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1、第19章 The Cell Cycle , DNA Replication and Mitosis一、 Mitosis(細胞分裂)細胞分裂是生物體生長和繁殖的基礎，由一個母細胞產生兩個或若干子細胞。原核細胞的分裂：細胞周期短，在適宜條件下可大量繁殖（如細菌每20分鐘就可分裂一次），其分裂方式為一分二或二分裂，習慣上又稱無絲分裂或直接分裂。真核生物的分裂：1. 有絲分裂不改變染色體的倍數。2. 減數分裂產生染色體倍數減半的生殖細胞，即配子，這是有性生殖的必要條件。 如果細胞分裂失去控制，會導致特定細胞團的增生、異常生長或腫瘤。嚴重的情況下發生惡性腫瘤，其中上皮組織來源的被稱為癌症。 Chroma
2、tin(染色質)：DNA複合物和蛋白質構成真核細胞的染色體，主要蛋白質成分是組蛋白。主要功能是：1. 為適應在細胞內的大小，縮成更小的體積。2. 加強DNA，讓在有絲分裂的DNA不受損。3. 控制基因表達和DNA複製。 原核細胞的DNA稱為genophore染色體（無染色）。有三個層次的染色質組織：1. DNA環繞形成核小體組蛋白“beads on a string (珠字符串)”結構（euchromatin(常染色質)）。2. 多組蛋白包裝成一個30 奈米纖維，組成核小體陣列中最緊湊的形式（heterochromatin(異染色質)）。3. 更高級別的30奈米纖維的中期染色體在有絲分裂和減數
3、分裂過程中 DNA包裝。Chromosome(染色體)：一捲曲DNA且含有許多基因、DNA結合蛋白質、調控元件和其他核苷酸序列。 中期真核細胞染色體的複製和濃縮。 （1）S期後的Chromatid(下方有解釋)，具有兩個相同部分。 （2）Centromere的兩個染色單體觸摸，並在其微管附著。 （3）短臂。 （4）長的手臂。Chromatid(染色單體)：存在染色體DNA內，細胞分裂的過程中，由一個著絲粒加入。 Mitotic spindle(有絲分裂的紡錘體)：微管將姐妹染色體引導分開。Sister chromatids/Daughter chromosome (姐妹染色單體)：這是兩個不同
4、的副本相同的染色體二倍體生物（如人類）的繼承，分別來自父母。包含相同的基因和相同的等位基因。姐妹染色單體的凝聚力：1. 修復受損的染色體之間的遺傳信息的正確分佈。2. 在S期中的缺陷可能導致非整倍體和癌症，特別是在檢查站(checkpoints)無法檢測到DNA損傷時會導致錯誤連接有絲分裂紡錘體。二、The cell cycle (細胞週期)間期：G1、S、G2期。M期：又稱有絲分裂，真核細胞將其細胞核中染色體分配到兩個子核之中的過程。早前期：兩個細胞核圓形物體是中心體，染色質正在凝聚。前期：摺疊後的染色體具有一對姐妹染色單體，兩染色單體之間以著絲粒相連。核膜裂解，微管進入核周圍並與相反極性微
5、管相互作用。中期：染色體在赤道板上排列。後期：姐妹染色單體分離為姊妹染色體末期：極性微管持續變長，細胞也隨之延長，對應的姊妹染色體分別被微管拉至細胞兩端。核膜前小膜泡在染色體表面結合併互相融合，逐漸形成完整核膜。染色體此時解旋成為染色質並被新核膜包裹。胞質分裂：高爾基體發出囊泡，將微管運輸至細胞中間，進而驅動細胞分裂成二。Interphas (間期)G1期：細胞周期中間期的一個階段，位於S期之前(9 hr)。1. 複製細胞器。2. 合成生長所需的糖、蛋白質和脂質，需要大量結構蛋白和酶。3. 大量合成蛋白質並提高代謝律。4. 受到生長因子、營養供應、溫度的限制。5. G1期暫停細胞周期，進入G0
