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1、目 录第一章 疟原虫生活史一、概述二、人体内发育三、蚊体内的发育第二章 疟原虫镜下形态一、薄血膜中疟原虫形态二、厚血膜中疟原虫形态第三章 显微镜使用及维护一、显微镜的构造二、显微镜使用 三、使用注意事项四、显微镜的维护保养第四章 血片制作与染色一、血片制作二、血膜的染色第五章 疟原虫镜检技术一、血液二、血液中各种正常细胞形态三、薄血膜镜检四、厚血膜镜检五、杂质与疟原虫的鉴别六、疟原虫计数附录：疟原虫图谱39第一章 疟原虫生活史一、概述疟原虫是疟疾的病原体。疟原虫为单细胞真核生物，属原生动物亚界顶端复合物门、孢子纲、真球虫目、疟原虫科、疟原虫属。人体疟原虫有4种：间日疟原虫（Plasmodium
2、 vivax）、恶性疟原虫(P.falciparum)、三日疟原虫(P.malariae)和卵形疟原虫(P.ovale)，依次引起间日疟、恶性疟、三日疟和卵形疟。在我国间日疟较常见，恶性疟次之，但对人体危害较间日疟严重，三日疟偶尔发现，卵形疟已无病例报告。4种人体疟原虫的生物学特征见表1-1。疟原虫的发育和繁殖，必须通过脊椎动物与昆虫媒介两个宿主，人体疟原虫的宿主是人和按蚊。疟原虫在人体分别寄生于肝实质细胞和血液中的红细胞内，在蚊体内则寄生于蚊胃，最后积聚于唾腺。4种人体疟原虫的生活史基本相同，包括在人体内的红细胞外期和红细胞内期以及在蚊体内的配子生殖和孢子增殖两个阶段。二、人体内发育疟原虫在
3、人体内的发育分成肝细胞内的发育和红细胞内的发育两个阶段。（一） 红细胞外期按蚊吸人血时，按蚊唾腺中的子孢子随唾液进入人体的末梢血液中，在30分钟内，随血流进入肝脏，在肝实质细胞内发育，进行裂体增殖，此时期称红细胞外期（简称红外期）或肝细胞期（简称肝期），此时期的疟原虫称肝期裂殖体。成熟肝期裂殖体直径为4560mm，内含数以万计的肝期裂殖子。肝期裂殖体成熟致使肝细胞破裂，肝期裂殖子释入血液。不同种疟原虫的此期所需时间不同，从612天不等。间日疟原虫的红外期裂体增殖较为复杂。目前认为间日疟原虫的子孢子在遗传学上具有两种不同的类型，即速发型子孢子和迟发型子孢子。速发型子孢子侵入肝细胞后，遂开始红外期
4、裂体增殖，释放出肝期裂殖子侵入红细胞，经裂体增殖引起临床发作。迟发型子孢子侵入肝细胞后暂不继续发育，处于休眠状态（休眠体），经过一段休眠期后，再发育成为成熟的红外期裂殖体，释放出肝期裂殖子侵入红细胞引起复发。恶性疟原虫和三日疟原虫无迟发型子孢子，因而恶性疟和三日疟也无复发现象（二）红细胞内期 红外期裂殖子从肝细胞释放出来进入血液后，一部分被吞噬细胞消灭，一部分在数分钟后侵入红细胞并开始发育，进行裂体增殖，这个时期称为红细胞内期(简称红内期)。裂殖子进入红细胞后，其细胞质内出现一个较大的空泡，最初为圆形，细胞质少，围绕着空泡，细胞核在虫体的一侧，颇似戒指的宝石，发育成早期滋养体（亦称环状体）。以
5、后逐渐发育，虫体和细胞核都渐渐增大，细胞质增多，并分解血红蛋白产生疟色素，其色泽、形状有种的差别，此时的疟原虫称为晚期滋养体（亦称大滋养体），因其细胞质向外伸出不规则的伪足，能呈阿米巴样运动，也称为阿米巴样体。恶性疟原虫的环状体，在外周血液中经十几个小时的发育，逐渐隐匿在微血管、血窦或其他血流缓慢处，发育成大滋养体及裂殖体，因此在外周血液中很难看到这两个时期。疟原虫由小滋养体发育成大滋养体的时间间日疟约须8-10个小时，恶性疟原虫10余个小时。大滋养体发育成熟后虫体变圆，胞质内的空泡消失，核开始分裂，逐渐发育成为成熟裂殖体。成熟裂殖体的每个核被一份胞质包绕，核的数量因不同虫种而异，一般为832
6、个，称为裂殖子。裂殖体成熟后，被寄生的红细胞破裂，释放出裂殖子。破裂的红细胞碎片、裂殖子和疟色素等进入血液，引起疟疾临床发作。一部分裂殖子被巨噬细胞吞食，一部分裂殖子再侵入正常红细胞，开始新一轮的红内期发育，如此循环往复，称为裂体增殖周期。红内期发育成熟的时间，因不同虫种而异，间日疟原虫和卵形疟原虫为48小时，恶性疟原虫为2438小时，三日疟原虫为72小时，产生相应的间日发热和三日发热等不同发热周期。红细胞内的疟原虫经过数次裂体增殖后，部分侵入红细胞的裂殖子不再进行核分裂，而逐渐发育成为雌、雄配子体，或称大、小配子体，这是疟原虫有性生殖的开始。成熟的雌、雄配子体被雌性按蚊吸入后，便在蚊胃内进行
