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1、分子生物学实验指导江南大学食品营养与功能因子研究中心2009年09月目 录实验一 总RNA的提取和纯化1实验二 RNA的甲醛变性电泳3实验三 RTPCR5实验四 PCR基因扩增7实验五 琼脂糖凝胶电泳检测DNA9I实验一 总RNA的提取和纯化【实验目的】通过本实验学习从鼠肝中提取RNA的方法。【实验原理】每一个真核细胞约含10-5g RNA。理论上每克细胞可分离出5-10mgRNA，其中80-85%是rRNA（主要是28S、18S和5SrRNA），10-15%tRNA和核内小分子RNA，以及1-5%的mRNA。mRNA是一类分子量不均一的RNA，是分子生物学的主要研究对象之一。提取高纯度完整的
2、RNA，是研究基因表达、体外转录、构建cDNA文库、RT-PCR、Northern杂交的重要基础环节。大多数真核细胞mRNA的3末端有polyA组成的尾，利用此特性，可以方便地用寡聚（dT）亲和层析柱分离mRNA。本实验按照TRIzol法提取总RNA。可用于人、动植物、微生物总RNA的提取分离。TRIzol中含有RNase抑制剂异硫氰酸胍、-巯基乙醇和去污剂N-十二烷基肌氨酸钠，可有效的抑制RNA降解，保持RNA的完整性；同时，增强了对核蛋白复合物的解离，使RNA与蛋白分离，在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无蛋白和DNA的水相中，容易被异丙醇沉淀。氯仿不但有一定的蛋白
3、质变性作用，而且能迅速使各相分离，使DNA与其它成分分开。异丙醇使RNA沉淀浓缩。由于mRNA分子的结构特点,容易受RNA酶的攻击反应而被降解，加之RNA酶极为稳定且广泛存在，人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此，在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性，这是本实验成败的关键。在全部实验过程中均需戴手套（使用一次性手套）、口罩操作。所用的玻璃器皿、塑料容器等均需进行处理后方可使用（详见注意事项），实验所用试剂可用含有0.1% DEPC 121高压灭菌处理后的水配置。【仪器、材料与试剂】（一） 仪器1. 冷冻离心机、台式离心机2. 制冰机、恒温水浴锅、马福炉、高压灭菌锅（
4、二） 材料1. eppendorf管、吸头、枪头盒、eppendorf管盒、冰盒2. 移液枪：5-40l 、40-200l 、200-1000l 3. 手术剪刀、镊子、托盘、匀浆器4. 小鼠肝组织（三） 试剂1. Trizol2. 氯仿、异丙醇、DEPC水3. 无水乙醇、70乙醇：4预冷4. 3 mol/L NaAc【实验步骤】1. 动物在实验前禁食8-10小时。取100 mg新鲜肝组织加1 ml TRizol（预冷）试剂，于冰浴中匀浆，匀浆速度要快，使肝组织迅速接触到变性剂，避免组织内源RNA酶的污染。然后将匀浆液转移至1.5 ml 离心管中，冰浴10 min；2. 加入200l（或1/ 5
5、体积）的氯仿，剧烈振荡混合30 s，室温2-5min，静置分层。4 12000 rpm 离心 15 min。离心管中液体分为3层：上层为水相，RNA在此相中，蛋白质在下层黄色的有机相中，DNA保留在上下两层的界面处的中间层中；3. 小心吸取上层水相约0.4ml 于新的塑料离心管中（切勿吸取中间层和下层液体）。加入1倍体积的4预冷的异丙醇，室温放置10 min（或-20静置30 min以上）；4. 4 12000 rpm 离心15min，沉淀RNA，弃上清；5. 用1 ml 预冷的75%乙醇洗涤沉淀，12000 rpm 4离心5min，弃尽上清.6. 重复步骤5，然后室温中自然干燥10 min，
6、至RNA呈半透明状即可；7. 根据RNA提取量加约100l DEPC处理的水溶解沉淀，65水浴10min，立即置于冰上，得到所提取的RNA溶液。如须保存，可加0.1体积的3M醋酸钠（pH 5.2）和2.2倍体积的冰无水乙醇，充分混匀，于-70低温保存。或用稳定的甲酰胺溶解（4mg/ml）, -20保存，用时，4倍乙醇沉淀，回收RNA。【RNA纯度、浓度测定及分子完整性的鉴定】 RNA是否能用于后续实验，取决于它的纯度和分子的完整性，常用的鉴定方法是测定样品260 nm与280 nm的光吸收值以及电泳显示RNA分子是否降解。1. 260 nm /280 nm光吸收比值取10L 总RNA样品，加1
7、000L DEPC处理过的水，混匀，测同一样品在260nm和280nm光吸收值，以A260 / A280 的比值表示其纯度，比值在1.8-2.0之间为纯的RNA，比值低于1.8，说明RNA样品有蛋白质或酚的污染，需要用氯仿重新抽提。2. RNA含量 RNA浓度（g/ml ）= A26040（1/光径）稀释倍数 RNA得量（g）=RNA浓度最终RNA原液毫升数 RNA浓度约1-5g/L为宜3. 电泳鉴定（见实验二）RNA样品（约5-10g）经含甲醛的1.5 % 琼脂糖凝胶变性电泳，电泳后在紫外光激发下，RNA分子会产生桔红色荧光，如此可以观察到28 S和18 S rRNA两条带是否清晰，若28
