生化制备概论.doc

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1、生化制备概论一 制备主要对象及特点对象： 蛋白质 (肽) 核酸 多糖（类）脂类 其它生物活性功能性分子 等等。特点：蛋白质：易降解 易变性 多样性 多种因素影响活性核酸 分子量大，易被机械切割力破坏（基因组DNA） 易降解（酶解）特别是RNA 常与核蛋白质结合多糖 成分复杂多样，分析困难， 糖苷同样也会被多种酶降解脂类 种类多，成分复杂，分析仪器要求较高生物活性功能性有机分子 性质多样，有的易被氧化、有的怕光，有的怕热等等二 物质的提取与缓冲溶液针对蛋白质的操作一般要注意的问题：基本原则：防止生物分子变性、降解1控制适当的pH 2控制低温 3注意提取过程中的溶液环境 4防止提纯过程中丟失一些辅

2、助因子或亚基1 低温 04度。2 缓冲溶液提取操作，适度的离子(盐)浓度。3加保护剂酶抑制剂，如 巯基乙醇，DTT,，Vc,PVP,重金属络合剂， 酶的底物 蛋白酶抑制剂等等。4操作连续，尽量快速。5 避免剧烈搅拌。1 蛋白质的溶液提取（抽提）水溶液提取：大部分蛋白质均溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中。因此蛋白质的提取一般以水为主。稀盐溶液和缓冲溶液对蛋白质稳定性好、溶度大，是提取蛋白质的最常用溶剂。稀释变性与盐溶现象 PH控制 缓冲溶液 材料选择与细胞破粹方法 （附渗透冲击） 离子（盐）浓度的确定盐浓度等渗盐溶液尤以0.020.05mol/L 磷酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液常用。0.15mol/L

3、 氯化钠溶液应用也较多。如6-磷酸葡萄糖脱氢酶用0.1mol/L 碳酸氢钠液提取等。有时为了螯合某些金属离子和解离酶分子与其他杂质的静电结合，也常使用枸橼酸钠缓冲液和焦磷酸钠缓冲液。有些蛋白质在低盐浓度下浓度低，如脱氧核糖核蛋白质需用1mol/L 以上氯化钠液提取PH 值：蛋白质提取液的PH 值首先应保证在蛋白质稳定的范围内，即选择在偏离等电点两侧。如碱性蛋白质则选在偏酸一侧，酸性蛋白质选择偏碱一侧，以增大蛋白质的溶解度，提高提取效果。如细胞色素C 属碱性蛋白质，常用稀酸溶液提取，肌肉甘油醛-3-磷酸脱氢酶属酸性蛋白质，可用稀碱溶液提取。材料选择微生物、植物和动物都可作为制备蛋白质的原材料，所

4、选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备 细胞破粹方法l 1、高速组织捣碎：将材料剪小，放

5、置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等l 2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。l 3、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100 毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感物质和核酸应慎用。l 4、反复冻融法：将细胞

6、在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。l 5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。l 6渗透冲击：用蒸馏水冲击细胞或经过高渗液处理（平衡）过的细胞，让细胞内容物释放出来。无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入对苯甲基磺酰氟（PMSF）也能

7、清除蛋白水解酶活力，但不是全部，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取2 缓冲溶液l 缓冲溶液的浓度 02M PH 5.6HAc-NaAc 0.15M PH 8.0 Tris-HCI 缓冲溶液的配制1 2 缓冲溶液的缓冲范围1 和缓冲值（容量） 合成生物体系缓冲溶液 GoodS缓冲溶液 2 常用缓冲溶液及特点 磷酸缓冲液a b HAc-NaAc Tris-HCI 附1 2l 例 如何配置0.5M,PH=5.1的HAc-NaAc缓冲液 l HAc pKa=4.7l 设定1000ml 需要 NaAc X mol, HAc Y moll 则 X+Y=0.5l 5.1=

8、4.7+logX/Yl 解方程得X 称取无水晶体 Y通过密度量取mll 缓存范围 PK- 1-PK+1生物体系缓冲溶液 GoodS缓冲溶液有机溶剂提取：有机溶剂提取用于提取蛋白质的实例至今是不多的。但一些和脂结合较牢或分子中非极性侧链较多的蛋白质，不溶于水、稀盐或稀碱液中，可用不同比例的有机溶剂提取。从一些粒线体及微粒体等含多量脂质物质中提取蛋白质时，采用Morton 的丁醇法效果较好。因丁醇使蛋白质的变性较少，亲脂性强，易透入细胞内部，与水也能溶解10%，因此具有脂质与水之间的表面活性作用，可占据蛋白质与脂质的结合点，也阻碍蛋白质与脂质的再结合，使蛋白质在水中溶解能力大大增加。丁醇提取法的p