6、期。6. 大部分哺乳動物細胞會進入G0期並在一些時刻重新進入S期。S期：細胞周期中DNA進行複製的時期。利用放射性標的(H3-thymidine)再用autoradiography*觀察S期的變化。G2期：細胞快速生長並大量合成有絲分裂所需蛋白質(4-6 hr)。 癌細胞可不經G2期而直接在DNA複製完成後進入有絲分裂。神經細胞與肌肉細胞不會再分裂。三、autoradiography (放射自顯影法)（一）原理將放射性核素標記的物質引入生物體或细胞，參與细胞的正常代谢過程，或連結到能與特異分子結合的探針上，利用放射性核素放出的射線去作用核子乳膠而顯像，從而達到對該放射性物質在組織或细胞内定位的
7、目的。1. 核子乳膠敏度，能精確地測定顯影顆粒的密度，離子射程和軌跡的擴散。2. 放射性核素放出的射線，在進行蛻變時主要放出三種射線，和射線。元素中有發射射線的核素如3H，32P，33P和35S等。（二）實驗方法 1. 放射性核素標記所要研究的大分子含有放射性核素，用來追蹤大分子物質 2. 樣品製備電鏡放射自顯影中的樣品製備過程與普通樣品製備技術相同。 3. 塗覆核子乳膠膜在帶有放射性核素的切片上覆蓋一層核子乳膠膜，然後進行自顯影過程。 4. 自顯影過程（曝光） 5. 顯影和定影 6. 基本實驗過程用大分子合成過程研究的放射自顯影技術： 同位素標記化合物注入動物體內取下器官或組織切片塗乳膠膜自
8、顯影顯影和定影染色觀察用於大分子定位研究的放射自顯影技術：組織固定包埋切片細胞化學反應塗乳膠膜自顯影顯影和定影染色觀察 同位素標記示踪化合物四、Flow cytometry application(流式細胞儀的應用)對懸液中的單細胞或其他生物粒子，通過檢測標記的螢光信號，逐一的細胞定量分析和分選的技術。可以檢測的參數：胞內抗原（各種細胞因子(cytokine)、次級媒介等）DNA（細胞周期分析、細胞動力學、細胞增殖等）染色體分析和分選（文庫構建、染色體塗染）細胞中的色素RNA細胞表面抗原（CD標記）細胞的體積和形態複雜程度蛋白質酵素活性細胞膜流動性細胞凋亡(apoptosis)監測細胞電通透性
9、流式細胞儀包括五個組成部分：1. 細胞流動系統：液流（鞘液(sheath fluid)）攜帶細胞，使顆粒以串流形式通過光束。2. 光源：有通常的燈（汞或氙）、高功率水冷的雷射源（氬、氪、染料雷射）、低功率氣冷雷射（氬(488nm)，紅氦氖(633nm)，綠氦氖，氦鎘(紫外)）、偶極雷射（藍、綠、紅、紫）。3. 檢測和模數轉換(analogue-to-digital conversion, ADC)系統：產生前散射、旁散射光和螢光的信號。4. 放大系統：線性或對數放大。5. 計算機：用於分析信號。癌細胞與牛樟芝結合。未加牛樟芝的癌細胞，G0/G1會減少，G2+M會增加。五、 Cell divis
10、ion(細胞分裂)1.CFSE染劑： (1)是一種可穿透細胞膜的螢光染料，具有與細胞特異性結合的琥珀醯亞胺脂基團和具有非 酶促水解作用的羥基螢光素二醋酸鹽基團，這使得CFSE成為一種良好的細胞標記物。 (2)具有細胞膜通透性：當CFSE以含有兩個乙酸基團和一個succinimidyl ester功能基團的 形式存在時，不具有熒光性質，而能夠自由進入細胞。 不具有膜通透性：而當其擴散進入細胞內環境，內源的酯酶可將其乙酸基團水解，此種 形式的CFSE分子具有很高的熒光活性，被激發能夠產生綠色熒光。 (3)當細胞進行分裂增殖時：具有熒光的胞質蛋白被平均分配到第二代細胞中，這樣與第一 代細胞相比，其熒
