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1、现代食品发酵技术课程大型综合设计性实验孝感学院生命科学技术学院适用专业：生物工程实验指导老师：游 剑为了适应地方大学本科人才培养的要求，贯彻落实学院“宽口径，厚基础，重实践”为内涵的专业教育、“成人成才”为核心的素质教育和“创业创新”为导向的就业教育相结合的高级应用型人才培养模式，实现以学生未来生存和发展为出发点，将培养具有引领意识、创新精神和实践能力的一专多能的应用型高级专门人才为主要目标。为此，开设了生物发酵、食品科学类课程大型综合设计性实验。整个实验课程分为三部分，共计60学时，实验内容主要为综合设计性实验与多层次科研训练实验。综合设计性实验是在实验中安排芦柑果酒、果醋酿造条件的探讨和用
2、发酵罐酿造芦柑果酒、果醋这2个综合性实验。要求学生每6人为1组、1人定向1个实验项目，互做实验与共同完成。通过开设综合性实验以满足学生个性发展的需要，调动学生实验的主动性和积极性，提高学生提出问题、分析和解决问题的能力。如，为了酿造出品质优良、具有独特风味的芦柑果酒，要求学生在原材料芦柑的选择、芦柑汁的防褐变和澄清处理和酒精发酵的不同环节中开展一项或多项既有探索性、又有以培养学生的综合分析能力的实验设计。在教师的指导下，鼓励学生综合考虑最初酵母添加量、pH、果汁糖度、发酵温度等因素对酒精发酵的影响，然后采用正交试验方法对芦柑果酒的酿造工艺设计试验，采用质量分析和综合评分的方法对甜酒的糖度、酒精
3、度、香气和口感给出正确评价。多层次科研训练实验是鼓励学生申请学院设立的学生学术基金开展小科研实验。另一方面，以教师的科研课题组织学生积极参与开展科研活动，并以教师的科研课题方向作为定向论文选题，以及组织学生参加小发明、小论文等课外科技实验。目录一、国产50L发酵罐的使用（12学时）实验1 发酵罐蒸汽灭菌系统及反应系统的使用（6学时）实验2 发酵罐使用前的清洗和各项参数的设定（6学时）二、芦柑果酒、果醋酿造条件的探讨（30学时）实验3 芦柑汁的防褐变和澄清处理（10学时）实验4 芦柑果酒发酵条件探讨（10学时）实验5 芦柑果醋发酵条件探讨（10学时）三、用发酵罐酿造芦柑果酒、果醋（18学时）实验
4、6 用发酵罐酿造芦柑果酒实验（6学时）实验7 用发酵罐酿造芦柑果醋实验（6学时）实验8 芦柑果酒、果醋质量分析（6学时）发酵罐发酵法酿造芦柑果酒、果醋一、国产50L发酵罐的使用（12学时）实验1 发酵罐蒸汽灭菌系统及反应系统的使用（6学时）（1）蒸汽灭菌系统的介绍高温高压蒸汽对发酵罐的灭菌操作高温高压蒸汽对发酵罐夹套的灭菌操作（2）发酵罐罐体反应系统的介绍发酵罐发酵参数的设定操作发酵罐进样、接种和排污的操作实验2 发酵罐使用前的清洗和各项参数的设定（6学时）发酵罐罐体发酵前先用5%的NaOH清洗，然后用蒸馏水清洗至中性发酵罐发酵温度、时间、pH值、搅拌时的转速等参数的设定二、芦柑果酒、果醋酿造
5、条件的探讨（30学时）实验3 芦柑汁的防褐变和澄清处理（10学时）3.1材料与仪器新鲜芦柑；偏重亚硫酸钠Na2S2O5（分析纯，天津市德恩化学试剂有限公司）；果胶酶（活力单位2.3u/mg，武汉市华顺生物技术有限公司）；柠檬酸C6H8O7H2O（分析纯，天津市东丽区泰兰德化学试剂厂）；碳酸氢钠NaHCO3（分析纯，天津市东丽区天大化学试剂厂）；JYZ-A560榨汁机（九阳股份有限公司）；PL-203电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；HH-4数显恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；PHS-3C型实验室PH计（上海今迈仪器仪表公司）；WYT-4糖量计（泉州光学仪器厂）；7