9、H 及温度选择范围较广（pH310，温度-2至40）。国内用该法曾成功地提取了琥珀酸脱氢酶。3 膜蛋白的提取l 表面活性剂的利用：l 对于某些与脂质结合的蛋白质和酶，也有采用表面活性剂如胆酸盐及十二烷l 基磺酸钠等处理。表面活性剂有阴离子型（如脂肪酸盐、烷基苯磺酸盐及胆酸盐等），阳离子型（如氧化苄烷基二甲基铵等）及非离子型（Triton X-100 、 NP-40等 ）、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。非离子型表面活性剂比离子型温和，不易引起酶失活，使用较多。对于膜结构上的脂蛋白和结构，己广泛采用胆酸盐处理，两者形成复合物，并带上净电荷，由于电荷再排斥作用

10、使膜破裂。近年来研究膜蛋白使用表面活性剂的稀溶液提取时，较喜欢用非离子型表面活性剂。l 膜蛋白提取注意事项 常用去垢剂：SDS Tween 20 40 80 Triton X-100 CHAPS总之，只要能溶解在水溶液中而与细胞颗粒结合不太紧密的蛋白质和酶，细胞破碎后选择适当的盐浓度及PH，一般是不难提取的。只有某些与细胞颗粒上的脂类物质结合较紧的，需采用有机溶剂或加入表面活性剂处理等方法提取。蛋白提取举例西南农业学报麻疯树种子-1，3葡聚糖酶粗酶提取条件的筛选选取优质种仁140 g，用300 mL 5 mmol/L 磷酸缓冲液(PBS)(含02 mol/L 的NaCI，pH 72)浸泡过夜。

11、匀浆后磁力搅拌4 h，高速离心(12 000 rmin，4 ，20min)，八层纱布过滤以去油脂，得第一次抽提液和残渣。在残渣中加300 mL PBS进行第二次抽提。将两次抽提液合并，共700 mL西南农业学报2002年【5卷1期高梁根质膜的纯化和膜蛋白的提取1质膜的分离和纯化2膜蛋白的增溶将两相法得到的质膜悬浮于含有25 mmolNaCl，05 mmolL 乙二胺四乙酸,02mmolL DTT，100 mmolL 蔗糖，1 mmol/L 巯基乙醇以及20 mmolL Tris HCl(pH7.6)的缓冲液中，使蛋白质含量为25mgml ，加CHAPS，此时CHAPS：蛋白质=2：1 冰浴中搅

12、拌2h后，提取液在4 下lO0000g离心45min，弃沉淀，上清液含溶解的膜蛋白。乙醇提取玉米醇溶蛋白的生产工艺原料一80100目过筛一pH8,60% 乙醇浸泡提取一离心-提取液-调等电点PI-静置一湿产品一千操- 产品（沉淀-pH8，60% 乙醇浸泡萃取一离心-合并，弃残渣 ）三 蛋白质的基本操作 1盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析 分段盐析，有机溶液沉淀 目的 纯化 浓缩 保存 注意事项影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度

13、）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶解度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶解度最低。（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其

14、他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。 加入方式与搅拌2透析 主要用途3超滤主要用途 浓缩 除盐1超滤膜 Diaflo 超滤膜的分子量截留值中空纤维过滤器分离有机大分子物质、胶体、超微粒子、细菌等为主同，对深度降浊、澄清、除菌和大分子物质的浓缩等具有非常卓越的效果。离心超滤管4样品保存l 溶液状态 冷藏保存 冷冻保存 液氮保存l 干粉状态l 真空干燥 喷雾干燥 冰冻干燥 l 脱脂样品 丙酮干粉 四 蛋白质含量的测定 蛋白质 变性不溶解蛋白质 凯氏定氮法 图A “可溶”蛋白质（蛋白质溶液） 1 双缩脲法（Biuret a

15、ssay） 2 劳里反应（Lowry assay）Folin-酚法 3 巴福得测定法（Bradford assay ）标准曲线 4 UV(紫外分光光度)法 几种方法的比较Bradford protein assay Considerations for useThe Bradford assay is very fast and uses about the same amount of protein as the Lowry assay. It is fairly accurate and samples that are out of range can be retested with

16、in minutes. The Bradford is recommended for general use, especially for determining protein content of cell fractions and assessing protein concentrations for gel electrophoresis. PrincipleThe assay is based on the observation that the absorbance maximum for an acidic solution of Coomassie Brilliant

17、 Blue G-250 shifts from 465 nm to 595 nm when binding to protein occurs. Both hydrophobic and ionic interactions stabilize the anionic form of the dye, causing a visible color change. The assay is useful since the extinction coefficient of a dye-albumin complex solution is constant over a 10-fold co