11、光強度便會減弱至一半；以此類推，分裂得到的第三代細胞的熒光強度 便會比第二代細胞再次減弱 。這種現象可以在488nm的激發光 下，採用流式細胞儀檢測分析，通過檢測到細胞螢光強度不斷的降低，進一步分析得出細胞分裂增殖的情況。2.有絲分裂（Mitosis）：指細胞核中的染色體發生複製，進而生成兩個細胞核，最後分裂成兩個細胞的過程。在細胞週期中，有絲分裂與細胞質分裂（cytokinesis）同歸於有絲分裂期（M期）之內。有絲分裂生成的兩個子細胞中，含有與母細胞相同倍數的遺傳物質。包括: 間期，前期，前中期，中期，後期，末期。A.間期(Interphase)：細胞核被核膜包圍住，且核仁可能會有兩個以上
12、在動物細胞中，每個中心體中含有兩個中心粒。有絲分裂則在細胞間期的早期，就是正複製一個染色體時，兩中心體就已經形成了。染色體在S phase已複製，還是鬆散的染色質，尚未可以分離。B.前期(Prophase):此時期細胞核內外都同時發生改變。細胞核中，核仁消失，染色體濃縮。細胞質中，兩中心體互相遠離，中間的纖維管拉長，形成初期的紡錘體。 Centrosome(中心粒): (1)與核相鄰接的粒狀物質(靠近核的非膜胞器組成(有9束三微管(93)(2)一個微管組織中心(microtubule organizing center):微管(microtubule)被連接及固定並進組裝的區域(如:中心體星體
13、、紡錘絲的形成、基體鞭毛、纖毛的形成)(3)在S phase期間被複製。(4)在有絲分裂或減數分裂過程中參與星射線（植物為紡綞絲）的形成。(5)決定在細胞分裂時的平面分離位置。中心粒C.前中期(Prometaphase):核膜消失，染色體更濃縮。1.細胞核外套膜的分裂2.紡錘絲微管黏接到centromere的染色體區域3. Kinetochore(著絲點)：(1)為一多蛋白複合體，其位於中心粒區域(2)提供有絲分裂或減數分裂時的紡錘絲黏接位4. Centrosome(中心體)：(1)為一重要的細胞器，結構上包括中心粒和中心體基質，作為細胞的微管組織中心，決定著細胞微管的極性、數目及分佈。(2)
14、由兩個次單位相黏。D.中期(Metaphase):染色體排列在距兩中心體等距的中期板上。1.當兩極的紡錘體微管分別同染色體的動粒結合，裝配成動粒微管之後，即進入中期。2.染色體在紡錘體動粒微管的作用下, 逐漸移向紡錘體的中心區, 稱為紡錘體赤道(spindle equator)。3.染色體移向赤道, 是紡錘體動粒微管相互作用的結果，並且是染色體由不穩定狀態向穩定狀態轉變的過程。E.後期(Anaphase):著絲點互相分離，而染色分體隨著紡錘絲往相反的位置移動。此時，細胞的兩極離的更遠，將細胞拉長。F.末期(Telophase cytokinesis):紡錘絲往兩極拉的力量更強，細胞更長。原本母
15、細胞中的核膜碎片，再次形成兩子細胞中的核膜。在動物細胞中，會產生分裂溝，把細胞擠成兩半核膜逐漸出現，染色體也恢復成鬆散的染色質。3.細胞週期(cell cycle)：(1)M phase：進行有絲分裂的時期，是最短暫的一個週期。(2)interphase(間期)：A.佔週期時間90%的間期，分為G1 phase，S phase，G2 phase三時期。a.GI phase：靜止期，細胞不作用b.S phase：DNA複製期c.G2 phase：細胞繼續生長，緊接著就是有絲分裂（M phase）的進行。B.在此時期，細胞會藉由合成蛋白質和產生原生質有機物來成長。4.centromere：(1)
16、centromere (中節)：是染色體的一個位置。染色體結構中 P arm 與 q arm中間一段特別高度重複的DNA序列。一般衛星DNA就是來自此處的重複序列。(2) Kinetochore (著絲點)：是一種蛋白質，專門辨認中節的 DNA 序列而結合的蛋白質，它可與紡綞絲的微管蛋白結合，故稱著絲點。(3)在染色體的中節 (centromere) 處，結合著絲點 (kinetochore) 蛋白，該蛋白可以固著紡綞絲，以牽引染色分體的分離。5.衛星DNA重複序列：為高度重複的短的DNA序列，不被轉錄，功能未詳，見於真核染色體中，局限於著絲點區域內。6.異染色質(heterochromati
