食品卫生微生物检验.ppt

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1、食品卫生微生物学检验,菌落总数测定GB/T4789.23-2008 大肠菌群计数GB/T4789.232008 大肠菌群测定GB/T4789.23-2003,微生物,细菌 酵母菌、霉菌、食用菌 病毒,细 菌,细菌的种类约有2000种。分布很广，水、空气、壤和许多动植物体内外都有细菌的分布。 细菌是单细胞原核微生物，个体微小，形态简单，以二等分裂方式繁殖。在自然界中，细菌分布最广、数量最多。,细菌的形态和大小,细菌的形态通常可分为三种基本类型： 球菌：细胞球形，直径0.52微米； 杆菌：细胞呈杆棒状，长1.510微米，宽0.51微米； 螺旋菌：细胞长而弯曲，略弯曲的称为弧菌。 放线菌：还有一类特

2、殊的细菌，称放线菌。个体为单细胞分枝的丝状体，能产生分生孢子(conidospore)。由于放线菌的分枝丝状体和孢子形成的方式和真菌很相似，因此可把它们看作是细菌和真菌的过渡类群。 ，,细菌的形态,细菌的三种基本形态: 球状、杆状和螺旋状,1. 球 菌,葡萄球菌 分裂面不规则，多个球菌聚在一起，像一串串葡萄。 如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus),葡萄球菌,2.杆菌 杆菌是细菌中种类最多的类型,因菌种不同,菌体细胞的长短、粗细等都有所差异。 杆菌的形态：短杆状、长杆状、棒杆状、梭状、梭杆状、月亮状、分枝状、竹节状等；按杆菌细胞的排列方式则有链状、栅状、“八”字状以及有

3、鞘衣的丝状等。,一般情况下,同一种杆菌的宽度比较稳定,但它的长度经常随培养时间、培养条件的不同而有较大的变化。 杆菌举例： 大肠杆菌（Escherichia coli） 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 北京棒杆菌（Corynebacteriun Pekinensis）,2.杆 菌,螺旋状的细菌称为螺旋菌。 根据其弯曲情况分为： 弧菌：螺旋不满一圈，菌体呈弧形或逗号形 例：霍乱弧菌、逗号弧菌 螺旋菌：螺旋满26环，螺旋状 例：干酪螺菌 螺旋体：旋转周数在6环以上，菌体柔软。 例：梅毒密螺旋体,3、螺旋菌,4、芽孢 概念：某些菌生长到一定阶段，细胞内形成一个圆形、椭圆形或卵圆形

4、的内生孢子，是对不良环境有较强抵抗力的休眠体。,芽孢,芽孢的形态及其在细胞中的位置：,A 近中央,B 末端,C 中央,细菌芽孢的各种类型,细菌细胞结构,细菌繁殖,细菌主要以裂殖方式进行无性生殖。在分裂时，首先核质进行分裂，接着在菌体中央形成横隔膜，把细胞质分为两个部分，然后细胞壁向内生长将横隔膜分为两层，并形成子细胞的细胞壁。细菌裂殖的速度极快，在最适的条件下，2030分钟就可分裂一次。细菌在固体培养基上裂殖的结果，许多细胞堆积在一起形成肉眼看得见的群体，叫做菌落。,群体形态 1. 固体培养,菌落：在固体培养基上,由单个细胞繁殖形成的肉眼可见的子细胞群体。 菌苔:大量细胞密集生长,结果长成的各

5、“菌落”连接成一片。,(1)平板培养,常见的有害细菌,寄生细菌能引起人、畜、禽及植物发生病害，甚至造成死亡，如痢疾、霍乱、白喉、破伤风等病菌；水稻叶枯病、棉花角斑病、蔬菜软腐病等病原菌。腐生细菌常致使肉类等食品腐烂，工业生产中常因污染了杂菌而使发酵停止等等。 食品中常见的有害细菌 肠道致病菌: 沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌。 葡萄球菌、溶血性链球菌等。,食品微生物污染及途径,食品污染的种类： 生物污染：微生物、寄生虫及虫卵、昆虫 微生物污染食品的途径： 通过水而污染 通过空气而污染 通过人及动物而污染 通过用具及杂物而污染,无菌室、超净工作台,培养基,培养基是人工配制的适合于不同微生物生

6、长繁殖或积累代谢产物的营养基质。它是进行科学研究，发酵生产微生物制品等的基础 。,1固体斜面培养 2. 液体培养基 3. 半固体培养,配制培养基的原则 根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基，如自型微生物的培养基完全可以（或应该）由简单的无机物质组成。异养做生物的培养基至少需要含有一种有机物质。 按微生物的主要类群来说，又有细菌、放线菌、酵母菌和霉菌之分。它们所需要的培养基成分也不同，分别称为牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号合成培养基，麦芽汁培养基，查氏合成培养基。 见GB/T 4789.2-2008 、 GB/T 4789.3-2008标准附录,无菌操作,灭菌杀灭所有微生物的繁殖体和芽孢的过程

7、。方法分为物理、化学灭菌法。实验室中所有器材一定要达到灭菌要求，100万个菌体中仅有个存活。 干热灭菌1801小时 湿热灭菌高压蒸气灭菌121 15分钟 消毒用物理、化学方法杀灭环境中病原菌的过程。1000个菌体中仅有个存活。 物理方法-紫外线、机械过滤等 化学方法-消毒剂如二氧化氯、二氯异氰尿酸及二氯异氰尿酸钠、臭氧、双氧水、75%酒精。 防腐防止或抑制微生物生长繁殖的方法。,玻璃器皿干热灭菌,包扎,湿热 灭菌,包扎,75%酒精配制,无水酒精75毫升,加蒸馏水25毫升 95%酒精79毫升,加蒸馏水21毫升 计算: V1=N2V2N1 用95%酒精毫升数=7510095=78.9,一、菌落总数