6、52N紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）。3.2实验步骤3.2.1芦柑汁的制取选取个头饱满，色泽均一的芦柑，剥开，分离果皮、肉、瓤，尽量去除籽、白皮层和囊衣。榨汁，向果汁中添加适量偏重亚硫酸钠静置1h，然后再分别用8、16、32层纱布过滤。未经处理的果汁若长时间在空气中暴露，易发生氧化褐变，应尽快使用。3.2.2实验方案（1）研究不同偏重亚硫酸钠添加量对芦柑汁褐变程度的影响，得出最适的偏重亚硫酸钠添加量。（2）分别研究果胶酶添加量、pH、温度、时间对芦柑汁澄清效果的影响，优化果胶酶的作用条件。3.2.3测定方法（1）果汁澄清度的测定采用分光光度法：蒸馏水为参比，比色杯1cm，以在=65
7、0nm下果汁的透光率T(%)表示果汁的澄清度。（2）果汁可溶性固形含量(%)的测定采用折光法：使用糖量计来检测。（3）果汁中果胶物质的定性检测采用酒精法：用95%的乙醇与芦柑澄清汁按11比例混合，装入30mL的试管，用手四指紧握紧按试管，翻转轻摇，静置15min后观察有无凝胶物质出现，并用“+”号的多少表示凝胶物质的多少。（4）pH的调定：用10%的柠檬酸和10%的NaHCO3，调节芦柑汁的酸碱度。实验4 芦柑果酒发酵条件探讨（10学时）4.1 实验材料与试剂新鲜芦柑；酿酒高活性干酵母（安琪酵母股份有限公司）；白砂糖（美丽田园食品有限公司）；偏重亚硫酸钠Na2S2O5（分析纯，天津市德恩化学试
8、剂有限公司）；碳酸氢钠（分析纯，天津市东丽区天大化学试剂厂）；柠檬酸C6H8O7H2O（分析纯，天津市东丽区泰兰德化学试剂厂）；果胶酶（活力单位2.3u/mg，武汉市华顺生物技术有限公司）。4.2 实验仪器JYZ-A560榨汁机（九阳股份有限公司）；烧杯；玻璃棒；纱布；PL-203电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；HH-4数显恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；温度计；量筒；广口瓶；液封管；PHS-3C型实验室PH计（上海今迈仪器仪表公司）；WYT-4手持糖量计（泉州光学仪器厂）。4.3测定方法温度测定：温度计；pH测定：pH计；可溶性固形物的测定：手持糖量计。 4.
9、4工艺流程 复合果胶酶 芦柑预处理榨汁添加偏重亚硫酸钠过滤酶解静置澄清调整糖度调整pH酒精发酵过滤装罐杀菌成品 安琪酵母 4.5实验步骤4.5.1原料处理 选用成熟度高、无腐烂、个头饱满、色泽均一的新鲜芦柑为原料，剥开，分离果皮、肉、瓤，尽量去除籽、白皮层和囊衣。榨汁：采用榨汁机对处理后的芦柑进行榨汁。防褐变处理：按照0.05gL的偏重亚硫酸钠添加量，将其加入榨得的芦柑果汁中，用玻璃棒搅拌均匀，防止芦柑汁发生褐变。过滤：将芦柑汁分别经4层、8层、16层、32层纱布过滤。4.5.2 酶解和澄清 向过滤后的芦柑果汁中添加0.09gL的果胶酶，pH调到3.5 ，于25下澄清2小时。4.5.3 糖度调