7、有性生殖。疟原虫的生活史参见图1-1。三、蚊体内的发育在按蚊叮吸携带有雌、雄配子体的人血时，红内期疟原虫进入蚊胃，但只有雌、雄配子体能在蚊体内发育和繁殖，其余各期均被消化。雌、雄配子体在蚊体内的发育和繁殖，包括配子生殖和孢子增殖两个期。（一）配子生殖在蚊胃内，雌配子体的核经过减数分裂，形成圆形不活动的雌配子。雄配子体的核分裂成48个，细胞浆伸出鞭毛状细丝，每1细胞核进入一条鞭毛状细丝内，形成雄配子。雄配子游近雌配子，雌、雄配子结合形成圆形的合子，并进一步发育成长形能蠕动的动合子。动合子穿过蚊胃壁的上皮细胞，停留于上皮细胞和弹性纤维膜之间，发育成卵囊。此时约为吸血后的第2472小时。（二）孢子增
8、殖在卵囊内核反复分裂，形成许多梭状子孢子。蚊胃壁上的卵囊可有数个到数十个或上百个，一个发育成熟的卵囊内可有1 000到10 000个子孢子。疟原虫在蚊体内发育时间的长短与温度和湿度有关，室温2426，相对湿度7580，是蚊体内疟原虫孢子生殖最适宜的条件。气温低于16或高于30时，发育变慢，并退化变性，直至死亡。成熟子孢子通过卵囊的微孔逸出或卵囊破裂后扩散入血腔，最后聚集于唾腺内。当含子孢子的雌蚊吸血时，子孢子随唾液进入人体，疟原虫开始其在人体内的发育过程。表1 4种人体疟原虫的生物学特征恶性疟原虫间日疟原虫卵形疟原虫三日疟原虫红外期发育天数58914-15休眠体无有有无红外期裂殖子数30000
9、100001500015000裂体增殖周期（小时）36-48484872寄生的红细胞特征幼红细胞Duffy阳性网织红细胞和幼红细胞网织红细胞和幼红细胞正常红细胞红细胞胀大无明显胀大略胀大无红细胞斑点茂氏点薛氏点薛氏点齐氏点疟色素黄褐色棕黄色棕黄色深褐色红内期裂殖子数8-2612-246-126-12配子体新月/腊肠形圆形圆形圆形蚊内发育天数108-912-1414-15卵囊内疟色素链状和条状皇冠羽毛状交叉线聚集于边缘图1-1疟原虫的生活史第二章 疟原虫镜下形态采患者的血液制作涂片并染色后，可以在显微镜下观察到疟原虫形态。常用的血涂片有两种：一种是借推片将血液薄薄地涂在载玻片上，使每个红细胞平铺
10、在玻片上，称薄血膜，因薄血膜血液干燥快，原虫形态极少变形，多用于以观察疟原虫形态与鉴别虫种；另一种是把较多的血液涂成圆形，血膜中血细胞重叠，原虫较为集中，称为厚血膜。厚血膜涂布面积小，阳性检出率高，厚血膜的镜检效率比薄血膜约高六倍。现常用的一张载玻片上同时做厚薄血膜各一，厚血膜用来检查，薄血膜供编号和鉴别虫种用。一、薄血膜中疟原虫形态薄血膜涂制均匀时疟原虫着色良好，结构清晰，便于观察形态和鉴别虫种。薄血膜上各种红内期疟原虫的形态，见表2-1和图2-1核被寄生的红细胞胞浆空泡 薛氏小点疟色素核 表2-1 四种疟原虫薄血膜形态鉴别(吉氏染色)间日疟原虫恶性疟原虫三日疟原虫卵形疟原虫被寄生红细胞大小
11、形状胀大正常正常或缩小正常或稍胀大，卵圆形或边缘呈伞矢状颜色褪色正常或稍紫正常褪色斑点薛氏点出现稍晚，红色，细小数多茂氏点红色，粗大数少齐氏点淡红色，微细薛氏点出现较早粗大，数多小滋养体大小较大，约占红细胞直径的1/ 3小环状体较小，约占红细胞直径1/6, 大环状体与间日疟原虫相似中等中等核1个1或2个1个1个胞浆较薄小环状体纤细，大环状体与间日疟原虫相似较粗厚较粗厚色素无无偶见细小褐色颗粒无大滋养体大小较大较小较小较小核多见1个1或2个1个1个胞浆阿米巴样，常含空泡圆形，空泡不显著带状，空泡不显著圆形，空泡不显著色素黄褐色，细小，杆状，散在分布黄褐色，细小，结成团块后，呈黑褐色深褐色，粗大，