8、S的荧光强度为18 S的二倍以上，则说明RNA分子没有降解。【注意事项】创造一个无RNase的环境，尽量减少外源RNase及组织细胞内源RNase对RNA的降解作用。1. 实验器具的预处理和配制试剂的注意点（1）金属、玻璃器皿：通常的高压消毒方法不能充分使RNase失活，必须将清洗烘干的玻璃器皿等，用铝铂包装好，在马福炉中300烘烤4 hr。（2）不能经受高温烘烤的器具如塑料管等，最好一次性使用，或在0.1%焦碳酸二乙酯（Diethylpyr ocarbonate DEPC）中37水浴、浸泡12 hr，然后经121（15磅）高温高压20 min后，烘干使用；DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和
9、RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性，也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性，DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。DEPC水经15磅高温高压处理，可分解为CO2而无害。（3）所有试剂、器具应新包装并专用。所有溶液用0.1%DEPC水配置(高温高压处理过)；含Tris的试剂应用0.1%DEPC处理过的水配制（DEPC遇Tris既迅速分解为乙醇和CO2），配好后再经高温高压。（4）实验室环境洁净，避免飞尘及携带微生物RNase污染；为防止操做者手上、唾液的RNase对样品和试剂污染，实验中要戴一次性手套和一次性口罩，并经常更换手套；2. 特异性RNase抑制剂的应用（1）
10、氧钒酰核苷复合物（Vanadyl-ribonuCleoside Complexes，VRC）它是一种由氧化钒离子和四种核苷（腺苷、鸟苷、尿苷和胞苷）组成的复合物，可与RNase结合而抑制RNase的活性。常用浓度为10 m mol；（2）RNasin：为RNase的非竞争、特异抑制剂，1mmol/L二巯基乙醇益于其发挥最大抑制活性。反复冻融易破坏其活性。样品中的VRC和RNasin都可用酚抽提方法去除。3. 组织块用液氮研磨，效果最好；若没有液氮或电动匀浆器，可用手动匀浆器代替，此时组织块需先用眼科剪将组织绞碎，然后再充分研磨。高蛋白，脂肪或多糖类组织，肌肉组织或块状植物组织等，组织匀浆或液氮
11、研磨后须412000离心10min去掉不溶物，再进行后面操作。实验二 RNA的甲醛变性电泳【实验目的】通过实验掌握甲醛变性电泳的原理和方法。【实验原理】核酸是两性解离物质，一般在pH 8.0时向正极移动。不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同，在自由电泳时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开，因此，用适当浓度的凝胶（主要是琼脂糖凝胶和聚丙酰胺凝胶）介质作为电泳支持物，发挥分子筛的功能，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到分离目的。影响核酸分子迁移率的因素主要有核酸分子量大小、电荷密度、颗粒形状、空间构型、胶浓度、电场强度以及缓冲液离子强度等。一般核酸分子量和形状愈小、
12、电荷密度愈大、胶浓度愈低、电场强度和缓冲液离子强度愈强，则迁移率液愈大。甲醛作为变性剂，与谷氨酸残基的单亚氨基基团形成不稳定sehiff碱基对，在凝胶中可阻止链内碱基配对，使RNA维持在变性状态，sehiff碱基对不稳定易被稀释除去。核酸凝胶电泳结果的检测方法有EB（溴化乙锭）、银染法及同位素放射自显影等，其中最常用是EB染色法。EB是一种荧光染料，可嵌入核酸的配对碱基中，在紫外下发出荧光。RNA分子中常用存在自身碱基配对的双链区，也可嵌入EB分子。【仪器、材料与试剂】（一） 仪器1. 琼脂糖凝胶电泳系统：电泳仪、电泳槽2. 紫外观察箱 或凝胶成像系统3. 微波炉（二） 材料1. eppend
13、orf管2. 吸头：200l 、1000l 3. 枪头盒、eppendorf管盒4. 移液枪：5-40l 、40-200l 、200-1000l 5. 胶带纸、培养皿（三） 试剂1. 琼脂糖 2. DEPC水3. 10电泳缓冲液吗啉代丙磺酸（MOPS） 0.2 mol/LNaAc 20mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA） 10mmol/L将4.18 g 3-（N-吗啉代）丙磺酸（MOPS）溶于70 ml DEPC水中,调pH值至7.0,加2mlDEPC处理的1moL/L乙酸钠和2ml经DEPC水配制的0.5 mol/L EDTA.Na2，（pH 8.0）再用DEPC处理水定容至100mL。避光
14、室温保存。4. 上样缓冲液甘油 50EDTA 1mmol/L （pH 8.0）溴酚兰 0.25二甲苯青FF 0.255. 37甲醛6. 溴化乙锭（EB）：200g/ml7. 甲酰胺【实验步骤】1. 电泳槽的处理用去污剂洗涤电泳槽，再用水冲净，用无水乙醇漂洗、干燥，然后在3 H2O2中浸泡30 min,弃3H2O2，用0.1%DEPC处理水将其彻底冲洗干净；2. 胶版制作取一干净的胶板，用胶带纸将胶板两端封住，放于平台上，插入梳子；3. 凝胶制备（以1.5胶，配制30ml为例）称0.45 g琼脂糖熔于21.6 ml DEPC处理水中，冷至60 ，加入20l EB、3ml 10甲醛凝胶电泳缓冲液（
