色谱分析法导论吴丽荣.ppt

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1、第八章 色谱分析法导论,学习目标,理解色谱分离的基本原理，了解色谱的分类方法 掌握色谱流出曲线所代表的各种技术参数的准确含义 掌握色谱分离的理论基础：塔板理论和速率理论方程 学会各种色谱定性和定量的分析方法,主要内容,8-1 色谱分析法及其基本概念 8-2 色谱分析法基本理论 8-3 色谱分析法定性和定量分析方法,8-1 色谱分析法及其基本概念,一、色谱分析法的产生和发展 二、色谱分析法分类 三、色谱图及常用术语,一、色谱分析法的产生和发展,一、色谱分析法的产生和发展,二、色谱法的分类,2.1 按两相的状态分类 流动相 固定相,气体,液体,液体,固体,1. 气体为流动相的色谱 称气相色谱法（

2、GC）,2. 液体为流动相的色谱 称液相色谱法(LC）,扩展：超临界流体色谱法 (SFC),超临界流体是一种物质状态，当物质在超过临界温度及临界压力以上，气体与液体的性质会趋近于类似，最后会达成一个均匀相之流体现象。它具有气体的低粘度、液体的高密度以及介于气、液之间较高的扩散系数等特征。 SFC是GC和LC的补充， SFC可以解决气液色谱分析的难题，它可以分析气相色谱难汽化的不挥发性样品，同时具有比高效液相色谱更高的效率，分析时间更短。,二、色谱法的分类,2.2 按分离机理分类 吸附色谱：吸附剂对不同组分的吸附能力不同； 分配色谱：不同组分在两相中的溶解度不同； 离子交换色谱：不同组分与离子交

3、换剂的交换能 力不同； 凝胶色谱（分子排阻色谱）:凝胶对不同分子的 阻滞作用不同。 视频凝胶色谱法,二、色谱法的分类,2.3 按操作形式分类 1. 固定相装于柱内的色谱法，称为柱色谱。 比如 GC、HPLC、CE、SFC 视频柱色谱分离操作 2. 固定相呈平板状的色谱，称为平板色谱， 又分为薄层色谱、纸色谱、薄膜色谱。 视频红蓝墨水的纸层析,小结 色谱法的分类？,小结 色谱法的分类,色谱法,LLC,分离机理,液相色谱法,吸附色谱法,分子排阻色谱法,两相状态,分配色谱法,LSC,操作形式,气相色谱法,GSC,GLC,离子交换色谱法,纸色谱法,柱色谱法,薄层色谱法,薄膜色谱法,平板色谱法,三、色谱

4、图及常用术语,（一）色谱图 （产生过程演示）,色谱图：指检测器的响应信号随时间变化的曲线 （浓度-时间曲线）,色谱图产生过程,（二）基本术语,1.基线 2.色谱峰 3.保留值定性依据 死时间t0 ；保留时间tR ；调整保留时间tR 死体积V0 ；保留体积VR ；调整保留体积VR,基 线,1.基线：色谱柱后仅有流动相通过时，检测器响应信号的记录值。,稳定的基线是一条平行于横轴的直线。 基线反映仪器是否稳定 若基线上下波动称为噪声 若基线上斜或下斜称为漂移,2.色谱峰 组分流出时，检测器对该组分的响应信号随时间变化形成的峰形曲线，正常的色谱峰为对称的正态分布曲线。,峰高h=AB 区域宽度评价柱效

5、标准偏差=EF/2 峰宽W =4=IJ 半峰宽 W1/2 =2.354=GH/2 峰面积A定量依据,3.保留值定性分析的依据,死时间t0 不与固定相作用的组分（如空气）从进样到出现峰最大值所需要的时间为死时间，亦即流动相到达检测器所需的时间。,保留时间tR：组分从进样到出现峰最大值所需的时间,组分从进样开始到色谱峰顶点对应的时间间隔称为该组分的保留时间。 当操作条件不变时，组分的tR为定值，因此保留时间是色谱法的基本定性参数。,调整保留时间tR,即tR= tR- t0。 调整保留时间tR体现的是组分在柱中被吸附或溶解的真实时间。因其扣除了与组分性质无关的t0，所以作为定性指标比保留时间tR更合