12、沿边缘分布棕黄色，较粗大未成熟裂殖体大小较大较小较小较小核2个以上2个以上2个以上2个以上胞浆圆形或不规则，空泡消失圆形，空泡消失圆形，空泡消失圆形或卵圆形，空泡消失色素黄褐色，分布不匀黑褐色团块状深褐色，分布不匀棕黄色，分布不匀成熟裂殖体大小大于正常红细胞小于正常红细胞小于正常红细胞小于正常红细胞裂殖子1224个，常为1618个，排列不规则，较大826个，常为818个，排列不规则，较小612个，常为8个，常排列如菊花状，较大614个，常为8个，排列不规则，较大色素黄褐色，常聚集一侧黑褐色团块深褐色，常聚集中央棕黄色，聚集中央或一侧雌配子体大小形状大于正常红细胞，圆形较大，新月形，两端尖锐小于
13、正常红细胞，园形小于正常红细胞，圆形核1个，较小，深红色，位于一侧1个，较小，深红色，位于中央1个，较小，深红色，位于一侧1个，较小，深红色，位于一侧胞浆深蓝色深蓝色深蓝色深蓝色色素黄褐色，均匀散在黑褐色，紧密分布于核周围深褐色，均匀散在棕黄色，散在雄配子体大小形状大于正常红细胞，园形较大，腊肠形，两端钝园小于正常红细胞，圆形小于正常红细胞，圆形核1个，较大，淡红色，位于中央1个，较大，淡红色，位于中央1个，较大，淡红色，位于中央1个，较大，淡红色，位于中央胞浆浅蓝色浅蓝色或淡红色浅蓝色浅蓝色色素黄褐色，均匀散在黑褐色，松散分布于核周围深褐色，均匀散在棕黄色，散在 二、厚血膜中疟原虫形态厚血膜
14、由于用血量多，细胞重叠，干燥缓慢，以致虫体皱缩，空泡消失，胞质变形，加之红细胞溶解，所以虫种和虫体的鉴别比薄血膜困难。厚血膜中4种疟原虫形态鉴别要点，见表2-2表2-2 四种疟原虫厚血膜形态鉴别(吉氏染色)间日疟原虫恶性疟原虫三日疟原虫卵形疟原虫小滋养体较大。核1个，较大，胞浆较厚。常呈！或，状较小。核12个，较小，胞浆纤细。常呈！、飞鸟、和断环状中等。核1个，较大，胞浆粗厚。常呈 环状或鸟眼状大小与间日疟原虫相似，胞浆致密，核较大。大滋养体较大。呈阿米巴样，形状不规则。核位于胞浆之中或外边，胞浆常缩成圆形或断裂成数块。色素分布不匀较小。常呈圆形，色素细小或结成12个团块中等。常呈圆形，色素粗
15、大大小与间日疟原虫相似，胞浆呈深蓝色，核较大裂殖体较大。裂殖子1224个。裂殖子较大较小。裂殖子826个。裂殖子较小较小。612个。裂殖子大于间日疟原虫裂殖体大小与间日疟原虫相似，裂殖子614个，核较大配子体较大。圆形，色素粗大。雌配子体较大，核小，胞浆深蓝色，雄配子体较小，核大，胞浆浅蓝色雌配子体新月形，雄配子体腊肠形与间日疟原虫相似，但较小。色素较粗大卵圆形，大小与间日疟原虫相似， 雌配子体核致密，偏于一侧，雄配子体核疏松色素黄褐色，细小。杆状，或结成粗大颗粒。分布不匀黄褐色，颗粒细小，结成团块后，呈黑褐色。配子体色素粗大，分布于核周围有时小滋养体可见色素，深褐色，较粗大。沿边分布色素颗粒
16、较大，呈深棕色，分布弥散被寄生红细胞常见红细胞“影子”和薛氏点可见红细胞“影子”和茂氏点可见红细胞“影子”小滋养体时即可见薛氏点其他常可查到各阶段的疟原虫仅见小滋养体(或)和配子体。一般不见大滋养体和裂殖体常可查到各阶段疟原虫常可查到各阶段疟原虫图2-1 间日疟原虫形态图2-2 恶性疟原虫形态图2-3三日疟原虫形态图2-4卵形疟原虫形态第三章 显微镜使用及维护 发热病人血涂片的显微镜检查（简称发热病人血检）是疟疾控制和检测的重要手段，因此掌握显微镜的使用方法和日常维护是十分必要的。一、显微镜的构造 显微镜通常有4个部分组成：A.支撑系统；B.放大系统；C.照明系统；D.调节系统；见图3-1。
17、图3-1 显微镜的构造（）支撑系统：1，镜座；2，镜臂；3，镜头座；4，载物台；5，持片夹（图3-2）。图3-2 显微镜支撑系统（）放大系统：1、目镜：放大尺寸为10倍（图3-3）；图3-3 显微镜目镜2、物镜：放大倍数分别为10倍、40倍、100倍，在使用100倍时需要使用镜油（图3-4）。图3-4 显微镜物镜（C）照明系统：1，反光镜；2，聚光器；3，光圈；固定在聚光器内，它可以调节通过聚光器的光线的强弱（彩图3-5）。图3-5 显微镜照明系统D）调节系统：1，粗对焦螺旋；2，细对焦螺旋：缓慢移动观察物用以精确调节；3，光圈调节杠杆；4，持片夹：控制玻片向前向后向左向右移动。二、显微镜使用
