧链上的巯基结合，使巯基发生改变，从而改变酶的空间构象、特性和功能的修饰方法称为巯基修饰。如：酰化剂、烷基化剂、马来酰亚胺、二硫苏糖醇、巯基乙醇、硫代硫酸盐、硼酸化钠。（4）咪唑基：通过修饰剂与咪唑基反应，使酶分子中的组氨酸残基发生改变，从而改变酶分子的构象和特性的修饰方法称为咪唑基修饰。如：碘乙酸、
38、焦炭酸二乙酯。（5）酚羟基：通过修饰剂的作用使酶分子上的酚基发生改变，从而改变酶蛋白的空间构象和特性的修饰方法称为酚基修饰。酚基的修饰包括酚羟基的修饰和苯环上的取代修饰。如碘化法、硝化法、琥珀酰化法。（6）胍基：采用二碳基化合物与胍基反应发生成稳定的杂环，从而改变酶分子的空间构象的方法称为胍基修饰。如：丁二酮、1,2-环己二酮、丙二醛、苯乙二醛。（7）色氨酸吲哚基：通过改变酶分子上的吲哚基而使酶分子的构象和特性发生改变的修饰方法称为吲哚基修饰。如：N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）、2-羟基-5硝基苄溴（HNBB）、4-硝基苯硫氯。（8）分子内交联修饰：含有双功能基团的化合物如戊二醛、己二胺、葡聚糖
39、、二乙醛等，可以在酶蛋白分子中相距较近的两个侧链基团之间形成共价交联，从而提高酶的稳定性的修饰方法称为分子内交联修饰。9、将酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸的修饰方法，称为氨基酸置换修饰。10、氨基酸置换修饰的方法：（1）化学修饰方法 （2）定点突变：是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。11、通过各种物理方法使酶分子的空间构象发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法称为酶分子的物理修饰。课后习题：（两题考一题）1、何谓金属离子置换修饰？简述其主要修饰过程和作用。答案见本章第2、3、4点。2、何谓大分子结合修饰？有何作用？答案见本章第5、6
40、点。第六章：酶、细胞、原生质体固定化1、酶应用过程中的一些不足：酶的催化效率不高 酶的稳定性较差 酶的一次性使用 产物的分离纯化较困难2、采用各种方法，将酶固定在水不溶性的载体上，制备成固定化酶的过程成为酶的固定化。3、固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。4、酶的固定化方法：吸附法、包埋法、结合法、交联法、热处理法等。5、包埋法制备固定化酶或固定化菌体时，根据载体材料和方法的不同，分为凝胶包埋法和半透膜包埋法两大类。6、固定化酶的特性：稳定性、最适温度、最适pH、底物特异性。7、载体性质对最适pH的影响：用带负电荷的载体制备的固定化酶，其最适pH比游离酶的最适pH高（即
41、向碱性一侧移动）；用带正电荷载体制备的固定化酶的最适pH比游离酶的最适pH低（即向酸性一侧移动）；而用不带电荷的载体制备的固定化酶，其最适pH一般不改变（有时也会有所改变，但不是由于载体的带电性质所引起的）。8、产物性质对最适pH的影响：催化反应的产物为酸性时,固定化酶的最适pH要比游离酶的最适pH高一些；产物为碱性时,固定化酶的最适pH要比游离酶的最适pH低一些；产物为中性时,最适pH一般不改变。9、固定化微生物细胞的特点：固定化微生物细胞保持了细胞的完整结构和天然状态，可以进行正常的生长繁殖。固定化微生物细胞保持了细胞内原有的酶系、辅酶体系和代谢调控体系，可以按照原来的代谢途径进行新陈代谢
42、，并进行有效的代谢调节控制。发酵稳定性好，可以反复使用或者连续使用较长一段时间。固定化微生物细胞密度的提高，可以提高产率。由于有载体的保护作用，可以提高基因工程菌的质粒稳定性。10、固定化植物细胞的特点：植物细胞经固定化后，由于有载体的保护作用，可减轻剪切力和其他外界因素对植物细胞的影响，提高植物细胞的存活率和稳定性。细胞经固定化后，被束缚在一定的空间范围内进行生命活动，不容易聚集成团。固定化植物细胞发酵可以在不同的培养阶段简便的更换不同的培养液，即首先在生长培养基中生长增殖，在达到一定的细胞密度后，改换成发酵培养基，以利于生产各种所需的次级代谢物。固定化植物细胞可反复使用或连续使用较长的一段