6、理。,死体积V0,不能被固定相滞留的组分从进样到出现峰最大值所消耗的流动相的体积。亦即从进样器到检测器的流路中未被固定相占有的空隙的总体积。 V0 = t0 F0(F0为载气流速,单位：m L / min) 死时间相当于载气充满死体积所需的时间。死体积大，色谱峰扩张(展宽)，柱效降低。,保留体积VR,是指组分从进样开始到出现峰最大值时所需流动相的体积。 VR = tRF0 (F0为载气流速),调整保留体积VR,VR = tRF0 它真实地反应将待测组分从固定相中携带出柱子所需流动相体积。 tR和VR定性参数。,总结：,利用色谱图可以解决下列问题：,（1） 样品中所含组分的最少个数,（2） 保留

7、值-定性,（3） 色谱峰面积（或峰高）-定量,（4） 色谱峰的区域宽度-评价柱效,4.分配系数K和分配比k,4.1 分配系数K,在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度比，称为分配系数（平衡常数），用K表示，即：,K与柱温有关，与两相体积无关。,分配系数 K的讨论,一定温度下，组分的分配系数K越大，保留值越?，出峰越?； 若两组分的K值相等，则同时出峰 各组分的K值不同是分离的基础； 某组分不被固定相保留，则K=?,（大,慢）,（0）,4.2 容量因子(k)分配比 在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量之比，称为分配比（容量因子、容量比）,补充： tR、VR与K、k的关系,操作条

8、件一定时，K或k越大，保留值越大 若K或k相等，则两组分的色谱峰重合 K或k不等是色谱分离的先决条件,8-2 色谱分析法基本理论,一、塔板理论 二、速率理论 三、色谱分离总效能的衡量,一、 塔板理论,分馏的原理是通过加热， 从塔底形成的上升蒸气流 和从塔顶冷凝的下降液体 流（回流），在塔板液层 上进行气液两相的热交换 和质交换，依据组分的挥 发度不同，轻组分随蒸气 流向上，重组分随液体流 向下，从而完成液体混合 物的分离目的。,一、 塔板理论,该理论是把色谱柱比作一个分馏塔，从而把色谱分离过程比作分馏过程。 色谱柱内有很多层分隔的塔板，在每一层塔 板上，组分可达到一次分配平衡。因被分离组分 的

9、分配系数不同，经多次分配平衡后，K小的组 分先流出色谱柱。 只要色谱柱的塔板足够多，组分的K值仅有微小的差别，也可得到较好的分离。,色谱柱长：L 虚拟的每次分配平衡所需的塔板高度：H 色谱柱的理论塔板数：n 则三者的关系为： n = L / H 理论塔板数的计算公式：,注意：单位统一！,有效塔板数( neff)和有效塔板高度(Heff),n或neff 、H或Heff 描述柱效能的重要指标 对于单一组分，n或neff越大（H或Heff越小）， 柱效能越高，色谱峰越窄。,注意：单位统一！,练习1 在一根长3m的色谱柱上分离一样品，得下列数据：空气、组分1及组分2的保留时间分别为1、14、17min

10、，组分2的峰宽为1min。求： （1）组分1和组分2的调整保留时间； （2）用组分2计算该色谱柱的理论塔板数、理论塔板高度。 （3）用组分2计算该色谱柱的有效塔板数、有效塔板高度。,练习2 在长为2 m的阿皮松柱，柱温为100，记录纸速为2.0cm/min的实验条件下，测得苯的保留时间为1.5min，半峰宽为0.20cm，求理论塔板数和理论塔板高度。 解：,在实验中，如何比较不同色谱柱的柱效？,在相同的实验操作条件下，用同一物质通过不同色谱柱，根据所得的色谱峰分别计算出neff , neff越大，则柱效能越高,思考：,某人制备了一根色谱柱，用组分，为测试样测得该柱的理论塔板数为和，因而推断和组