18、 （一） 使用环境与工作习惯显微镜的工作场所应当清洁、干燥、无震动、无腐蚀性气体存在。台面和凳子的高度要适当。镜检时，即便用单目显微镜，也须两眼同时睁开。（二）聚光器及可变光阑的用法 一般的聚光镜，在平行光照射的情况下，其焦点落在它上端透镜平面中心上方约1.25mm处。当使用高倍或油镜时，由于放大率大，镜像亮度小，需要较强的照明。因此，应把聚光器升至最高，以便使聚光镜的焦点正好落在标本平面上。但在使用低倍镜时，可将聚光器适当下降。 可变光阑一是控制射向标本的光通量；二是改变聚光器的数值孔径。在这两个作用中，后者是主要的。为了使物镜的分辨率得到充分的利用，从原则上说，聚光器的数值孔径应与物镜的相
19、同。否则，分辨率或清晰度就要下降。 （三）物镜的正确调焦 对光完成后，升高镜筒，将标本玻片夹在移动器上，并将欲检查的部分移至载物台通光孔的中央，然后开始调焦。 无论作何种检查，均应从低倍镜开始。调焦时，先用粗动手轮将镜筒下降，使低倍镜的前透镜与盖玻片之间的距离略缩小于该物镜的工作距离（5mm以下）。为了避免物镜压在载玻片上，可从侧面窥视。然后，一边从目镜中观察视野，一边利用粗动手轮将镜筒徐徐上升，待初见物像后，改用微动手轮作精细调焦，直至物像最清晰为止。低倍物镜的视场大，有利于观察标本的全貌。从低倍镜转换为高倍镜时，如果物镜是显微镜的原配物镜，所用的载玻片、盖玻片有符合标准，一般都可以进行等高
20、转换。即转换后，只要稍微调节一下微调旋钮，即可看到清晰的图像。但油镜不强求齐焦，最好先将镜筒升高后再转换，最后按低倍镜的调焦方法重新调焦。用油镜观察时，要先将物镜移开，在要观察的部位加一滴香柏油，然后将油镜放正，并慢慢转动粗调节器，降下镜筒，使镜头浸入油滴中。可下降至几乎与制片接触，但切不可压及玻片。然后，向上微微转动粗调节器，使镜筒上升，当视野中出现有模糊的影像时，改用细调节器向上转到直至影像清晰为止。在使用油镜时，在聚光镜与标本之间滴加浸油，可提高物镜的分辨率。在整个调焦过程中（尤其是高倍物镜和油镜的调焦），每个动作都要缓慢进行。否则，物像会一闪而过，找不到观察目标。 油镜使用完毕后，要及
21、时将浸油擦拭干净。镜头上可先用干净的擦镜纸擦干净即行。聚光镜的擦拭方法与此相同。 三、使用注意事项（一） 取出显微镜时，要用右手握住执手，左手托住镜座，小心地放到桌面上，不可单手拎着移动。（二）任何旋钮转动有困难时，绝不能用力过大，而应查明原因，排除障碍。如果自己不能解决时，要向专业人员请求解决。所有的镜头均经校验，请勿自行拆开。（三）保持显微镜的清洁，尽量避免灰尘落到镜头上，否则容易磨损镜头。同时要尽量避免试剂或溶液滴到显微镜上，特别是用高倍物镜观察时，镜头很容易被染料或试剂玷污，一旦被玷污，应立即用擦镜纸擦拭干净，油镜头还应使用清洁剂擦拭。由于光学玻璃比一般玻璃的硬度小，易于损伤。因此擦拭
22、光学透镜只能用专用的擦镜纸，不能用棉花、棉布或其它物品擦拭。擦时要先将擦镜纸折叠为几折，从一个方向轻轻擦拭镜头，每擦一次，擦镜纸就要折叠一次，以免沾在擦镜纸上的灰尘损伤透镜，使镜面出现一条条的划痕。（四）每次使用结束时，并光源调节器调至最小后关闭，并将物镜转成“八”字形垂于镜筒下，然后降下镜筒，避免物镜镜头下落时与聚光器相碰撞。显微镜应存放于阴凉干燥的地方，若放在潮湿处，一旦镜片上着生霉菌，就会腐蚀镜片，且很难除去。四、显微镜的维护保养（一） 防高热：显微镜是由精密的机械和光学镜头组成的，由于各种材料热膨胀系数不同，所以显微镜不能在阳光了曝晒，也不能放在靠近火炉和暖气的地方。只能室内存放，其工
23、作的温度范围一般为540。（二） 防潮：如果长期受潮，透镜很容易发霉，表面还会腐蚀，所以应在干燥环境下保存。在31时湿度不得大于80，温度每升高3摄氏度，相对湿度要设法降低10。（三） 防尘 ：灰尘不仅会影响成像质量，而且灰尘中往往也带有含酸、碱等腐蚀性的尘粒，容易腐蚀镜面。而硬度大的尘粒还可能在擦拭镜头时在镜面上划出伤痕，损坏镜头。此外，灰尘掉进机械活动部分时容易造成机械部分转动不灵活，甚至损坏。（四）防腐蚀：显微镜不能接触酸类和碱类物质。也不要与挥发性很强的化学药品及其它有害药品放在一起，以免腐蚀镜头。（五）防震：显微镜是精密仪器，剧烈的震动会造成精密度的降低。要轻拿轻放，搁置要平稳，使用
