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1、第三节 动物的克隆,机械消化或者胰酶消化,一、动物细胞、组织培养,1、什么方法取得离体的单个动物细胞？,2、离体的动物细胞能否正常的生活、表现出正常的生命活动？,（胰蛋白酶）,（1）贴壁生长： 悬浮液中分散的细胞紧贴培养瓶内壁才能生长。 （2）接触抑制： 当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂。 （3）正常的生命活动： 生长、分裂、有规律的衰老、死亡等现象。,2、适宜的环境条件 无菌、无毒环境：加抗生素，定期更换培养液 适宜的温度和pH值：（如人体细胞培养） 温度：36.50.5 pH值：7.2-7.4 适宜的气体环境：O2和CO2（95%空气和5%CO2）,（一）培养条件,三、
2、动物细胞培养过程,成分：无机盐、葡萄糖、氨基酸、维生素和动物血清等,1、含全部营养物质的培养液,原代培养物,细胞系：可连续传代的细胞 原代培养物在首次传代时就成为细胞系。,能连续培养的,连续细胞系,不能连续培养的,有限细胞系,四、细胞系、细胞株,（二倍体细胞）,（异倍体核型细胞） （1）恶性细胞系，异体致瘤性 （2）保留接触抑制，不致癌,（遗传物质改变，不死性）,2、细胞株：,通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞系。 如：单抗细胞株,细胞株一般具有恒定的染色体组型、同工酶类型、病毒敏感性和生化特性等。遗传物质未改变。,连续细胞株：可连续多次传代的细胞株。,有
3、限细胞株：传代次数有限的细胞株,细胞系：泛指可传代的细胞。 细胞株: 具有特殊性质的细胞系。,五、克隆培养法（细胞克隆）,1、概念： 把一个单细胞从群体中分离出来单独培养，使之繁衍成一个新的细胞群体的技术。,2、特点：,遗传性状均一、表现的性状相似，便于研究,异质性细胞系,克隆培养,纯系（克隆）,3、最基本要求:,保证所建成的克隆来源于单个细胞,4、适合于克隆的细胞： 对环境有较大适应范围和具有较强独立生存能力的细胞,5、提高细胞克隆形成率的措施：,选择适宜的培养基 添加血清 （胎牛血清） (能促进细胞的生长、增殖和贴附) 以滋养细胞支持生长（经射线照射的小鼠成纤维细胞） 激素刺激（胰岛素等）
4、 使用CO2培养箱，调节PH,群体细胞 单细胞 无限细胞系、转化或肿瘤细胞 原代细胞、有限细胞系,6、细胞克隆的主要用途： 从普通细胞系中分离出缺乏特殊基因的突变细胞系。 用于研究细胞的遗传规律和生理特性。,动物的细胞融合技术及其应用,一、细胞融合与细胞杂交,1、定义 指用自然或人工方法,使两个或多个不同的细胞融合成一个细胞的过程。 不同基因型的细胞之间的融合就是细胞杂交。,2、诱导方法,动物免疫 分离B淋巴细胞 细胞融合淋巴细胞杂交瘤的制备 杂交瘤细胞的筛选 杂交瘤细胞的克隆 单克隆抗体的提取,二、单抗的制备过程,单克隆抗体,杂交细胞,杂交瘤细胞,骨髓瘤 细胞,特异性杂交瘤细胞,杂交瘤细胞系
5、,提取,经过免疫的 B淋巴细胞,动物细胞融合技术,动物细胞培养技术,单克隆抗体的制备过程：,特点：既能产生专一抗体又能大量繁殖,特点：特异性强灵敏度高可大量制备,动物的克隆繁殖,一、动物细胞全能性的表现程度,1、动物的受精卵，卵裂球含有2-8个细胞时，每个细胞具有全能性。,2、随着胚胎发育的继续，有的细胞只具有分化出各种组织细胞的潜能，这样的细胞叫多能细胞。,3、有的细胞只能分化为一种细胞，叫单能细胞。,受精卵,胚胎细胞,多能细胞,单能细胞,体细胞,2、低等动物细胞：全能性一般容易体现。,1、高等动物细胞,3、癌细胞：仍能逆转为正常细胞。,无论分化还是癌变，变化的都是表现型，基因组成的完整性可