10、整 为了使酿成的酒质量好，并促使发酵顺利进行，澄清后的原汁需根据果汁成分及成品要求调整糖度和pH。白砂糖添加量的计算是根据17g/L 的糖产生1%的酒，果酒需酒精度为810%，果汁质量为W（kg）,果汁的潜在酒精度A=果汁糖度（g/L）/17，加糖量（kg）=(9-A)*1.7%*W。 4.5.4 pH调整 本实验采用的高活性酿酒酵母其最适生长pH值为4.04.5，而芦柑果汁的pH值为3.03.5，用10%的NaHCO3进行调整,调整到需要的pH，必要时可加10%柠檬酸进行回调。4.5.5酵母的活化称取适量高活性酿酒酵母放入小烧杯，加入适量蒸馏水，置于35水浴锅中活化半小时。4.5.6发酵与测
11、定将经过活化的酵母液与芦柑汁充分混合进行发酵，酵母添加量按实验设计进行，且每隔12h测定发酵液的可溶性固形物含量，发酵时间约15d。分别探讨最初酵母添加量、pH、果汁糖度、发酵温度、发酵时间对酒精发酵的影响。实验5 芦柑果醋发酵条件探讨（10学时）5.1 材料与设备材料：新鲜芦柑（购于孝感水果市场）；偏重亚硫酸钠（天津市德恩化学试剂有限公司）；果胶酶（活力单位2.3u/mg，武汉市华顺生物技术有限公司）；白砂糖（美丽田园食品有限公司）；碳酸氢钠（天津市东丽区天大化学试剂厂）；柠檬酸（吴江市奥康化学品有限公司）；酿酒高活性干酵母（安琪酵母股份有限公司）；酿醋醋酸菌（沪酿1.01，上海迪发酿造生物
12、制品有限公司生产）；氢氧化钠(武汉旺森化试公司)。设备：榨汁机（九阳股份有限公司）；PL-203电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；HH-4数显恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；pH计（上海今迈仪器仪表公司）；手持糖量计（泉州光学仪器厂）；烧杯；玻璃棒；纱布；温度计；量筒；广口瓶；液封管。5.2 分析测定方法 温度：温度计；可溶性固形物：手持糖度计；酒精度：酒精计；总酸（以醋酸计）：氢氧化钠滴定法；PH值的测定：用PHS-3C型PH计直接测定。5.3 工艺流程 果胶酶 芦柑预处理榨汁添加偏重亚硫酸钠过滤酶解静置调整糖度调整酸度酒精发酵醋酸发酵果醋过滤杀菌质量检测成品
13、安琪酵母菌 醋酸菌5.4 操作步骤原料分选：选择成熟度高、果实丰满，汁液较多的芦柑，剔除病虫害和腐烂的果实等，以免影响果醋最终的色、香、味，减少微生物污染的可能。剥开，分离果皮、肉、瓤，尽量去除籽、囊衣。榨汁：采用榨汁机对处理后的芦柑进行榨汁。防褐变处理：按照0.05gL的偏重亚硫酸钠添加量，将其加入榨得的芦柑果汁中，用玻璃棒搅拌均匀，防止芦柑汁发生褐变。过滤：将芦柑汁分别经4层、8层、16层、32层纱布过滤。酶解：按照0.09gL的果胶酶用量，将果胶酶加入芦柑果汁中并混合均匀，pH调到3.5,于25下保持2小时。糖度调整：为使酿成的酒液成分接近且品质好，并促使发酵安全进行，根据芦柑的成分及成
14、品所要求达到的酒精度进行调整。根据检测的结果，调整原汁液的糖度。芦柑果汁含有1012%的糖，以1.7g糖可发酵生成1酒精计算，要酿制酒精度810的芦柑果酒需补加一定量的糖分，需加糖量可由下列公式计算：果汁的潜在酒精度A=果汁糖度（g/L）/17加糖量（kg）=(9-A)*1.7%*W酸度调整：本实验使用的酿酒高活性酵母菌采用的果酒酵母最适生长pH值为4.04.5，而柚子果汁的pH值为3.03.5，用10%的NaHCO3进行调整,调整到需要的酸度。必要时可用10%的柠檬酸进行回调。酒精发酵：称取一定量的酵母菌于小烧杯中，加少量蒸馏水，搅拌均匀后，在35下活化半小时，将活化好的酵母菌接种于芦柑汁中