18、ncentration range. 巴福得测定法的注意事项试剂的配制样品的成分标准曲线 ReagentsBradford reagent: Dissolve 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 in 50 ml 95% ethanol, add 100 ml 85% (w/v) phosphoric acid. Dilute to 1 liter when the dye has completely dissolved, and filter through Whatman #1 paper just before use几种方法的比较l Absor

19、bance assaysl Absorbance at 280 nm Range: 20 micrograms to 3 mg Volume: Depends on cuvette - volumes range from 200 microliters to 3 ml or greater Accuracy: Fair Convenience: Excellent, if equipment available Major interfering agents: Detergents, nucleic acids, particulates, lipid droplets ll Absorb

20、ance at 205 nm Range: Roughly 1 to 100 micrograms Volume: Depends on cuvette - volumes range from 200 microliters to 3 ml or greater Accuracy: Fair Convenience: Very good Major interfering agents: Detergents, nucleic acids, particulates, lipid droplets ll Colorimetric assaysl Modified Lowry Range: 2

21、 to 100 micrograms Volume: 1 ml (scale up for larger cuvettes) Accuracy: Good Convenience: Fair Major interfering agents: Strong acids, ammonium sulfate ll Biuret Range: 1 to 10 mg Volume: 5 ml (scale down for smaller cuvettes) Accuracy: Good Convenience: Good Major interfering agents: Ammonium salt

22、s ll Bradford assay Range: 1 to 20 micrograms (micro assay); 20 to 200micrograms (macro assay) Volume: 1 ml (micro); 5.5 ml (macro) Accuracy: Good Convenience: Excellent Major interfering agents: None 针对核酸的操作一般要注意的问题基本要求：尽量保持被分离核酸的完整性，除去影响下步操作的物物质。 高分子量的DNA（核DNA） 操作主要注意的是它易被机械 切割力 破坏 RNA操作的主要障碍是“无处不

23、在”的RNA酶的降解一般要注意的问题： DNA：WORKING WITH DNA RNA：RNA 操作注意事项与实验技巧 l STORAGE.l The following properties of reagents and conditions are important considerations in processing and storing DNA and RNA. Heavy metals promote phosphodiester breakage. EDTA is an excellent heavy metal chelator. Free radicals are

24、formed from chemical breakdown and radiation and they cause phosphodiester breakage. UV light at 260 nm causes a variety of lesions, including thymine dimers and crosslinks. Biological activity is rapidly lost. 320 nm irradiation can also cause crosslinks, but less efficiently. Ethidium bromide caus

25、es photooxidation of DNA with visible light and molecular oxygen. Oxidation products can cause phosphodiester breakage. If no heavy metal are present, ethanol does not damage DNA. Nucleases are found on human skin; therefore, avoid direct or indirect contact between nucleic acids and fingers. Most D

26、Nases are not very stable; however, many RNases are very stable and can adsorb to glass or plastic and remain active. 5oC is one of the best and simplest conditions for storing DNA. -20oC: this temperature causes extensive single and double strand breaks. -70oC is probable excellent for long-term st

27、orage. For long-term storage of DNA, it is best to store in high salt (1M) in the presence of high EDTA (10mM) at pH 8.5. Storage of DNA in buoyant CsCl with ethidium bromide in the dark at 5oC is excellent. There is about one phosphodiester break per 200 kb of DNA per year. Storage of DNA in the ph

28、age is better than storing the pure DNA. Davis, R.W., D. Botstein and J.R. Roth, A Manual for Genetic Engineering: Advanced Bacterial Genetics. Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y. 1980. l QUANTITATION.l 1. Spectrophotometric. For pure solutions of DNA, the simplest method of qu

29、antitation is reading the absorbance at 260 nm where an OD of 1 in a 1 cm path length = 50 ug/ml for double-stranded DNA, 40 ug/ml for single-stranded DNA and RNA and 20-33 ug/ml for oligonucleotides. An absorbance ratio of 260 nm and 280 nm gives an estimate of the purity of the solution. Pure DNA

30、and RNA solutions have OD260/OD280 values of 1.8 and 2.0, respectively. This method is not useful for small quantities of DNA or RNA (1 ug/ml). 2. Ethidium bromide fluorescence. The amount of DNA is a solution is proportional to the fluorescence emitted by ethidium bromide in that solution. Dilution

31、s of an unknown DNA in the presence of 2 ug/ml ethidium bromide are compared to dilutions of a known amount of a standard DNA solutions spotted on an agarose gel or Saran Wrap or electrophoresed in an agarose gel. l RNA 操作注意事项与实验技巧ll 归根究底，RNA工作的主要问题是防止RNA酶的污染。RNA酶无处不在，在实验操作的任何一步，任何偶然的疏忽或不当操作都有可能造成RN