11、分在该柱上一定能得到很好的分离，该推断正确吗？,思考：,答：不正确。,因为塔板数n多，只能说明柱效高，色谱峰窄；不能判断二组分是否能被分离,塔板理论的特点和不足：,特点： 塔板理论有助于我们了解色谱分离的过程以及柱效的评价。 不足： 它的某些假设与实际色谱仪过程不符； 无法提出提高柱效的途径。,二、速率理论,范第姆特方程式: 式中H为理论塔板高度；u为流动相的线速度(cm/s) ；A为涡流扩散项；B/u为分子扩散项；C u为传质阻力项,其中dp表示固定相的平均粒径大小； 为填充不规则因子 固定相颗粒越小（dp）越小，填充的越均匀，柱效n越高,因分子运动路径不同，导致同分子出柱时间不同：,分子扩

12、散项（纵向扩散项）：B/u,组分在气相中的扩散比在液相中的扩散严重的多，分子扩散项主要针对GC D为组分在流动相中扩散系数（cm2s-1） D = Dl + Dg Dg,减小的方法： 采用较高的载气流速 选择分子量大的重载气（N2） 采用较低柱温,分子扩散与组分在柱中的停留时间有关， 停留时间越长（u小），分子扩散越严重。 因此，当线速度u大时，B/u项可忽略。,3. 传质阻抗项：Cu,减小CL的方法：降低固定液膜厚度； 提高柱温,C = Cg + CL Cg 气相传质阻力系数； CL 液相传质阻力系数,减小Cg的方法：采用粒度小的填充物； 分子量小的气体（如H2）作载气,解释柱填充均匀程度、

13、固定相粒度、流动相种类、流动相流速、柱温、固定液层厚度等对柱效的影响。,热力学：塔板理论,解释色谱峰形状、定义柱效的评价指标,动力学：速率理论Van Deemter方程,两个基本理论,三、色谱分离总效能的衡量,1、柱效能和选择性 2、分离度 R 3、分离度与柱效、选择性的关系,1、柱效能和选择性,柱效能：是指色谱柱在分离过程中的分离效能。对于单一组分：n（或n 有效）越大，柱效能越好。 选择性：常用色谱图上两峰间的距离衡量色谱柱的选择性，峰间距越大说明柱子的选择性越好。一般用相对保留值表示: 相对保留值仅与柱温、固定相性质有关，是比较理想的定性指标。,比较下列色谱分离情况的柱效和选择性高低,柱

14、效低，选择性低 柱效高，选择性低 柱效低；选择性高 柱效高，选择性好,R 1.0：两峰部分重叠； R =1.0：分离程度98%，基本分离； R 1.5：分离程度达99.8%， 完全分离。,2.分离度R总分离效能指标,R =1.5是相邻两峰完全分离的标志。,注意：保留时间与峰宽应取相同单位,R=1.5作为相邻两组分已完全分离的标志,3、分离度与柱效、选择性的关系,可以通过增加塔板数n、增加选择性r2,1、分配比k提高分离度。 设法降低板高，提高柱效，才是提高分离度的最好方法。 可通过改变固定相、降低柱温、控制流动相的极性来增大K。,8-3 定性和定量分析方法,一、定性分析 1.与标样对照的方法

15、2.与其它分析仪器联用的定性方法 二、定量分析 1.定量校正因子 2.定量方法 1）归一化法；2）内标法； 3）外标法,定性分析方法,与标品 对照,1 利用保留值及其规律定性 各物质在一定的色谱条件下均有确定不变的保留值，因此保留值可作为定性指标。,（1）利用绝对保留值定性（标准物对照法） 在相同色谱条件下，分别测得待测物与标准物的保留值。若相同，则可以初步认为可能是同一种物质；若不同，则肯定不是同一种物质。 要求：同台仪器；操作条件稳定一致；有样品的标准物,（2）用相对保留值定性,根据文献，相同色谱条件、相同对照品，测得对照品和待测样品的相对保留值： i-未知组分； s-对照品。 并与文献值