17、n):染色體中的不活化區*是DNA內一種緊密組合的結構，轉錄作用在其中受到限制。*目前已知染色質有兩種類型：兩者差異最早是以受到染色之後的顏色深度來分辨，前者較淡，而後者，也就是異染色質則較深，可見其結構較為緊密（組蛋白包覆率及雙螺旋化的程度較較高）。A.真染色質B.異染色質：a.一般分佈於細胞核的邊緣地帶。b.多由不具遺傳活性的衛星序列（satellite sequences）所構成。c.其中的基因皆受到不同程度抑制，有些即使在真染色質內也無法表現。d.在細胞週期的S phase中，異染色質比真染色質更晚進行複製。e.只存在於真核生物中，著絲粒及端粒皆屬於異染色質；雌性體內去活化的X染色體（
18、也就是巴爾氏體）也是。f.造成基因的靜默機制，如histone的甲基化、siRNA通過RNAi時*siRNA：A.是長度20到25個核苷酸的雙股RNA。目前已知siRNA主要參與RNA干擾（RNAi）現象，以帶有專一性的方式調節基因的表達。此外，也參與一些與RNAi相關的反應途徑，例如抗病毒機制或是染色質結構的改變。不過這些複雜機制的反應途徑目前尚未明瞭。B.是植物中的後轉錄基因沉默（post-transcriptional gene silencing；PTGS）現象的一部分。發現合成的siRNA，可誘導哺乳動物體內的RNAi作用。這項發現引發了利用可控制的RNAi，來進行生物醫學研究與藥物
19、開發的方法。*RNA干擾：A.指一種分子生物學上由雙鏈RNA誘發的基因沉默現象，其機制是通過阻礙特定基因的翻譯或轉錄來抑制基因表達。當細胞中導入與內源性mRNA編碼區同源的雙鏈RNA時，該mRNA發生降解而導致基因表達沉默。與其它基因沉默現象不同的是，在植物和線蟲中，RNAi具有傳遞性，可在細胞之間傳播，此現象被稱作系統性RNA干擾。B.RNAi與後轉錄基因沉默在分子層次上被證實是同一種現象。7.核型分析(Karyotype analysis)：*當細胞處於有絲分裂中期時，染色體排列在細胞赤道板，是觀察它們的最好時機。*對這些細胞染色，通過顯微鏡拍照獲得它們的影像，根據它們的大小，條紋以及著絲
20、點所在的位置進行排列整合，就可以得到該細胞的染色體組型圖(在ppt的29頁)。*染色體組型圖並非染色體組型。從染色體組型圖中可以得出一個個體或者是遺傳群體的細胞染色體組型的情況。六、 分析方法：1.細胞分裂初期，染色體凝縮。通過染色，它們就可以通過顯微鏡去觀察使用秋水仙鹼去與細胞中的微管蛋白結合，抑制細胞分裂。2.通過顯微鏡拍照，將各個染色體的圖像剪出，根據上面提及的原則整理好，得到染色體組型圖。3.染色可以使得每條染色體上特徵條紋顯示出來，例如藉助FISH方法：通過 CCD相機（CCD=電荷耦合裝置）和電腦軟體的幫助，就可以分辨出顏色差異。通過這種技術，基因易位就可以被識別出來。這種技術還可
21、以用以確定標記染色體的組成。4.先將同源染色體配對，再根據它們的大小，著絲點的位置，明暗帶的位置。常染色體通常與性染色體分開排入7組並數字標記。*秋水仙素：A.將細胞內的微管中主要的成分微管蛋白黏合，阻止微管的聚合作用。B.抑制紡錘體的形成，阻止隨著細胞支架改變的有絲分裂。C.停止嗜中性球的活動能力。D.因為紡錘體無法形成，染色體不可能到達赤道板上，可引起純炎症或抗炎效用。F.運用於羊膜穿刺術。*FISH法：螢光原位雜交法A.原位雜交法(ISH)乃是利用實驗室中合成之DNA或RNA探針，去偵測組織內特定序列之DNA或RNA，以螢光標定之探針去進行原位雜交檢測，即稱為螢光原位雜交法Fluores
