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1、重组DNA技术 DNA Recombination Technique 一、重组一、重组DNADNA技术相关概念技术相关概念 克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)， 即无性繁殖。 （一） DNA克隆 技术水平：分子克隆(molecular clone) 即DNA 克隆 细胞克隆 个体克隆（动物或植物） 基础理论和技术发展促进了基因工程技术基础理论和技术发展促进了基因工程技术 1 1基因转移载体的发现基因转移载体的发现 2 2工具酶的发现工具酶的发现 3 3DNADNA合成和测序技术的发明合成和测序技术的发明 DNADNA体外重
2、组的实现体外重组的实现 5 5重组重组DNADNA表达实验的成功表达实验的成功 6 6第一例转基因动物问世第一例转基因动物问世 7 7PCRPCR技术的发明技术的发明 目的 分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质） 基因工程(genetic engineering) 实现基 因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程， 又称重组DNA工艺学。 （二）工具酶 v 限制性核酸内切酶 v DNA聚合酶 v 逆转录酶 v T4DNA连接酶 v 碱性磷酸酶 v 末端转移酶 v Taq DNA聚合酶 限制性核酸内切酶 定义 限制性核酸内切酶(restriction endonucl
3、ease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周 围切割双链DNA的一类内切酶。 DNA分子 磷酸二酯键磷酸二酯键 切割DNA分子实 质是断开两个核 苷酸之间的磷酸 二酯键。 限制性核酸内切酶 限制酶的识别序列：限制酶的识别序列： 作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制修 饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA 。 分类 、 （基因工程技术中常用型） 类酶识别序列特点 回文结构(palindrome) 切口 ：平端切口、粘端切口 GGGGA AT TCCCC CCCCT TA AGGGG Bam H GTC CAG G CCTAG GATCC G + GGATCC CCTAGG H
4、ind GTCGAC CAGCTG GAC CTG + 平端切口粘端切口 DNADNA连接酶连接酶 作用作用: : 把切下来的把切下来的DNADNA片段拼接成新的片段拼接成新的DNADNA， 即将即将脱氧核糖和磷酸脱氧核糖和磷酸连接起来连接起来. . 作用原理：作用原理： 催化磷酸二酯键形成 类型：类型： 类型 EcoliEcoliDNADNA连接酶连接酶 T T4 4 DNADNA连接酶连接酶 来源来源 功能功能 大肠杆菌大肠杆菌 T T4 4 噬菌体噬菌体 恢复恢复 磷酸磷酸 二酯键二酯键 只能连接只能连接黏性末端黏性末端 能连接能连接黏性末端黏性末端和和 平末端平末端( (效率较低效率较
5、低) ) 相同点相同点差别差别 重组DNA技术中常用的工具酶 工 具 酶功 能 限制性核酸内切酶识别识别 特异序列，切割DNA DNA连连接酶催化DNA中相邻邻的5磷酸基和3羟羟基末端之间间形成磷酸 二酯键酯键 ，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连连接 DNA聚合酶合成双链链cDNA分子或片段连连接 缺口平移制作高比活探针针 DNA序列分析 填补补3末端 Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53 聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于 cDNA第二链链合成，双链链DNA 3末端标记标记 等 反转录转录 酶合成cDNA 替代DNA聚合酶I进进行填补补，
6、标记标记 或DNA序列分析 多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羟羟基末端磷酸化，或标记标记 探针针 末端转转移酶在3羟羟基末端进进行同质质多聚物加尾 碱性磷酸酶切除末端磷酸基 （三）目的基因 v cDNA (complementary DNA) v基因组DNA (genomic DNA) （四）基因载体 定义 为携带目的基因，实现其无性繁殖或 表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分 子。 常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA 克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意 设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的