8、测定 GB/T4789.2-2008,1、菌落总数-在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样中形成菌落的总数 2、按本标准规定的培养条件下，即在需氧情况下，36培养48h、30 培养72h能在平板计数琼脂上生长发育的嗜中温需氧或兼性厌氧的菌落总数 3、菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量,第一法 平板计数法,检验程序,检样25g(mL)样225mL稀释液,均质,10倍系列稀释,1 mL样液倾注平皿,加平板计数琼脂培养基,计数,报告,（一）样品的稀释,固体和半固体:以无菌操作取检样25g，放于盛有225mL无菌磷酸缓冲液或灭菌生理盐水容器内，

9、经充分振摇或研磨制成1：10的均匀稀释液 液体:以无菌操作取检样25mL，放于盛有225mL无菌磷酸缓冲液或灭菌生理盐水锥形瓶内，经充分振摇制成1：10的均匀稀释液 用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液,GB/T4789.2-2008 菌落总数,（二）倾注平皿,根据标准要求或对污染情况的估计，选择23个适宜稀释度，分别在制10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿 ，同时作两个空白对照。 将凉至461 营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。同

10、时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。,GB/T4789.2-2008 菌落总数,（二）培养,待琼脂凝固后，翻转平板，置361培养482h，水产品301 培养72h3h。取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数,接种,培养,（三）计数 菌落形成单位CFU,培养到时间后，选项30300CFU之间的平板计数，记录稀释倍数和相应的菌落数,GB/T4789.2-2008 菌落总数,（四）结果的表述,一个稀释度在适宜范围内：两个平板菌落平均值 稀释倍数。 两个连续稀释度在适宜范围内： 菌落数=菌落数之和 / (n1+0.1n2) 第一稀

11、释度 示例：,第二法、菌落总数测试片法,详见标准,二、大肠菌群计数 GB/T4789.3-2008,大肠菌群是一群需氧及兼性厌氧、在36培养48h能发酵乳糖产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌 。 大肠菌群是作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能。 报告：根据大肠菌群阳性管数，检索MPN表报告（ MPN）最可能数/mL(g) 样品（间接计数法 ）,第一法、大肠菌群MPN计数 GB/T4789.3-2008,检验程序,检样25g(mL)样225mL稀释液,均质,10倍系列稀释,三个连续稀释样液接种LST肉汤管,不产气,大肠菌群阴性,查MPN表,产气,BGLB肉

12、汤,产气,不产气,报告,大肠菌群阳性,（一）初发酵试验,样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤发酵管。361培养482h，观察是否产气,GB/T4789.3-2008 大肠菌群,（二）复发酵试验,将产气发酵管分别取1 环培养物移种于煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，美蓝琼脂平板上，361培养482h，观察是否产气,GB/T4789.3-2008 大肠菌群,（三）大肠菌群最可能数（MPN）的报告,根据大肠菌群阳性管数，检索MPN表，报告MPN值/g(m) 示例：,第二法、大肠菌群平板计数 GB/T4789.3-2008,检验程序,检样25g(mL)样22

13、5mL稀释液,均质,10倍系列稀释,三个连续稀释样液接种VRBA平板,大肠菌群阴性,计算,计数典型和可疑菌落,挑选10个不同类型典型的可疑菌落接种BGLB肉汤管,产气,不产气,报告,大肠菌群阳性,（三）大肠菌群平板计数CFU的报告,根据证实为大肠杆菌阳性的试管比例乘以计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，报告每1g（或mL）样品中大肠菌群的CFU/g (CFU/ Ml) 示例：,第三法 大肠菌群测试片法 GB/T4789.3-2008,检验程序,检样25g(mL)样225mL稀释液,均质,10倍系列稀释,23个适宜稀释度样液接种测试片,培养,计数计数,报告,三、大肠菌群测定 GB/T4789.3-

14、2003,大肠菌群是一群能发酵乳糖产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌 。 大肠菌群是作为粪便污染指标评价食品的卫生质量，推断食品中肠道致病菌污染的可能。 食品中大肠菌群数系以100 mL(g) 检样内大肠菌群最可能数（MPN） 表示（间接计数法 ）。,大肠菌群测定GB/T4789.3-2003,检验程序 报告MPN/100mL(g),检样25g(mL)样225mL稀释液,均质,10倍系列稀释,乳糖胆盐发酵管3624小时,大肠菌群阴性,报告,产气,不产气,大肠菌群阳性,报告,伊红美蓝琼脂平板3624小时,大肠菌群阴性,大肠菌群阴性,革兰氏染色,革兰氏阳性,报告,革兰氏阴性,乳糖发酵管3624小时,报告,不产气,产气,中华人民共和国卫生部2009年第16号公告,为规范食品中大肠菌群指标的检测工作，现公告如下： 现行食品标准中规定的大肠菌群指标以“MPN/100克或MPN/100毫升”为单位的，适用食品卫生微生物学检验大肠菌群测定（GB/T4789.3-2003）进行检测； 以“MPN/克或MPN/毫升”、“CFU/克或CFU/毫升”为单位的，适用食品卫生微生物学检验大肠菌群计数（GB/T4789.3-2008）进行检测。 MPN-大肠菌群最可能数 CFU-大肠菌群数,