22、cent ISH (FISH)。B.FISH則可用來檢測特定基因複製倍數的增加(amplification)、基因的缺損(deletion)、與基因的轉位(translocation)，在某些腫瘤的診斷、預後評估及標靶治療方面有其重要性。細胞CH19P.3048l 羊膜穿刺術(Amniocentesis)妊娠1520週做羊膜穿刺術的目的是染色體檢查，將羊水細胞培養後，萃取細胞核中的染色體，經過特殊染色後，在顯微鏡下觀察並照相，最後將照下的染色體剪下重新排列，即可知胎兒的染色體正常與否。另外，羊水所含的胎兒蛋白(Alpha-fetoprotein)濃度可幫助診斷唐氏症(Down syndrome
23、)、無腦兒、開放性脊柱缺陷，脊髓腦膜膨出等胎兒神經管缺損和染色體異常之問題。羊水檢查是針對胎兒染色體異常和特定的基因疾病進行診斷(例如唐氏症、小腦症或無腦症)，但如先天性心臟病或智能不足就無法用羊水檢查做診斷。A、 檢查項目1. 羊水細胞培養及染色體分析2. 絨毛細胞培養及染色體分析3. 血液細胞培養及染色體分析(1) 羊水細胞培養：羊水細胞中含有胎而脫落的上皮細胞，可在體外培養用以分析胎兒染色體核型。A、B、 秋水仙素秋水仙素會與細胞微管中的微管蛋白黏合，阻止微管聚合作用，阻止有絲分裂，使細胞停留在中期，此時觀察其染色體可得知小孩是否有異常或基因疾病。l 唐氏症（又稱21-三體症候群）特徵1
24、. 頭部長度較短。2. 面部起伏較小。3. 鼻子，眼睛間的部分較低，眼角上挑，深雙眼皮。4. 耳朵上方朝內側彎曲5. 耳朵整體看上去呈圓形而且位置較低6. 手比較寬7. 手指較短8. 拇指和食指之間間隔較遠9. 小指缺少一個關節，向內彎曲。10. 手掌的橫向紋路只有一條（斷掌）。l 螢光原位雜交（fluorescent in situ hybridization，FISH） 是一種細胞遺傳學技術。螢光標記的核酸探針只和具有高度相似性的核酸雜交，可用於染色體上基因的定位和檢測，或在分子生態學中用來標記不同類細菌或古菌中的核糖體RNA。在婦產科或相關檢驗所中，會利用螢光原位雜交技術來判別胎兒的染色
25、體是否正常。FISH可與流式細胞術聯用，對特定螢光標記的細胞進行計數或者分離。A、 利用rRNA的螢光原位雜交時，如下原因可導致較低的螢光信號強度：1. 較低的細胞核糖體含量2. 較低的細胞周邊的通透性3. 較低的目標序列可接觸性（由於rRNA的折疊產生的構象，有些位置與rRNA分子內其他鏈或其他rRNA或蛋白緊密接觸，從而使探針無法和目標序列雜交）B、 FISH步驟1. 取分裂中期的細胞2. 將染色體固定在玻片上3. 探針與固定在玻片上的細胞雜合4. 洗去多餘未雜合的探針5. 以螢光顯微鏡在特定的波長下觀察FISH 在螢光顯微鏡下的影像，紅點為探針，可在分離出做進一步的研究。l 細胞分裂後期
26、涉及染色體分離的兩類運動後期A涉及染色體往紡錘體兩極移動後期B是兩個紡錘體彼此分開的運動A和B可能同時發生 Kinetochore：由蛋白質組成的三層結構，附著於CEN序列，座落於著絲粒的DNA中微管藉由添加微管蛋白次單位(tubulin subunits)延長和減少次單位縮短(加到+端) +遠端 -近端 Kinetochore MT：藉由減少tubulin subunits使其縮短，將染色體拉往兩極Polar MT：藉由添加tubulin subunits使其延長，將細胞往兩邊拉開利用來自於ATP的能量改變形狀，用此方式施力並使附著的結構移動1.在後期A的階段中motor(動力蛋白):行de