6、以保留。,一、动物细胞全能性的表现程度,为什么动物细胞很难表现出全能性？,二、动物难以克隆的根本原因：,基因表达的调控使得细胞中合成了专一的蛋白质。,一类基因是维持生存的，在各种细胞中都处于活动状态（如呼吸氧化酶基因等）；另一类基因随着组织器官和发育阶段不同而选择性表达（如胰岛素基因、血红蛋白基因等）。,研究表明，各种特化细胞的细胞核中物种基因组完整，具有全能性。,但是分化后的动物细胞基因组基因的活动不完全,三、核移植和动物的克隆繁殖,1、核移植： 利用一个细胞的细胞核（供体核）,来取代另一细胞中的细胞核，形成一个重建的“合子”（重组细胞），使发育成一个新的个体。,胚胎细胞核移植成功率远高于成
7、体细胞核移植。,胚胎细胞克隆：使用的供体核来自胚胎,体细胞克隆：使用的供体核来自体细胞,1952年，罗伯特.布里格斯： 豹蛙 囊胚细胞核+去核的卵母细胞 发育成个体,1978年，童第周： 黑斑蛙成体红细胞核去核的卵细胞中发育成蝌蚪,2、动物克隆繁殖：,多莉的培育用到了哪些技术?,核移植、动物细胞培养、胚胎移植,1.阅读课本P39-37，找出,2.在体细胞核移植过程中选择卵细胞作为受体细胞的原因：,卵细胞大易操作，细胞质中缺少阻止核基因表达的调节蛋白,2.在体细胞核移植过程中选择卵细胞作为受体细胞的原因：,细胞质中具有有效调控细胞核发育的蛋白因子，卵细胞大易操作，营养丰富,体细胞克隆羊的培育成功
8、，证明了什么？ 高度分化细胞经一定技术处理，也可回复到类似受精卵时期的功能。 在胚胎和个体发育中，细胞质具有调控细胞核（包括异源的细胞核）发育的作用。,同时也证明了动物的细胞核具有全能性,体细胞克隆羊成功的分子细胞生物学机理：,1、核移植前对乳腺细胞的营养限制性培养（调节牛血清浓度）和电脉冲细胞融合技术，有利于核的变化和细胞融合后基因表达分子开关启动。 2、重组卵细胞最初分裂时，转录并未开始。 3、重组卵细胞的供体核DNA丢失了来源于乳腺细胞的阻止核基因表达的调节蛋白。 4、开始第三次分裂时，原乳腺细胞的调节蛋白全部被卵细胞质中的蛋白因子替换了，核DNA被重新编排，胚细胞开始表达自己的基因。,
9、动物克隆的应用： （1）有利于遗传疾病的治疗，优良品种的培育 （2）对物种的优化、濒危动物的保护和转基因动物的扩群有重要意义 （3）丰富人们的物质生活，降低畜牧业的成本，缩短育种年限，提高生产效率,在体细胞核移植过程中选择卵细胞作为受体细胞的原因：,细胞质中具有有效调控细胞核发育的蛋白因子，卵细胞大易操作，营养丰富,体细胞核移植技术存在的问题：,许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。,3、动物克隆成功的条件：,（1）具有包含本物种完整基因组的细胞核的活细胞 如：乳腺上皮细胞； （2）能有效调控细胞核发育的细胞质物质 如：去核卵的细胞质； （3）