43、时间，大大缩短生产周期，提高产率。固定化植物细胞易于培养液分离，利于产物的分离纯化，提高产品质量。11、固定化原生质体的特点：（1）固定化原生质体由于没有细胞壁，细胞结构不完整，失去增殖能力，但由于细胞膜内的结构没有受其影响，保持了细胞原有的新陈代谢特性。（2）固定化原生质体由于解除了细胞比这一扩散屏障，可增加细胞膜的通透性，有利于氧气和营养物质的传递和吸收，也有利于胞内物质的分泌，可显著提高产率。（3）固定化原生质体由于有载体的保护作用，具有较好的操作稳定性和保存稳定性，可反复使用和连续使用较长时间，利于连续化生产。在冰箱保存较长时间后仍能保持其生产能力。（4）固定化原生质体易于与发酵产物分
44、开，有利于产物的分离纯化，提高产品质量。（5）在固定化原生质体发酵的培养基中需要添加渗透压稳定剂，以保持原生质体的稳定性。第七章：酶非水相催化1、酶在非水介质中进行的催化作用称为酶的非水相催化。2、酶的非水相催化的主要内容包括有机介质中的酶催化、气相介质中的酶催化、超临界流体介质中的酶催化和离子液介质中的酶催化等。3、有机介质反应体系：微水介质体系 与水溶性有机溶剂组成的均一体系 与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系 正胶束体系 反胶束体系 4、水对有机介质中酶催化的影响P185：（简答）水对酶分子空间构象的影响：酶分子需要一层水化层，以维持其完整的空间构象。维持酶分子完整的空间构象所必需的
45、最低水量称为必需水。必需水与酶分子的结构和性质有密切关系不同的酶，所要求的必需水的量差别很大。水对酶催化反应速度的影响：有机介质中水的含量对酶催化反应速度有显著影响。在催化反应速度达到最大时的水含量称为最适水含量。在实际应用时应当根据实际情况，通过实验确定最适水含量。水活度：研究表明，在有机介质体系中，酶的催化活性随着结合水量的增加而提高。在一般情况下，最适水含量随着溶剂极性的增加而增加。而最佳水活度与溶剂的极性大小没有关系。所以采用水活度作为参数来研究有机介质中水对酶催化作用的影响更为确切。5、有机溶剂对有机介质中酶催化的影响：（1）有机溶剂对酶结构与功能的影响：根据酶分子的特性和有机溶剂的
46、特性的不同保持其空间结构完整性的情况也有所差别。（2）有机溶剂对酶活性的影响：极性较强的有机溶剂，如甲醇、乙醇等，会夺取酶分子的结合水，影响酶分子微环境的水化层，从而降低酶的催化活性,甚至引起酶的变性失活。因此应选择好所使用的溶剂，控制好介质中的含水量，或者经过酶分子修饰提高酶分子的亲水性，避免酶在有机介质中因脱水作用而影响其催化活性。 有机溶剂极性的强弱可以用极性系数lgP表示。P是指溶剂在正辛烷与水两相中的分配系数。极性系数越大，表明其极性越小；反之，极性系数越小，则极性越强。有机溶剂的极性越强，越容易夺取酶分子的结合水，对酶活性的影响就越大。（3）有机溶剂对底物和产物分配的影响：有机溶剂
47、与水之间的极性不同，在反应过程中会影响底物和产物的分配，从而影响酶的催化反应。应该选择极性适中的有机溶剂作为介质使用。一般选用2lgP5的有机溶剂作为有机介质为宜。6、酶非水相催化的应用P197（氨基酰化酶催化的底物类型：D型？L型？）例如P250的L-天冬酰胺酶。固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸连续生产L-氨基酸。固定化氨基酰化酶：世界上第一种工业化生产的固定化酶。1969年，日本田边制药公司将米曲霉中提取分离得到的氨基酰化酶，用DEAE葡聚糖凝胶载体通过离子键结合法制成固定化酶，将L-乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸，用来拆分DL乙酰氨基酸。剩余的D乙酰氨基酸经过消旋化，生成DL乙酰氨基酸，再进行拆分，生产成本仅为用游离酶生成成本的60%左右。第八章：酶定向进化1、定向进化：是模拟自然进化的过程，进行人工随机突变，并在特定的环境条件下进行选择，使进化朝着人们所需要的方向发展的技术过程。定向进化按照进化的对象不同，可以分为分子定向进化、细胞定向进化等。2、酶分子定向进化简称酶定向进化，是模拟自然进化的过程（随机突变和自然选择），在体外进行酶基因的人工随机突变