24、时动作应轻柔。（六）擦拭：.机械装置的擦拭:机械装置如有污渍，可用干净的柔软细布擦拭；如果擦不掉，可用擦镜纸或细绸布蘸点二甲苯擦拭。应注意不能用酒精、乙醚等化学品，以免腐蚀装置表面的油漆。光学镜头的擦拭：一般采用先吹，后刷，再擦拭的方法。吹，就是用吹气球(或用洗耳球)吹掉镜头表面的附着物。但不能用口直接吹气。吹不掉时，可用干净的专用清洁毛刷轻轻地刷。经上述两种方法处理后镜头表面仍有污物时，用擦镜纸稍蘸一点二甲苯或是专用清洁剂轻轻擦拭。如果发现镜头发霉长雾时，可用擦镜纸蘸少许无水酒精和乙醚的混合液擦拭，但液体不能太多，停留时间要短，以免渗入镜头内部造成腐蚀。 油镜头每次用过后要及时擦拭，先用干擦
25、镜纸擦一两次，把大部分介质油去掉，再用二甲苯滴湿擦镜纸擦两次，最后再用干擦镜纸擦一次。第四章 血片制作与染色一、血片制作（一）所需器材1、载玻片：玻片使用前应清洗。新玻片应先浸入有液态洗涤剂的清水中1020分钟，然后用干净棉巾逐个擦拭，再用清水冲洗干净，晾干，最后用干净、柔软的棉巾将玻片擦亮。用于特殊的目的时，最后可将玻片浸泡在95酒精中510分钟，再将玻片擦干擦亮。已用过的玻片应先浸泡于洗涤剂溶液中12天，或浸泡于煮沸的5肥皂水中12小时，再移到新配置的洗涤剂溶液中12小时，逐个擦去玻片上旧的血膜痕迹，用清水漂洗干净，再将玻片擦干擦亮。洗净的玻片每1020张用白纸包好放入塑料袋内，保存于干燥
26、环境中备用。2、采血针：使用一次性釆血针。3、玻片盒：为防止污染和苍蝇吸食血膜，新制作的血膜应放在玻片盒中，厚血膜放置时要保持水平，直到充分干燥。4、75酒精棉球：用于采血前后的消毒。5、记号笔或铅笔：用于玻片上书写号码。（二）采血部位及取血方法采血部位以耳垂较为合适，也可在手指末端采血，婴儿可从拇趾或足跟取血。先用75酒精棉球消毒取血部位后，以一次性采血针迅速刺入取血部位12mm深，然后用左手大拇指、食指和右手中指协同挤出血滴。（三）涂制血膜取玻片2张，1张作载片，1张作推片（具有光滑边缘）。用右手拇指和食指夹持推片侧缘中部，用推片的左下角刮取血液45l，再用该端中部刮取血液11.5l。将左
27、下角的血滴涂于载片的中央偏右处，由里向外划圈涂成直径为0.81cm的圆形厚血膜（厚度以1个油镜视野内可见到510个白细胞为宜）。用干棉球抹净玻片角上的血渍，然后将推片下缘平抵载玻片的中线，当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持2535角，从右向左迅速向前推成舌状薄血膜，制成的薄血膜应在玻片上形成平铺的血细胞，细胞之间互相接触而不相互重叠。每张载玻片上分别做1个薄血膜，1个厚血膜。标准血膜的位置如图4-1所示。取干净玻片及推片各一张，用右手大拇指和食指夹持推片侧缘中部，用推片的左下角刮取血液45l（约火柴头大小），再用该端中部刮取血液11.5l。将左下角的血滴涂于载片的中
28、央偏右，由里向外划圈涂成直径为0.81cm的圆形厚血膜（厚血膜的厚度以一个油镜视野内可见到510个白细胞为宜）。用干棉球抹净角上的血渍，然后将推片下缘平抵载玻片的中线，当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持2535角，从右向左迅速向前推成舌状薄血膜。薄血膜 厚血膜 标记处图4-1（四）血膜的保存血膜制成后，立即将受检者号码写在玻片上，血膜朝下插入直竖的标本盒内，让血膜自然干燥后才能染色。吉氏染色时薄血膜在染色前须经甲醇固定，而厚血膜在染色前必须溶血，但新制作的厚血膜也可直接染色。血膜放置时间，夏天不宜超过48小时，冬天不宜超过72小时，否则厚血膜会自然固定而不能溶血，影