15、终浓度为1）和5. 4 ml 37 甲醛（终浓度为2.2 mol/L），混匀，再倒入制备好的胶板内，化学通风橱凝胶,室温放置，凝固后取出梳子，在胶板上留下的孔为加样孔，并取下胶带纸，放入电泳槽中，加入1甲醛凝胶电泳缓冲液至没过胶面;4. 样品制备在0.5 ml eppendorf管中加5l RNA提取液，然后依次加入2l 10mops ，10l甲酰胺，3l甲醛溶液，65 水浴变性15 min，冰中冷却，稍离心，加2l上样缓冲液，混匀；5. 将上述样品20l加入加样孔中，电压80V，电泳约1hr。至溴酚兰移出8cm。可用已知大小的RNA作为分子量标准参照物。（RNA含量约5-10g）6. 电泳结
16、束，将胶置于UVP凝胶成像系统中观察、摄像（或在紫外观察箱中下照像）【注意事项】1. 甲醛有毒，最好在通风橱中操作；2. 琼脂糖要完全熔于水中，凝胶不能有气泡存在；3. 电泳胶中含溴化乙啶，最好经处理后丢弃。实验三 RTPCR【实验目的】掌握RT-PCR的原理，学会其操作过程。【实验原理】逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或
17、检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。一、常用反转录酶：1 Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱，最适作用温度为37。 2 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性，最适作用温度为42。 3MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScript。此种酶较其它酶能将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的
18、、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。二、常用合成cDNA引物：1 Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。 2 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。【仪器、材料与试剂】（一）仪器1. PCR热循环仪、离心机、微波炉2. 琼脂糖凝胶电泳系统：电泳仪、电泳槽（一） 材料1. PCR管、吸头：200 L、枪头
19、盒、PCR管盒2. 移液枪：0.5-10 l、5-40 l（二） 试剂1. RNA提取试剂、第一链cDNA合成试剂盒2. dNTP、Taq DNA聚合酶【实验步骤】1.合成cDNA在PCR管中加25l反应体系：第一步：模板RNA（约2g） 2ldNTP（10mmol/L） 2lOligo(dT) 2lDEPC水 4l70 5min然后至冰浴迅速冷却；第二步：5逆转录缓冲液 5lRnase Inhibitor 0.2lM-MLV逆转录酶（200U） 0.5lDEPC水 9.3l37 水浴1.5 h, 95 3min, -20保存2PCR：（1）取PCR管配制25l体系，依次加入下列试剂： 第一链
20、cDNA 2 l 上游引物（10 pM） 1l 下游引物（10 pM） 1l dNTP （10 mmol/L） 0.5l 10PCR buffer 2.5l Taq 酶（4 u/L） 0.2lMgCl2 1.5l ddH2O 16.3l轻轻混匀，离心；（2） PCR扩增反应条件为： 94预变性 5 min 94变性 30 s 56退火 30 s（根据引物的设计来确定最佳温度，本实验目的基因为IGF-1） 72延伸 30 s 重复步骤（2）-（4）35次 72延伸 10 min 4冷却恒定（3） 电泳鉴定：琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。【注意事项】1. 在做逆转录反应时，为防止Rnase酶对
21、样品和试剂的污染，实验中要戴一次性手套；2. 逆转录反应dNTP、Mg2浓度较高，需将上述反应液稀释5倍后才能用做PCR模板；3. 严格按顺序加各种试剂，加量要准确；4. 各种试剂加完后混匀，离心，以便溶液集中于管底；5. 及时加盖，防止污染。实验四 PCR基因扩增【实验目的】通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。【实验原理】多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR )的原理类似于DNA的天然复制过程，在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。1. 变性：加热使模板DNA在高温下（94
22、）变性，双链间的氢键受热段裂成为两条单链DNA模板；2. 退火：使溶液温度降至50-60，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火；3. 延伸：溶液反应温度升至72，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），以引物3 端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以53方向延伸，合成DNA新链。上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25-30个循环后DNA可使基因扩增109倍以上，而实际上一般可达106107倍。典型