27、polymerization解聚作用，減少tubulin subunits鍵結，使其縮短。次單元也可從端被移除2. Polar MT交聯作用使其滑動分開：添加tubulin subunits到+端3. motor:星狀體的MT動力蛋白：在他門的端行解聚作用動物細胞分裂胞質分配：開始於晚後期或早末期細胞膜凹陷形成卵裂溝(Cleavage furrow)較大的細胞器：ER，高爾基複合體片段早在有絲分裂時就變成小囊泡，線粒體則在子細胞重新組裝不對稱胞質分裂：女性卵子的減數分裂細胞質無法複製，隨機分配到子細胞中，分離後不足的部分再自行補足植物細胞分裂植物細胞的赤道位置上出現細胞板(cell plate
28、)，並由中向兩邊擴散形成細胞壁，一個細胞分裂為兩個細胞。第19章 The Cell Cycle , DNA Replication and Mitosis一、 細胞週期的規則(Regulationof the cell cycle)1. 正常細胞的生命週期V.S.癌細胞(1) 在不同的細胞類型中，細胞週期的長度會有所不同。(2) 幹細胞的生長快速且數量不會減少。Clonal selection(株落選擇)1.當身體受到外來細菌入侵時，會在既有的淋巴細胞中比對出親合力較高的抗體，該種類淋巴細胞會開始進行親合篩選、增生以及突變。2.幹細胞幹細胞(self renew自我更新) 分化細胞(3) 不會
29、劃分的細胞：成熟的神經細胞，肌肉細胞(4) 再次刺激才增生(Stimulation)a. 肝細胞不正常增生手術切除(會增生的剛剛好)b. 淋巴細胞(lymphocytes)免疫細胞(等遇到抗原時才會增生，增生快速，其具有專一性，非全部都會增生)二、 在細胞週期中關鍵的轉變點(Key Transition Points in the cell cycle)19.31細胞週期中關鍵的轉變點1.此判斷是基於反應出內部及外部因素的化學信號。2.此有三個轉變點(關卡)，大多都是增殖調控的細胞蛋白（P53、Rb），如果沒把關好的細胞會變成癌細胞。 A. 限制點restriction poin(Start)
30、受影響因素：生長因子、營養、細胞大小、DNA損傷(可看有無突變，會在G1S中進行修復) B. G2-M 轉變受影響因素：細胞大小、DNA損傷、DNA複製 C. 中後期轉變metaphase-anaphase transtion受影響因素：染色體紡錘的連結(紡錘絲要接好，穩定度要夠好)三、 細胞融合的相關研究(Studies involving cell fusion)1.Studies involving cell fusion and cell cycle mutants led to the identification of molecules that control the cell
31、 cycle(此研究包含細胞融合和細胞週期的突變體會導致分子的識別，其會控制細胞週期)結論：細胞質中的分子在細胞週期過程中責任非常重要。 2.方法1 Heterokaryon異核體：兩個哺乳動物細胞會在細胞週期的不同階段，用兩個核使融合形成單一細胞。 3. 存在於細胞質的分子對驅動細胞負責。(從G1進入S期及G2進入有絲分裂的中間過程)19.32證明在細胞週期調控中化學信號的作用1.由於順時鐘的後一期可影響前一期。(a)在S期和G1期細胞融合時，S期會在原來的G1細胞核中被活化。(S期會影響G1期的細胞核)(b)最晚期M可影響G1、S和G2期，在M期和G1期細胞融合時，M期會在原來的non-M
32、核被活化。 4. 方法2酵母菌Yeast (釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae): 真核細胞，單核球，容易在實驗室中生長(尤其是在低溫下易生存)。其有兩大好處：(1)易進行遺傳分析 (2)可得到相當大量同一狀態的細胞。研究人員最主要是利用酵母菌的突變種進行遺傳分析。如：對溫度敏感的突變體(Temperature-sensitive mutants)兩種突變法：(1)藥物突變法使用ethyl methanesulfate藥物會造成突變 (2)溫度突變法在低溫下，酵母菌正常；但在高溫下，酵母菌為異常1.Cdc: cell division cycle(細胞分裂週期)2.箭頭長