29、响镜检。不能及时染色的血膜，可先用甲醇固定薄血膜，将厚血膜溶血，晾干后包好，放入干燥器中，置于冰箱内保存。临用时，将干燥器放置室温中12小时后取出血片。二、血膜的染色（一） 染色液的制备 目前常用的血膜染剂有吉氏和瑞氏两种。吉氏染剂不仅适用于厚血膜和批量血膜的染色，而且效果稳定，染色时间和染液浓度对染色结果影响较小，染色后的血膜保存时间较长，同时吉氏染剂能长期保存而不变质，染色技术也易掌握，被推荐使用。吉氏粉 5g，甲醇250ml，甘油250ml。将吉氏粉置于研钵中，加入少量甘油充分研磨，边加边磨，至甘油加完为止，倒入500ml有塞玻璃瓶中。在研钵中加入少量甲醇，洗掉剩余部分，倒入瓶内，再次加
30、甲醇，洗后再倒入瓶中，至甲醇洗净研钵为止。塞紧瓶塞，充分摇匀，室温内放置，每天用力摇动溶液5分钟，3天后即可使用。另一种方法是在带有紧口瓶塞的硬质玻璃瓶中放入约50个玻璃珠（直径35mm）。用玻璃漏斗把甘油灌入瓶中，把吉氏粉放入漏斗中，用甲醇缓慢地把所有染料粉冲入瓶内，将瓶塞塞紧，置于室温内，每天用力摇动5分钟，3天后即可使用，保存时间长则更好。（二）染色用水常用的染液的稀释用水和染色的冲洗用水，是中性的蒸馏水或经煮沸过滤的冷开水，也可用井水、河水、泉水或雨水。为了使血膜着色较好，应用pH7.07.2水效果最佳。为此，可配制缓冲液用于染液的稀释和染色后的冲洗。配制pH6.67.4缓冲液时，先制
31、备好两种贮备液。贮备液为每1 000ml蒸馏水含9.5g 磷酸氢二钠，贮备液为每1 000ml蒸馏水含9.07g 磷酸二氢钾。配制pH6.67.4的缓冲液时，将两种贮备液按一定比例混合后，用蒸馏水稀释成各种浓度的溶液。两种贮备液的用量见表4-1。表4-1 配制pH6.67.4缓冲液两种贮备液用量表pH溶液溶液ml磷酸氢二钠含量(g)ml磷酸二氢钾含量(g)6.654.70.52148.81.356.868.40.65126.81.157.089.50.8599.20.907.196.80.9288.20.807.2105.01.0077.20.707.4126.31.2055.10.50注：用
32、于薄血膜的染色和一般漂洗时，用蒸馏水稀释至1 000ml，用于厚血膜及同一张玻片上厚血膜与薄血膜的染色时，用蒸馏水稀释至500ml。（三）吉氏染色方法染色前薄血膜要用甲醇或无水乙醇固定，厚血膜用蒸馏水或清水溶血。单张血膜染色可取蒸馏水或缓冲液1ml加入吉氏染液1滴，混合均匀后，滴在厚、薄血膜上，染色2030分钟，然后水洗、晾干。成批染色时，将血膜朝一个方向插入染色缸中，或每对玻片血膜朝外，背靠背插入染色缸中，倒入新配的2吉氏染液(2ml吉氏原液同98ml蒸馏水缓冲液混匀），浸没厚薄血膜，染色30分钟后，向染色缸中注入缓冲液或自来水，直到溢出，除掉染液表面上的浮渣，将染色缸中残余的染液倾出，加入
33、新水，反复冲洗23次，取出玻片，将血膜朝下插在晾片板上干燥。染薄血膜时，染液浓度可稍高、时间稍长一些，而染厚血膜时，则染液浓度可稍低、时间稍短一些。当同一张玻片上厚血膜与薄血膜同时染色时，应按照厚血膜的染色方法，以免厚血膜过染而镜检困难。褪色或染色效果不佳时，可重新染色，先用二甲苯反复洗去血膜上的油迹，再用75酒精滴在厚、薄血膜上，用水反复冲洗数次，至厚血膜不见蓝色为止。取1ml蒸馏水加入1滴吉氏染液，混匀后滴在厚、薄血膜上，染色14小时（根据血片存放时间而定)。清水冲洗23分钟，加12滴75酒精于血膜上，12秒钟后用水冲洗，待干。（四）影响血膜染色质量的因素血片染色好坏，除与玻片的清洁程度、
34、血膜制作的质量和染色技术等有关外，还与下列因素有关:1、染剂和溶剂的质量：染料、甲醇和甘油如不纯，常使配成的染液偏酸或偏碱，影响染色效果。因此，必须用分析纯的甲醇和中性甘油，配制时所用器具必须干净无水。新配制的染液应先试染，以酸碱度最适宜的水稀释，观察染色是否理想，否则需重新制备染液。2、染液的新旧：新配制的染液，一般染色力较弱，且常呈碱性。染液放置时间稍长，染色力逐渐增加，故应在染色前12周先将染液制备好。盛染液的瓶子应密封，以免影响染液质量。3、染液的稀释浓度：染液浓度高，着色快，各种细胞着色深，薛氏点、茂氏点等粗大显著；染液浓度低，着色慢，但各种细胞内部结构着色均匀、清晰，如环状体、子孢