15、。发酵过程中经常检查发酵液的温度，糖度、pH值及酒精度等。醋酸发酵：称取一定量的醋酸菌于小烧杯中，加少量蒸馏水水，搅拌均匀后，在35下活化30min接种于芦柑果酒中，发酵工艺采用500mL广口瓶发酵，发酵时间约为6d左右，发酵期间每天检查发酵液的温度、酒精度及酸度。每次测定发酵液的酸度时，取10mL（约10g）发酵液用NaOH进行滴定。酸度可由下列公式计算：果醋的酸度（%）=(V1-V2)C/M0.06100其中：V1:样液滴定消耗标准NaOH的体积，ml; V2:空白滴定消耗标准NaOH的体积，ml; C: 滴定用NaOH溶液的浓度，mol/L; M:样品质量或体积，g或ml； 0.06:换
16、算为醋酸的系数，即1毫摩尔NaOH相当于醋酸的克数。过滤：将制得的果醋进行过滤除去杂质，提高果醋的稳定性和透明度。杀菌：采用8515min的水浴灭菌法杀灭细菌。5.5发酵与测定将经过活化的醋酸菌液与芦柑果酒充分混合进行发酵，醋酸菌添加量按实验设计进行，且每隔12h测定发酵液的酸度，发酵时间约10d。分别探讨醋酸菌添加量、果酒酒精度、发酵温度、发酵时间对醋酸发酵的影响。三、用发酵罐酿造芦柑果酒、果醋（18学时）实验6 用发酵罐酿造芦柑果酒实验（6学时）6.1 材料与设备材料：芦柑、偏重亚硫酸钠、果胶酶、白砂糖、碳酸氢钠、柠檬酸、酿酒高活性干酵母。设备：发酵罐、榨汁机、电子天平、pH计、手持糖量计
17、、烧杯、玻璃棒、纱布、量筒。6.2 分析测定方法可溶性固形物：糖度计；温度、PH值：用发酵罐直接设定。6.3 工艺流程 复合果胶酶 芦柑预处理榨汁添加偏重亚硫酸钠过滤酶解静置澄清调整糖度调整pH酒精发酵过滤装罐杀菌成品 安琪酵母 6.4 实验步骤原料处理 选用成熟度高、无腐烂、个头饱满、色泽均一的新鲜芦柑为原料，剥开，分离果皮、肉、瓤，尽量去除籽、白皮层和囊衣。（1）榨汁：采用榨汁机对处理后的芦柑进行榨汁。（2）防褐变处理：按照0.05gL的偏重亚硫酸钠添加量，将其加入榨得的芦柑果汁中，用玻璃棒搅拌均匀，防止芦柑汁发生褐变。（3）过滤：将芦柑汁分别经4层、8层、16层、32层纱布过滤。酶解和澄
18、清 向过滤后的芦柑果汁中添加0.09gL的果胶酶，pH调到3.5 ，于25下澄清2小时。糖度调整 为了使酿成的酒质量好，并促使发酵顺利进行，澄清后的原汁需根据果汁成分及成品要求调整糖度和pH。白砂糖添加量的计算是根据17g/L 的糖产生1%的酒，果酒需酒精度为810%，果汁质量为W（kg），果汁的潜在酒精度A=果汁糖度（g/L）/17，加糖量（kg）=(9-A)*1.7%*W。 pH调整 实验采用的高活性酿酒酵母其最适生长pH值为4.04.5，而芦柑果汁的pH值为3.03.5，用10%的NaHCO3进行调整，调整到pH=4，必要时可加10%柠檬酸进行回调。酵母的活化称取适量高活性酿酒酵母放入小
19、烧杯，加入适量蒸馏水，置于 35水浴锅中活化半小时。发酵与测定将经过活化的酵母液与芦柑汁充分混合进行发酵，酵母添加量按0.10g100g果汁，且每隔12h测定发酵液的可溶性固形物含量，发酵时间约15d。实验7 用发酵罐酿造芦柑果醋实验（6学时）7.1 材料与设备材料：新鲜芦柑；偏重亚硫酸钠；果胶酶；白砂糖；碳酸氢钠；柠檬酸；酿酒高活性干酵母；酿醋醋酸菌；氢氧化钠。设备：榨汁机；PL-203电子天平；手持糖量计；烧杯；玻璃棒；纱布；温度计；量筒；广口瓶；液封管。7.2 分析测定方法 可溶性固形物：手持糖度计；酒精度：酒精计；总酸（以醋酸计）：氢氧化钠滴定法；温度、PH值：用发酵罐直接设定。7.3