33、度為時間比例，可比較出Schizosaccharomycespombe及Saccharomyces cerevisiae兩種酵母菌各時期所需時間。四、 證明MPF的存在(Evidence for existence of MPF)19.33證明MPF的存在Step1.用micropipette(微吸管/探針)，從成熟的卵細胞中抽取細胞質(cytoplasm)。Step2.注入抽取的細胞質到卵母細胞(oocyte)。1. MPF(maturation-promoting factor)是促進成熟因子，其是由兩個次單位組成：Cdk(激酶)和cyclin(細胞週期蛋白)。2. Oocytes(卵母細
34、胞)等待直到其被適當激素刺激減數分裂(meiosis)成熟的卵細胞五、依賴性細胞週期蛋白激酶(Cyclin-dependent kinases/Cdks)1. 當Cdks和一種特殊類型的活化蛋白(cyclin)結合後才會表現酶的活性。 2. Cyclin(細胞週期蛋白)：是蛋白的一種，此蛋白在細胞中的濃度會上下游移不定控制各種Cdks的活性(Cyclin濃度會隨著細胞週期變化而改變，其中M phase濃度最高) 3. 真核細胞週期會被許多不同的Cdks結合到不同的cyclins所調控。 4. 兩個層次的控制：(1) cyclin分子的可用性(availability of cyclin mol
35、ecules) (2) Cdks的磷酸化(Phosporylation of Cdks)PS.不同cyclin會與不同Cdk結合。六、條件一有絲分裂細胞週期蛋白(cyclin)的濃度(The concentration of mitotic cyclin)數量調控(Quantity control)19.34在細胞週期中有絲分裂cyclin的變動程度和MPF活性之間的關係1.Cdks的濃度固定，不過須磷酸化才可調控。2.MPF=有絲分裂Cdk+有絲分裂cyclin。3.Cyclin濃度會隨著細胞週期變化而改變。4.由於Cdks的濃度固定，所以MPF的活性濃度會隨著有絲分裂cyclin的濃度變化
36、。其中當cyclin到達M phase時，其濃度會最高，因此MPF的活性濃度也會最高。七、條件二有絲分裂Cdk的磷酸化與去磷酸化(The phosphorylation or dephosphorylation of mitotic Cdk)品質調控(Quality control)19.35有絲分裂Cdk-cyclin的調控會藉由磷酸化及去磷酸化來取得1.當有絲分裂Cdk和有絲分裂cyclin第一次結合時，其會形成去活性的複合物。2.兩個帶有抑制效果的磷酸激團會藉由抑制激酶(inhibiting kinases)連接到Cdk分子。3.活化的磷酸激團(黃)會藉由活化激酶(activating
37、kinase)而被添加上；只要抑制磷酸基團(白)存在，Cdk就會保持非活化狀態。(去去活性不是非常難活化就是非常易活化)4.磷酸酶(phosphatase)消除了兩個抑制作用的磷酸根，使有絲分裂Cdk-cyclin複合物活化並有功能。5.藉由此反應刺激(stimulates)磷酸可使活化的Cdk-cyclin複合物生成，因此可使活化過程更迅速地進行。67-81一、 三種Checkpoints1. Mitotic spindle checkpoints (1)目的: 防止anaphase染色體，在所有染色體黏附紡錘絲之前開始分離(2)機制：a.角色:Mad and Bub protein，Cdc