16、比较，若二者相同，则可认为是同一物质。 可消除操作条件的差异 适用于无已知物或组分比较简单的已知范围的混合物试样。,S,（3）用已知物增加峰高法定性,先测未知样品的色谱图 再在同样的色谱条件下测加纯物质的未知样品的色谱图。 对比两张色谱图，哪个峰变高了，则该组分可能是所加的纯物质。 这是在确认某一复杂样品中是否含有某物质的最好办法。,二、 定量分析方法,定量依据：检测器对组分产生的响应信号与组分的量成正比，即,（1）绝对校正因子 指某组分i的量与检测器响应信号之比：,fi与检测器性能、组分和流动相性质及操作 条件有关，不易准确测量。,1.校正因子,（2）相对校正因子（f i） 在定量分析中常用

17、相对校正因子，即某组分（i）与标准物质（S）的绝对校正因子之比。,与待测物、基准物和检测器类型有关， 与操作条件（如进样量等）无关,2.定量方法,1）归一化法,优点：简便、准确，无需标准物，不必准确称量和准确进样，该法适合于常量物质的定量。 缺点： 1. 要求所有组分没有在柱内分解；所有组分都能流出色谱柱且在检测器上均有响应；各组分峰没有重叠 2.必须已知所有组分的校正因子； 3.不适合微量组分的测定。,例：某色谱条件下，分析仅含有二氯乙烷、二溴乙烷及四乙基铅三组分样品，分析结果如下： 试用归一化法求各组分的百分含量。,二氯乙烷 二溴乙烷 四乙基铅,解：,2.定量方法,2）内标法 将已知量的纯

18、物质ms作为内标物，加入到准确称取的试样m中，混合进样测得相应的峰面积，按下式求出某组分的含量：,内标物要满足以下要求,（1）试样中不含有该内标物； （2）与被测组分性质比较接近； （3）不与试样发生化学反应； （4）出峰位置应位于被测组分附近， 但又能完全分开。,2.定量方法,2）内标法 优点：准确性较高，操作条件和进样量的稍许变动对定量结果的影响不大，适用于微量组分的测定，应用广泛。 缺点：每个试样的分析，都要进行两次称量，不适合大批量试样的快速分析,例：苯甲酸工业粗产品纯度的测定，准确称取工业苯甲酸150mg溶于甲醇中，加入内标物正庚烷50mg，进样测得苯甲酸峰面积175mm2，正庚烷峰

19、面积53mm2，用正庚烷作标准，苯甲酸的相对校正因子为0.85，计算苯甲酸的含量。 解：,2.定量方法,3）外标法 外标法也称为标准曲线法。当样品中各组分不能完全流出，又没有合适内标时，可采用此法。 其准确度取决于进样量的准确度与重现性，以及操作条件的稳定性。,（3）标准曲线法,(1)配制一系列不同浓度的标准溶液，分别测定峰面积 (2)以峰面积对浓度绘制标准曲线 y=kx+b （ 理论上k等于绝对校正因子） (3)按相同的操作条件测定样品 (4)根据待测组分的峰面积，从标准曲线上查出其浓度 (5)C原样=cx稀释倍数,适用范围：当只需测定试样中某几个组分，且试样中所有组分不能全部出峰时可用。 优点：适合大批量试样的快速分析。 缺点：操作条件的变化对结果准确性影响较大。,总结,1.掌握色谱法的分类 2.熟悉色谱图常用术语 3.理解塔板理论和速率理论 4.掌握理论塔板数的计算 5.掌握柱效、选择性和分离度的评价 6.掌握色谱法的定量定性分析方法,作业,P91 计算题 2（4）相对保留值 3、 5 下次课上交,同学们，辛苦了！,