35、子及疟色素等颜色分明，但薛氏点、茂氏点不够清楚。染液稀释后，一般在半小时内使用，时间太长也会影响染色效果。4、染色时间：染色时间长，染色效果好，反之则差。染色时间长短与温度有关，温度高着色快，故染色时间可适当缩短，温度低染色慢，则时间可适当延长。所以染色时间长短要随着染液的质量、新旧、浓度及温度而决定。5、稀释和冲洗用水：为使厚、薄血膜着色好，应使稀释的染液呈中性或稍偏碱性，故应用pH7.07.2的水稀释。当染色太蓝，可用pH较低的缓冲水冲洗；如染色太红，则用pH较高的缓冲液冲洗；如染色太深，可延长冲洗时间，予以校正。6、冲洗方法：染色后不要直接将染液倒掉，应将玻片连同染液一起放在水中漂洗，或
36、沿玻片及染色缸边缘加水使染液表层溢出，并轻轻冲洗，以免染液色素颗粒玷污血膜。如果你染色的质量不高应该做些什么？首先，检查每一个技术步骤是否合理如果血涂片、固定、稀释染液，清洗染液器具以及储存各项操作都符合要求，你依然得不到合格的染色后的血片。那么很可能是水的质量不过关（PH值不合适）或者吉氏原液自身质量不过关。有时候仅仅是一些片子的染色不理想，这种情况下，可以重新涂片。如果情况不允许，你可以重新染色。第五章 疟原虫镜检技术疟原虫镜检时，首先须对正常薄厚血膜中各种细胞的形态、内部结构和染色性质加以识别。这样在阳性血膜中才能及时正确诊断并判断疟原虫的虫种和各期形态。一、血液血液由血浆和血细胞组成。
37、从血管取少量血液加入适量抗凝剂（如枸橼酸钠）经自然沉降或离心沉淀后，血液可分出三层：上层为淡黄色的血浆，下层为红细胞，中间的薄层为白细胞和血小板。血细胞约占血液容积的45%，包括红细胞、白细胞和血小板。在正常生理情况下，血细胞和血小板有一定的形态结构，并有相对稳定的数量。血细胞分类和计数的正常值如下： 红细胞350万550万个/l 中性粒细胞5070有粒白细胞嗜酸性粒细胞0.53 白细胞 （粒细胞） 嗜碱性粒细胞01血细胞400010000个/l 淋巴细胞2030无粒白细胞血小板 单核细胞3810万40万个/l 二、血液中各种正常细胞形态（一）红细胞：直径通常是6m8m；形状：人类的红细胞是双
38、面凹的圆饼状。边缘较厚，而中间较薄，就好像是一个甜甜圈一样，只是当中没有一个洞而已。这种形状可以最大限度的从周围摄取氧气。 图5-1 红细胞（二）白细胞：血液中的白细胞有五种，按照体积从小到大是：淋巴细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核细胞。1、淋巴细胞：占白细胞总数的2030，圆形或椭圆形，大小不等。直径68m的为小淋巴细胞， 912m的为中淋巴细胞， 1320m的为大淋巴细胞。小淋巴细胞数量最多，细胞核圆形，一侧常有小凹陷，染色质致密呈块状，着色深，核占细胞的大部，胞质很少，在核周成一窄缘，嗜碱性，染成蔚蓝色，含少量嗜天青颗粒。中淋巴细胞和大淋巴细胞的核椭圆形，染色质较疏松，
39、故着色较浅，胞质较多，胞质内也可见少量嗜天青颗粒。少数大、中淋巴细胞的核呈肾形，胞质内含有较多的大嗜天青颗粒，称为大颗粒淋巴细胞，见图5-2。图5-2淋巴细胞2、嗜碱性粒细胞呈圆形：数量最少，占白细胞总数的01%。细胞呈球形，直径1012m。胞核分叶或呈S形或不规则形，着色较浅。胞质内含有嗜碱性颗粒，大小不等，分布不均，染成蓝紫色，可覆盖在核上（图53）。图5-3嗜碱性粒细胞3、嗜酸性粒细胞：占白细胞总数的0.53。细胞呈球形，直径1015m，核常为23叶，呈眼镜状，深紫色，胞质内充满粗大（直径0.51.0m）、均匀、略带折光性的嗜酸性颗粒，染成桔红色（图54）。通常有嗜酸性粒细胞容易破碎，颗