38、20，APC，Cdk-cyclin，Separase-Secrinb.辨識Mad and Bub protein有否黏著紡錘絲 (a)左: Mad and Bub protein與Cdc20結合APC不活化，代表尚未黏著。 (b)右: Cdc20不受Mad and Bub protein抑制APC活化，會繼續進行循環。c.APC繼續進行的作用 (a)cyclin被降解，因為用不到。 (b)幫助Separase-Secrin降解Secrin釋放Separase。(c)Separase分解Cohesin。d.結果：姊妹染色體被分開。 (3)時期:MetaphaseAnaphase (4)KEY p
39、rotein: Mitotic cyclin2. DNA damage checkpoints (1)目的:During cell cycle at various points G1, S, and late G2 (interphase) inhibit different Cdk-cyclin complex阻止細胞週期繼續進行，並Apotopsis (2)機制:a.角色:ATM，ATR，Mdm2，p53，PUMA，Bcl-2，Rbb.活化checkpoint kinaseATM，ATR(a)checkpoint kinase使p53磷酸化，Mdm2被抑制。c. p53磷酸結合於DNA(
40、a)活化p21(Cdk抑制)無法磷酸化Rb細胞休眠(b) PUMA幫助抑制Bcl-2無法抑制細胞凋亡。d.補充:PUMA:細胞死亡調製器Cdk-cyclin促進 Rb phosphorylation 蛋白質合成 Bcl-2 inhibit apoptosis細胞活化 *Rb, Bcl-2 致癌基因(3)KEY protein: Rb, Bcl-23. DNA replication checkpoints (1)時期: S phaseG2 phase (inhibit mitotic Cdk-cyclin) (2)目的:抑制正回饋(3)機制:二、細胞週期機制A 細胞分裂調控模型1. Cdk-c
41、yclin觸發三個主要轉譯點(1)G1時Cdk-cyclin，在restriction point，催化Rb蛋白磷酸化。(2)G2時Cdk-cyclin，在G2-M transiotn磷酸化所需蛋白質(3)促進活化Cdk-cyclin: (Metaphase-anaphase transition)a.核封套裂解b.染色體濃縮c.紡錘絲形成d.標記蛋白的降解B Rb蛋白扮演的角色Cdk-cyclin促進 Rb phosphorylation 蛋白質合成 生長因子與Rb蛋白結合是為了轉譯成蛋白質，而Rb蛋白有沒有磷酸化，就不會進行轉譯工程。C 抑制cyclin磷酸化，而停止後面反應未被複製的DN
42、A會被檢查激酶偵測，停止Cdk-cyclin繼續後續蛋白合成。三、Growth factors and cell proliferation(增殖)1.生長因子能促進活化Ras pathway2.增殖所需的生長因子 (1)PDGF: platelet-derived growth factor (2)EGF: epidermal growth factor 3. Ras pathway調控機制:a.膜上接受器與生長因子結合。b.Ras因磷酸化而活化，並活化其他串聯蛋白激酶(Raf、MEK、MAPK)。c.活化生長因子(Ets，Jun，Fos，Myc，E2F)以及生成Cdk，Cyclin，可供G1進入S phase(B圖反應)。