7、外源DNA序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为表达载体。 作为基因工程运载体的条件作为基因工程运载体的条件 能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。 具多种限制酶切点，以便与外源基因连接。具多种限制酶切点，以便与外源基因连接。 具有某些标记基因，便于进行筛选。具有某些标记基因，便于进行筛选。 载体是安全的，不能对受体细胞有害。载体是安全的，不能对受体细胞有害。 载体载体DNADNA分子大小应合适，以便提取和在体外进行分子大小应合适，以便提取和在体外进行 操作。操作。 常用的载体：质粒常用的载体：质粒 能复制并带着能复制并带着 插入的目的基插入的目的基 因一起
8、复制因一起复制 有切割位点有切割位点 有标记基因的有标记基因的 存在，可用含存在，可用含 氨苄青霉素的氨苄青霉素的 培养基鉴别培养基鉴别 目 录 噬菌体DNA改造系统 gt系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆） 噬菌体(phage) M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因） M13mp系列 pUC系列 二、重组DNA技术基本原理 基本原理 目的基因的获取 DNA导入受体菌 外源基因与载体的连接 克隆载体的选择和构建 重组体的筛选 克隆基因的表达 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程 目 录 （一）目的基因的获取 1. 化学合成法 要求：已知目
9、的基因的核苷酸序列或 其产物的氨基酸序列 。 2.基因组DNA文库(genomic DNA library) 3. cDNA文库(cDNA library) 4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 组织或细胞染色体DNA 基因片断 克隆载体 重组DNA分子 含重组分子的转化菌 限制性内切酶 受体菌 基因组DNA文库 存在于转化细胞内 由克隆载体所携带的所 有基因组DNA的集合 * 从基因组DNA文 库获取目的基因 目 录 mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制 * 从cDNA文库获取目的基因 逆转
10、录酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶 碱水解 T T T T 目 录 （三）外源基因与载体的连接 （二）克隆载体的选择和构建 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 T4 DNA连接酶 15C 重组体 载体自连 目的基因 自连 目 录 受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) 导入方式 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection) （四）重组DNA导入受体菌 （五）重组体的筛选 1. 直接选择法 (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker resc
11、ue) (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹 2. 免疫学方法 如免疫化学方法及酶免检测分析等 平板筛选 是指利用载体的遗传性标记在平板上直接筛选的方法 。 具有抗药性标记的载体，转化宿主细胞后，能 在含抗生素（Amp或Tet）的培养平板上生长；未转 化的则不能生长。 1. 插入失活 2. 当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内， 使 3. 该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生素 的 4. 培养平板上。 (插入失活法) 抗药性标记选择 目 2. 蓝-白筛选 利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。 载体：编码-半乳糖 宿主： 编码-半乳糖 苷酶N端序列 苷酶
12、C端序列 -互补 细菌表达： -半乳糖苷酶活性 5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） 形成蓝色菌落 当在质粒中插入外源DNA-半乳糖苷酶的N端基因失活 不能与宿主-半乳糖苷酶的C端进行-互补产生白色菌落。 （IPTG 存在下） 组氨酸缺陷 型大肠杆菌 无组氨酸 的培养基 酵母咪唑甘油磷 酸脱水酶基因 促进组氨酸合成 DNA 重组体 标志补救 原 位 杂 交 Southern印迹 目 录 小结：重组DNA技术操作的主要步骤 载体 质粒噬菌体病毒 目的基因（外源基因） 基因组DNA cDNA 人工合成PCR产物 限制酶消化 开环载体DNA目的基因 连接酶 重组体 转化体外包装，转染 带重组体的