23、的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Tag聚合酶。【仪器、材料与试剂】（一） 仪器1. PCR热循环仪2. 离心机3. 琼脂糖凝胶电泳系统：电泳仪、电泳槽4. 微波炉（二） 材料1. PCR管2. 吸头：200l 3. 枪头盒、PCR管盒4. 移液枪：0.5-10l 、5-40l （三） 试剂1. 10PCR扩增缓冲液500 mmol/L KCl100 mmol/L TrisHCl （pH 8.0）15 mmol/L MgCl20.1 明胶2. 4dNTP2.5 mmol/L dATP、2.5 mmol/L dCTP、2.5
24、mmol/L dGTP、2.5 mmol/L dTTP3. Tag酶：1U/l 4. DNA模板：10ng/l 5. 引物1（10mol/L）：5 GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA 36. 引物2（10mol/L）：5 CTC CTT ATT GTC ACG CAC GAT TTC 37. 无菌双蒸水【实验步骤】1. 在0.5ml管内配制50l 反应体系反应物 体积/l （浓度）模板DNA 1.0 （10ng）引物1 1.0 （10mol/L）引物2 1.0 （10mol/L）dNTP 1.0 （2.5mmol/L）Tag酶 0.5 （5U/l ）10PCR缓冲液（Mg+）
25、 5ddH2O 40.5Total 50图12. 按下述程序进行扩增（1）94预变性 5 min（2）94变性 1 min（3）52退火 1 min（根据引物的设计来确定最佳温度）（4）72延伸 1 min（5）重复步骤（2）-（4）35次（6）72延伸 10 min（7）4冷却恒定3. 琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果配制1-2%琼脂糖凝胶，取10l 扩增产物电泳，保持电流40mA，电泳结束后紫外观察箱内观察结果。实验结果见（图1）。实验五 琼脂糖凝胶电泳检测DNA【实验目的】通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。【实验原理】DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。D
26、NA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。【仪器、材料与试剂】（一） 仪器1. 恒温培养箱2. 琼脂糖凝胶电泳系统：电泳仪、电泳槽3. 台式离心机4. 高压灭菌锅5
27、. 微波炉6. 紫外观察箱（二） 材料1. eppendorf管2. 吸头：200l 3. 枪头盒、eppendorf管盒4. 移液枪：5-40l （三） 试剂1. 5TBE缓冲液（5倍体积的TBE贮存液）配1000ml 5TBE：pH 8.0Tris 54g硼酸 27.5gEDTA.Na2 3.7g2. 6凝胶加样缓冲液溴酚兰 0.25蔗糖 403. 琼脂糖4. 溴化乙锭溶液（EB）：200g/ml，由于EB易见光分解，用铝铂纸或黑纸包裹容器，放于室温下，EB为致癌强烈诱变剂，操作要小心。【实验步骤】（一） 制备琼脂糖凝胶按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表：琼脂糖
28、凝胶浓度/ 线性DNA的有效分离范围/kb0.3 5-600.6 1-200.7 0.8-100.9 0.5-71.2 0.4-61.5 0.2-42.0 0.1-3称取0.3g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入30ml 0.5TBE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为1琼脂糖凝胶液。（二） 胶板的制备1. 取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好（不能留缝隙）；2. 将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子；3. 将冷到60左右的琼脂糖凝胶液，加入20l EB，摇匀，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）；4. 待胶
29、凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，将有机玻璃内槽放在电泳槽内；5. 加入0.5TBE电泳缓冲液至电泳槽中，刚好没过胶面。（三） 加样用移液枪将已加入上样缓冲液（约1/5体积，取20l样品加4l上样缓冲液）的DNA样品加入样孔（记录点样顺序及点样量）。（四） 电泳1. 接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）。DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm；2. 当溴酚兰染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳（约1-2 hr）。（五） 观察将电泳后的凝胶移入紫外观察箱内观察、拍照。【实验结果】在紫外灯（360nm、312nm或254nm）下观察染色后的电泳凝胶，DNA存在处应显现出桔红色荧光条带（在紫外灯下观察时应戴上防护镜，紫外线对眼睛有伤害作用）。17