20、 工艺流程 果胶酶 芦柑预处理榨汁添加偏重亚硫酸钠过滤酶解静置调整糖度调整酸度酒精发酵醋酸发酵果醋过滤杀菌质量检测成品 安琪酵母菌 醋酸菌7.4 操作步骤原料分选：选择成熟度高、果实丰满，汁液较多的芦柑，剔除病虫害和腐烂的果实等，以免影响果醋最终的色、香、味，减少微生物污染的可能。剥开，分离果皮、肉、瓤，尽量去除籽、囊衣。榨汁：采用榨汁机对处理后的芦柑进行榨汁。防褐变处理：按照0.05gL的偏重亚硫酸钠添加量，将其加入榨得的芦柑果汁中，用玻璃棒搅拌均匀，防止芦柑汁发生褐变。过滤：将芦柑汁分别经4层、8层、16层、32层纱布过滤。酶解：按照0.09gL的果胶酶用量，将果胶酶加入芦柑果汁中并混合均
21、匀，pH调到3.5,于25下保持2小时。糖度调整：为使酿成的酒液成分接近且品质好，并促使发酵安全进行，根据芦柑的成分及成品所要求达到的酒精度进行调整。根据检测的结果，调整原汁液的糖度。芦柑果汁含有1012%的糖，以1.7g糖可发酵生成1酒精计算，要酿制酒精度810的芦柑果酒需补加一定量的糖分，需加糖量可由下列公式计算：果汁的潜在酒精度A=果汁糖度（g/L）/17加糖量（kg）=(9-A)*1.7%*W酸度调整：本实验使用的酿酒高活性酵母菌采用的果酒酵母最适生长pH值为4.04.5，而柚子果汁的pH值为3.03.5，用10%的NaHCO3进行调整,调整到需要的酸度。必要时可用10%的柠檬酸进行回
22、调。酒精发酵：称取一定量的酵母菌于小烧杯中，加少量蒸馏水，搅拌均匀后，在35下活化半小时，将活化好的酵母菌接种于芦柑汁中。发酵过程中经常检查发酵液的温度，糖度、pH值及酒精度等。醋酸发酵：称取一定量的醋酸菌于小烧杯中，加少量蒸馏水水，搅拌均匀后，在35下活化30min接种于芦柑果酒中，发酵工艺采用500mL广口瓶发酵，发酵时间约为6d左右，发酵期间每天检查发酵液的温度、酒精度及酸度。每次测定发酵液的酸度时，取10mL（约10g）发酵液用NaOH进行滴定。过滤：将制得的果醋进行过滤除去杂质，提高果醋的稳定性和透明度。杀菌：采用8515min的水浴灭菌法杀灭细菌。实验8 芦柑果酒、果醋质量分析（6
23、学时）8.1芦柑果酒质量分析感官指标：包括色泽、香气、滋味、组织形态。理化指标：包括总固形物、总酸、pH。微生物指标：包括细菌总数、大肠杆菌、致病菌。8.2芦柑果醋质量分析感官指标：包括色泽、香气、滋味、组织形态。理化指标：包括总固形物、总酸、pH。微生物指标：包括细菌总数、大肠杆菌、致病菌。实验总结1.芦柑汁的防褐变和澄清处理防褐变处理：按照0.05gL的偏重亚硫酸钠添加量，将其加入榨得的芦柑果汁中，用玻璃棒搅拌均匀，防止芦柑汁发生褐变。果胶酶处理澄清芦柑汁的最佳条件，即果胶酶用量为0.09g/L，果汁pH为3.5，酶解温度为25，酶作用时间为2h。2.芦柑果酒发酵条件发酵液的初始酵母接种量
24、为0.10，初始pH为4.0，起始糖度为22，发酵温度为32，发酵周期2d。在此条件下进行酒精发酵，芦柑果酒的酒精度可达10%左右。3.芦柑果醋发酵条件醋酸菌接种量9，初始酒精度9度，发酵温度38。发酵周期为5d。在此条件进行醋酸发酵，芦柑果醋的酸度可达7%左右4.芦柑果酒质量分析感官指标：色泽：呈金黄色，有光泽。香气：有芦柑特有的香气和清新的酒香。滋味：酒味柔和，有甜味，不涩，无异味。组织形态：澄清透明，无悬浮物。理化指标：总固形物约为10左右；总酸约为2左右；pH约为4.0左右。微生物指标：细菌总数100个mL；大肠杆菌3个100mL；致病菌：不得检出。5.芦柑果醋质量分析感官指标：色泽：呈深黄色，有光泽。香气：清香醇郁，具有和谐的醋香味。滋味：酸甜可口，口感细腻，柔和。组织形态：澄清，无悬浮物、不分层及无沉淀物。理化指标：总固形物约为9左右；总酸约为7左右；pH约为3.0左右。微生物指标：细菌总数100个mL；大肠杆菌3个100mL；致病菌：不得检出。