13、宿主 筛选 表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交 五、重组体在宿主细胞中的表达和调控 基因工程的最终目的是通过载体将外源基因导入 合适的宿主细胞中高效表达，产生有重要价值的蛋白 质产品。 克隆基因表达条件： 基因的编码区不能被插入序列中断; 基因转录要有启动子，而启动子必须能被宿主 细胞的RNA聚合酶有效地识别; mRNA必须相当稳定，并有效地被翻译，产生的外 源蛋白质必须不为宿主细胞的蛋白酶所降解。 1. 原核表达体系 （E.coli表达体系最为常用） 标准：选择标志强启动子 翻译调控序列多接头克隆位点 E.coli表达体系的不足 不宜表达真核基因组DNA 不能加工表达的真核蛋白质 表达的蛋白质
14、常形成不溶性包涵体 (inclusion body) 很难表达大量可溶性蛋白 优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 缺点：操作技术难、费时、经济 转染 将表达载体导入真核细胞的过程 方法：磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 脂质体转染 显微注射 2. 真核表达体系 酵母、昆虫、乳类动物细胞 三、 重组技术在医学中的应用 （一）疾病基因的发现 1990年美国科学家率先启动人类基因组计划（HGP ），计划历时15年，至2005年完成； 2001年2月12日由Since和Nature杂志同时向世界 宣布，人类基因组3X109bp的最新图谱，
15、约含34万个 基因； 整个人类基因组的全部核苷酸序列不久即将完成 。但要揭示人类4万个基因功能的任务将更为艰巨。 人类基因组图谱的初步完成，不仅为全部基因 的定位建立了一个开放框架，而且为分离、鉴定人 类疾病相关基因提供了参照模板。 如已知人类遗传性疾病约有3000种，推测可能 是由于某些基因结构异常或基因位移等突变所致。 如果利用分子生物学技术，将患者疾病基因与正常 基因图谱作对照分析，必将有助于阐明遗传病的分 子机制，这对遗传病的基因治疗将起到不可估量的 推动作用。 制备基因工程疫苗 基因工程疫苗可以帮助解决传统技术难以解决的 一些特殊的病原体疫苗。如， （1） 乙型肝炎病毒疫苗（HBV）
16、、丙型肝炎病毒疫 苗（HCV）等； （2） 有诱发致癌或产生免疫病理作用的疫苗，如人 T细胞免疫缺陷病毒（HITV-1）等； （3） 常规效果较差的疫苗，如霍乱和痢疾疫苗等 （4） 制备一些多价疫苗等。 （二）生物制药 动物药厂 通过转基因动物生产感兴趣的基因 把YFG放在乳球蛋白的启动子下 注入羊卵细胞植入借腹怀孕的母羊 体内 YFG在乳腺中表达 乳汁中提纯YFG蛋白。 产品名称 治疗功能与医药范围 1. 人胰岛素 治疗糖尿病 2. 人生长激素 治疗侏儒症，加速创口愈合 3. 干扰素 治疗癌症、病毒感染 4. 干扰素 治疗带状疱疹，眼结、角膜炎 5. 干扰素 治疗癌症、病毒感染 6. 人组织
17、纤溶酶原激活因子(tPA) 溶解血栓，治疗急性心肌梗塞 7. 红细胞生成素 (Epo) 治疗肾病性贫血，增加红细胞及血色素水平 8. 超氧化物歧化酶 清除超氧化物，治疗关节炎，缓解心肌坏死 9. 凝血因子 治疗A型血友病 10. 乙型肝炎疫苗 防治肝炎 11. 神经生长因子 维持神经元细胞存活、生长和分化 12. 脑啡肤 镇痛 13. 降钙素 治疗骨质疏松症 生产蛋白质和多肽类活性物质 基因诊断(genetic diagnosis)是利用分子生物学及 分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传 疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。 （三）基因诊断 基本过程 区分或鉴定DNA的异常 分
18、离、扩增待测的DNA片断 标准 . 能正确扩增靶基因； . 能准确区分单个碱基的差别； . 本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定; . 便于完全自动化操作，适合大面积、 大人群普查。 （四）基因治疗 定义 基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷 的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿 其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。 方式 体细胞基因治疗 (somatic cell gene therapy) 性细胞基因治疗 (germ line gene therapy) 转基因动物研究基因治疗 1. 基因检测与产前诊断 2. 携带者测试 3. 症候前诊断 4. 遗传病易感性分析 （五）遗传疾病的预防