10、完成胚胎发育的必要的环境条件 如：诱导重组细胞生长、分化的实验条件和怀胎母体的子宫环境,1、用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞 （ ） A、容易产生各种变异 B、具有更强的全能性 C、取材十分方便 D、分裂增殖的能力强,D,2、下列为有关动物细胞培养的叙述，其中不正确的是 A用于培养的细胞大都取自胚胎或幼龄动物的器官或组织 B将所取的组织先用胰蛋白酶等进行处理使其分散成单个细胞 C在培养瓶中要定期用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上脱离，制成悬浮液 D动物细胞培养只能传50代左右，所培养的细胞全部衰老死亡,D,2、用动、植物成体的体细胞进行
11、离体培养，下列叙述正确的是 A都需用CO2培养箱 B都须用液体培养基 C都要在无菌条件下进行 D都可体现细胞的全能性 3、动物细胞克隆是指 A一个单细胞培养成一个新的细胞群的技术 B一个重组细胞经分裂、分化发育成一个动物个体的技术 C几个同种动物的细胞培养成一个新的细胞群的技术 D一个卵裂球经胚胎分割发育成四个细胞群的技术,C,A,4、某研究小组为测定药物对体外培养细胞的毒性，准备对某种动物的肝肿瘤细胞(甲)和正常肝细胞(乙)进行动物细胞培养。下列说法正确的是 ( ) A.在利用两种肝组织块制备肝细胞悬液时，也可用胃蛋白酶处理 B.细胞培养应在含5%CO2的恒温培养箱中进行，CO2的作用是刺激
12、细胞的呼吸 C.甲、乙细胞在持续的原代培养过程中，乙会出现停止增殖的现象 D.仅用该培养液也能用来培养乙肝病毒,C,5.下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是 ( ) A.培养中的人效应T细胞能产生单克隆抗体 B.培养中的人B细胞能够无限地增殖 C.人的成熟红细胞经过培养能形成细胞株 D.用胰蛋白酶处理肝组织可获得单个肝细胞,D,世界上第一只克隆绵羊“多莉”的培育等程序如图所示。请仔细看图后回答问题：,b,图中 过程为 。通过过程形成 的重组细胞核遗传物质与质遗传物质各来自哪里？ 实施时，所需的受体细胞大多采用动物卵细胞的原因是： 。 b过程细胞分裂的方式是 ，此过程是否进行细胞分化？ （答“有
13、”或“无”） 图中c所指过程为 ，图中d指的是克隆绵羊“多莉”经过在母体子宫内 后 。 “多莉”面部的毛色和性别与 绵羊相同，请根据遗传学原理说明判断依据： 。 若不考虑环境因素影响，多莉的性状是否全部像以上绵羊？为什么？ （7）植物组织培养之后，克隆绵羊培育成功，证明动物 。,细胞核移植,具有调控细胞核发育的细胞质物质,有丝分裂,有,胚胎移植,妊娠,出生,白面,“多莉”绵羊的核基因和性染色体全部来自白面绵羊,细胞核也具有全能性,卵细胞细胞质的遗传物质也能控制某些性状,6、若不考虑环境因素影响，克隆羊 的性状全部像白面绵羊吗？原因是？ 右图技术具有多种用途，但是不能（ ） A.有选择地繁殖某一性别的家畜 B.繁殖家畜中的优良个体 C.用于保存物种 D.改变动物的核基因 在现有技术条件下，还不能将从动物 体内分离出来的成熟的体细胞直接培养成 一个新个体，而是必须将体细胞的细胞核移植到去核的卵细 胞中才能发育成新个体，你认为原因最可能是（ ） A.卵细胞大，便于操作 B.卵细胞含有的营养物质多 C.卵细胞的细胞质可使体细胞核全能性得到表达 D.重组细胞才具有全能性,D,C,卵细胞细胞质的遗传物质也能控制某些性状,细胞贴壁过程,细胞在贴壁生长过程中,随着细胞分裂,数量不断增加,最后形成一个单层,此时细胞间相互接触,细胞分裂和生长停止。,接触抑制,