40、粒可分散于细胞周围。嗜酸性粒细胞也能作变形运动，并具有趋化性。它能吞噬抗原抗体复合物，释放组胺酶灭活组胺，从而减弱过敏反应。嗜酸性粒细胞还能借助抗体与某些寄生虫表面结合，释放颗粒内物质，杀灭寄生虫。故而嗜酸性粒细胞具有抗过敏和抗寄生虫作用。在过敏性疾病或寄生虫病时，血液中嗜酸性粒细胞增多。它在血液中一般仅停留数小时，在组织中可存活812天。图5-4 嗜酸性粒细胞4、中性粒细胞：中性粒细胞占白细胞总数的5070，是白细胞中数量最多的一种。细胞呈球形，直径1012m，核染色质呈团块状。核的形态多样，有的呈腊肠状，称杆状核；有的呈分叶状，叶间有细丝相连，称分叶核。细胞核一般为25叶，正常人以23叶者
41、居多。中性粒细胞的胞质染成粉红色，含有许多细小的淡紫色及淡红色颗粒，颗粒可分为嗜天青颗粒和特殊颗粒两种。嗜天青颗粒较少，呈紫色，约占颗粒总数的 20%，光镜下着色略深，体积较大。中性粒细胞在血液中停留约67小时，在组织中存活约13天。图5-5中性粒细胞5、单核细胞：占白细胞总数的38。它是白细胞中体积最大的细胞。直径1420m，呈圆形或椭圆形。胞核形态多样，呈卵圆形、肾形、马蹄形或不规则形等。核常偏位，染色质颗粒细而松散，故着色较浅。胞质较多，呈弱嗜碱性，含有许多细小的嗜天青颗粒，使胞质染成深浅不匀的灰蓝色。颗粒内含有过氧化物酶、酸性磷酸酶、非特异性酯酶和溶菌酶，这些酶不仅与单核细胞的功能有关
42、，而且可作为与淋巴细胞的鉴别点。图5-6单核细胞（三）血小板：血小板或称血栓细胞, 正常数值为10万40万l。它是骨髓中巨核细胞胞质脱落下来的小块，故无细胞核，表面有完整的细胞膜。血小板体积甚小，直径24m，呈双凸扁盘状；当受到机械或化学刺激时，则伸出突起，呈不规则形。在血涂片中，血小板常呈多角形，聚集成群。血小板中央部分有着蓝紫色的颗粒，周边部呈均质浅蓝色（图57）。图5-7 血小板三、薄血膜镜检镜检疟原虫一般查厚血膜，薄血膜仅作为原虫分类时的参考和血片编号之用切记在只镜检薄血膜时不能得出阴性的结论。（一）各种疟原虫各期形态鉴别1、被寄生的红细胞形态大小及染色深浅度（是否褪色）；2、胞浆色彩
43、及其浓淡，结构疏密，有否空泡及不着色带，体积大小；3、色素斑点（薛氏点、茂氏点）；4、查其他各期形态是否存在作参考；5、色素颗粒的形态、颜色、排列。对于这一点应掌握，尤其是厚血膜更为重要。否则在形态鉴别上会混淆弄错。（二）疟色素颗粒鉴别1、与原虫在同一水平面；2、有立体感；3、色泽特殊，只有单色（色泽与背景色有关，须将视野放暗些）；4、形状如米粒状、沙粒状、颗粒状、短杆状，细粒可凝聚成堆。（三）大滋养体与大配子体的形态鉴别1、大滋养体：大小一般不超过被寄生的红细胞的3/4。核一个或延长呈带状，周围不着色带不明显。胞浆边缘不整齐，有时有空泡。在厚血膜上表现有活动性，故形态变化很大，胞浆收缩不均匀
44、，有时断裂成团块，疟色素分布凌乱。2、大配子体：大小几乎充满真个红细胞。核一个，较紧密，常偏于一侧，周围有一圈不染色带。胞浆边缘整齐，无空泡。疟色素平均散在分布。在厚血膜上则体形较小，胞浆收缩均匀，不染色带明显，疟色素分布规则则沿边分布。（四）裂殖子与血小板的形态鉴别1、血小板：由骨髓巨噬细胞成熟脱落后解离而成，因此结构松散，严格地说不是个完整细胞（无核）。在吉氏染色中多见显淡红色或淡紫色，中间颗粒为紫红色，形状近似石榴子，且边缘不甚光滑。2、裂殖子：由成熟裂殖体破裂逸出，以致类似血小板聚集一起，或单个、或三五成群，但形体较血小板小，直径0.7-1.8微米。核较大，相对的难见到胞浆，核染深红色
45、或紫红色，四周胞浆围绕，染蓝色，呈卵园形，边缘光滑。如附近查有疟色素颗粒是有力的佐证。四、厚血膜镜检厚血膜由于细胞重迭，干燥缓慢，以致虫体皱缩，空泡消失，胞质变形，加之红细胞被溶解，所以虫种和虫体的鉴别比薄血膜困难，但用血量多，疟原虫镜下密度高，因此检出率，常用于疟原虫检出。（一）检查方法1、在厚血膜上先滴香柏油一滴，用油镜（100）镜检。2、镜检时应从厚血膜上开始。从上而下，从左到右，在由右至左，这样往返一行接一行，一个视野接一个视野顺序的查完整个血膜。（二）鉴别要点1、在厚膜中必须根据疟原虫的核、胞浆、疟色素三个条件鉴别是否是疟原虫及何种虫种。在一般情况下，具备三条中的二条也能给以判定。2、有