32、A酶污染，从而导致整个实验失败。因此，严格控制实验条件，避免任何可能的污染是保证实验成功的关键，必须做到以下几点：ll 1.如果可能，实验室应辟出专门RNA操作区，离心机、移液枪、试剂等均应专用。RNA操作区应保持清洁，并定期进行消毒。ll 2.操作过程中应自始至终佩戴抛弃式橡胶或乳胶手套，并 经常更换，以避免将手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带入试管或污染用具。尽量避免使用抛弃式塑料手套。塑料手套不贴身，常常造成操作不 便，而且多出部分还容易在器具上遭RNA酶污染并向未污染处传递，扩大污染。ll 3.尽量使用一次性枪头、离心管等塑料制品，尽量避免与 其它实验共享器具，以防止交叉

33、污染。推荐使用出厂前已经灭菌的枪头和离心管，大多国外厂商供应的无菌塑料制品很少有RNA酶污染，买来后可直接用于RNA 操作。许多研究者用DEPC等处理的塑料制品，往往由于二次污染而带有RNA酶，从而导致实验失败。ll 4.配制溶液用的酒精，异丙醇、Tris等应采用未开封的新品。溶液需用DEPC水配制（加0.01%(体积比)DEPC至重蒸水或Mili Q级水中，处理过夜，灭菌即成DEPC水）l 5.所有玻璃制品都必须在240烘烤4小时。所有旧塑料制品都必须用0.5M的NaOH处理10分钟，并用DEPC-H2O彻底冲洗后灭菌，也可考虑用 0.01%的DEPC水浸泡过夜，然后灭菌，烘干。无法用DEP

34、C处理的用具可以用氯仿擦拭若干次，这样通常可以消除RNA酶的活性。样本保存的注意事项：本一旦从生物体中分离后，细胞内的RNA就变得非常不稳定，容易降解。因此取样后，如何保证取样前后基因的表达模式不变，就变得非常重要。传统方法是用液氮速冻，再放到超低温冰箱中保存。目前有些厂家开发出专门的RNA保护剂，如 Qiagen公司的RNAlater是具有抑制RNase和稳定RNA作用的试剂，将采集的组织样本等直接放入到RNAlater中，即可起到稳定样本中 RNA的作用。无需液氮或干冰，方便安全地在室温下保存一段时间，低温可长期保存。还有对细菌样本专用的RNAprotect Bacteria Reagen

35、t及对血液样本专用的PAXgene Blood RNA System核酸提取分离纯化的基本操作细胞和组织的破粹 基因组（核）DNA的提取 酶处理酚-氯仿抽提 质粒的提取 乙醇沉淀 菌株的培养梯度离心 碱裂解法 煮沸法碱变性和复性 柱纯化、分级分离 核酸的检测和定量分析电泳及分析 细胞和组织的破粹l 基因组DNA的提取主要过程l 材料细胞破粹 分散的动物细胞 直接用裂解buffer处理l 动物组织，小昆虫，植物，真菌等 在液氮环境中研磨成粉再用裂解buffer处理l 细菌可先用溶菌酶处理在用裂解buffer处理l 裂解buffer一般含l 51%的SDS或十二烷基肌胺酸钠l 蛋白酶K 100ug

36、/mll EDTA Tris-HCll 蛋白质的除去： 用裂解buffer温育，5055度 124 溶液会变清 核蛋白水解l 酚-氯仿抽提：很温和混匀 -离心l 核酸沉淀： 乙醇、正丁醇沉淀 通常加1/10体积的3M NaAC以减少杂质l RNA的除去： 用没有DNA酶活性的RNA酶溶液温育，再用乙醇沉淀 。 l 主要注意事项：记住处理的大片段DNA，操作尽可能温和，不能剧烈震荡，不用细口吸管，不要吸的太快。酚-氯仿抽提乙醇沉淀梯度离心碱变性和复性质粒菌株的培养碱裂解法l 菌体的裂解 0.2M NaOH 1%SDSl 快速中和 3M KAc-HAc 离心l 蛋白的除去 酚-氯仿抽提 离心l D

37、NA乙醇沉淀 离心l 70%乙醇洗涤l 干燥l 碱裂解的原理：碱裂解抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性和复性的差异而达到分离目的。在碱性条件下，线性大分子细菌染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构互补链变性解开。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离。当用pH4.8的NaAc高盐缓冲液调其pH值至中性，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中为可溶状态。而染色体DNA不能复性，形成缠连的网状结构。通过离心将细胞碎片，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来被除去，质粒DNA则存在于上清中。碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。克隆的一些基本概念