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1、2、 蛋白质分离的双向电泳过程21溶液配制常用水化上样缓冲液()尿素 8M 4.805gCHAPS 4% 0.4gDTT 65Mm 0.098gBio-Lyte 0.2%(w/v) 50l(40)溴酚蓝 0.001 10l(1溴酚蓝)MilliQ水 定容至100ml()尿素 7M 4.2g硫脲 2M 1.52gCHAPS 4% 0.4gDTT 65Mm 0.098gBio-Lyte 0.2%(w/v) 50l(40)溴酚蓝 0.001 10l(1溴酚蓝)MilliQ水 定容至100ml()尿素 5M 3.0g硫脲 2M 1.52gSB3-10 2% 0.2gCHAPS 4% 0.4gDTT 6
2、5Mm 0.098gBio-Lyte 0.2%(w/v) 50l(40)溴酚蓝 0.001 10l(1溴酚蓝)MilliQ水 定容至100ml分成10小管,每小管1ml,-80冰箱保存。胶条平衡缓冲液母液尿素 6M 36gSDS 2% 2gTris-HCl 0.05M pH8.8 3.3ml(1.5M pH8.8 Tris-HCl)甘油 20 20mlMilliQ水 定容至100ml分装成10管,-20冰箱保存。胶条平衡缓冲液 胶条平衡缓冲液母液 10ml DTT 0.2g充分混匀,用时现配。胶条平衡缓冲液 胶条平衡缓冲液母液 10ml 碘乙酰胺 0.25g充分混匀,用时现配。低熔点琼脂糖封胶
3、液 低熔点琼脂糖 0.5 0.5g Tris 25mM 0.303g 甘氨酸 192mM 1.44g SDS 0.1% 1ml(10%SDS) 溴酚蓝 0.001 100l(1% 溴酚蓝) MilliQ水 定容至100ml加热溶解至澄清,室温保存。30聚丙烯酰胺贮液 丙烯酰胺 150g 甲叉双丙稀酰胺 4g MilliQ水 500ml滤纸过滤后,棕色瓶4冰箱保存。1.5mol/L Tris碱pH8.8 Tris碱 90.75g MilliQ水 400ml用1mol/L HCl调pH至8.8,加MilliQ水定容至500ml, 4冰箱保存。10% SDS SDS 10g MilliQ水 100m
4、l10%过硫酸铵 过硫酸铵 0.1g MilliQ水 1ml现用现配。10电泳缓冲液(125mM Tris,192mM glycine,0.1% SDS,pH8.3) Tris碱 30g甘氨酸 144gSDS 10gMilliQ水 1L混匀后,室温保存。22操作步骤2.2.1 第一向等电聚焦1.从冰箱中取水化上样缓冲液,室温溶解;在enpendoff管中,2.0mg蛋白干粉加入200l水化上样缓冲液,室温下裂解3-4h;10000rpm常温离心10min,取上清液上样水化。具体的上样体积及蛋白质上样量如下表,ReadyStripTMIPG胶条长度上样体积分析型的上样量(银染)制备型的上样量(考
5、马斯亮兰染色)7cm125-250l10-100ug200-500ug17cm300-600l100-300ug1-3mg2.从冰箱中取-20冷冻保存的IPG预制胶条,于室温放置10min。3.沿着聚焦盘的边缘由左至右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样,中间的样品一定要连贯,同时注意不要产生气泡。4.用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层,分清胶条的正负极,轻轻地将IPG 胶条胶面朝下置于聚焦盘中样品溶液上,使得胶条得正极对应于聚焦盘得正极。确保胶条与电极紧密接触,同时不要使胶条下面的溶液产生气泡。5.在每根胶条上覆盖矿物油,防止胶条水化过程中液体的蒸发。6.对好正、负极,盖上盖子。
6、设置等电聚焦程序。7cm胶条 水化 12h(17-20) 主动水化 S1 250V 慢速 2 h 除盐 S2 500V 慢速 1 h 除盐 S3 1000V 快速 1 h 除盐 S4 4000V 线性 3 h 升压 S5 4000V 快速 25000 伏h 聚焦 S6 500V 快速 任意时间 保持17cm胶条 水化 12h(17-20) 主动水化 S1 250V 慢速 2 h 除盐 S2 500V 慢速 1 h 除盐 S3 1000V 快速 1 h 除盐 S4 8000V 线性 5 h 升压 S5 8000V 快速 60,000 伏h 聚焦 S6 500V 快速 任意时间 保持l 选择所放置
7、的胶条数。l 设置每根胶条的极限电流。l 设置等电聚焦时的温度。7.聚焦结束的胶条如不立即进行平衡、第二向SDSPAGE电泳,可将胶条置于样品水化盘中,-20冰箱保存1-2天。2.2.2 第二向SDSPAGE电泳1.配制12的丙稀酰胺凝胶,上部留0.5cm的空间,用MilliQ水封面,保持胶面平整。待凝胶凝固候,倒去分离胶表面的MilliQ水,再用MilliQ水冲洗。2.从-20冰箱中取出的胶条,先于室温放置10min,使其溶解。3.在桌上先放置干得厚滤纸,聚焦好得胶条胶面朝上放在干得厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿,挤去多余水分,然后置于胶条上,轻轻吸干胶条上得矿物油及多余样品。
8、这可以减少凝胶染色时出现得纵条纹。4.将胶条转移至溶涨盘中,每个槽一根胶条,在槽中加入平衡缓冲液。将样品水化盘放在摇床上缓慢摇晃10-15min。5.第一次平衡结束后,彻底倒掉平衡缓冲液,将胶条竖在滤纸上,吸去多余得平衡液。再加入胶条平衡缓冲液,继续在摇床上缓慢摇晃10-15min。6.用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余得液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上,长玻璃板再下,短玻璃板朝上,凝胶的顶部对着自己。7.第二次平衡结束后,用滤纸吸去胶条上多余的平衡液。用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸没在1电泳缓冲液中,然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。8.将放有胶条的SDSP
9、AGE凝胶转移到灌胶架上,短板一面对着自己,在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。9.用镊子或平头的针头轻轻地将胶条向下推,使之与聚丙烯酰胺胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡,同时操作时注意不要碰到胶面。10.放置5min,低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后,将凝胶转移至电泳槽中。11.电泳起始时用低电流(7cm胶条:5-10mA/gel;17cm胶条:10mA/gel)或低电压(7cm胶条:50-75V/gel;17cm胶条75-100V/gel),待样品在完全走出IPG胶条,浓缩成一条线后,在加大电流(7cm胶条:10-15mA/gel;17cm胶条:20-30mA/gel)或电压(7
10、cm胶条:150-200V/gel;17cm胶条:300-400V/gel),待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。12.电泳结束后,轻轻撬开两层玻璃,取出凝胶,并切角以做记号。然后进行染色。23染色方法2.3.1考马斯亮蓝G-250染色固定液:45(V/V)甲醇,1(V/V)乙酸G-250染色液:17(W/V)硫酸铵,34(V/V)甲醇,0.5(V/V)乙酸,0.1(W/V)G-250.步骤:1.固定液固定20min或过夜(无需固定液可)。2.倒出固定液3.加入G-250染色液,18-24h。4.倒出染色液5.用水洗(20min一次,4555温水有助于水洗)6.可用塑料包裹,4贮于密封盆
11、里。2.3.2胶体考染法1.用去离子水清洗凝胶两次,每次10min,以去除SDS。2.固定:50乙醇/10冰醋酸/的水溶液,至少30min,可过夜。3.染色:染色液为45甲醇/10冰醋酸/0.25G-250溶液过滤所得,将凝胶浸泡后染色至少2h。4.脱色:多次更换脱色液(25乙醇/8冰醋酸溶液)直至背景脱净。5.保存:用保险膜包裹,可存一个月。2.3.3银染法步骤 试剂 体积(ml) 不同类型胶所需时间(min) 1mm 1.5mm1.固定 10乙酸 / 40乙醇 / 水 2250 215 2602.敏化 75ml乙醇 / 17g乙酸钠 / 10ml 5% Na2S2O3 / 250 30 6
12、01.25ml戊二醛 / 加水至3.水洗 去离子水 35250 315 584.银染 25ml AgNO3 (2.5%) / 100l 甲醛/ 加水至 250 20 605.水洗 去离子水 24250 21 416.显色 6.25g Na2CO3 / 100l 甲醛 7l Na2S2O3(5%) 250 4 67.停止 3.65g EDTA 加水至 250 10 408.水洗 去离子水 23250 35 2303、 等电聚焦蛋白样品的浓度检测31 Bio-Rad RC DC Protein Assay 微离心管检测方法(1)将5l DC试剂S与250l DC试剂A混合(试剂A),每份样品或标准
13、溶液需要127l 试剂A。(2)将标准蛋白稀释为3-5份蛋白浓度在0.2-1.5mg/ml范围内的标准溶液,在每次测未知蛋白浓度前绘制标准曲线。(为得到最佳结果,标准蛋白应与样品使用同样的缓冲液)(3)从每份样品或标准蛋白中取出25l,分别加至清洁、干燥的微离心管中。(4)向每管中加入125l RC试剂,混旋后室温放置1min。(5)向每管中加入125l RC试剂并混旋,之后在15,000g速度下离心3-5min。(6)吸去上清,然后将管子倒置在干净吸水纸上,使溶液彻底被吸干。(7)向每个微离心管中加入 127l 试剂A并混旋,在室温下放置5min或直至沉淀彻底溶解。在进行下一步之前再次混旋。
14、(8)在每个管中加入1ml DC试剂B,立即混旋,室温下放置15min。(9)在750nm下读取吸光度,吸光度测定要在1h内完成。32 Bradford法1、溶液的配制 Bradford储存液 100ml 95% 乙醇 200ml 88% 磷酸 350mg 考马斯亮蓝G-250室温下长期保持稳定。Bradford 工作液 425ml MilliQ 水 15ml 95% 乙醇 30ml 88% 磷酸 30ml Bradford储存液Whatman 1号滤纸过滤,保存于室温棕色瓶中,用前过滤。2.1mg/ml BSA蛋白质标准溶液 10mg BSA标准蛋白 10ml MilliQ 水分装成10小管
15、,-20冰箱保存。2、标准曲线的测定 ID BSA蛋白质 MilliQ水 Bradford Abs 标准溶液(l) (l) 工作液(ml) (A595) Blank 0 100 1 0 0 100 1 0 1 2.5 97.5 1 0.06562.5 97.5 1 0.0656 2 5 95 1 0.16265 95 1 0.1852 3 7.5 92.5 1 0.2248 7.5 92.5 1 0.2543 4 10 90 1 0.261110 90 1 0.3020 5 12.5 87.5 1 0.303412.5 87.5 1 0.3080 6 15 85 1 0.321815 85 1
16、 0.3523 7 17.5 82.5 1 0.3514 17.5 82.5 1 0.4236 8 20 80 1 0.4279 20 80 1 0.42343、未知蛋白浓度的测定步骤:(1)将未知蛋白溶液移至试管,补加MilliQ水至100l。(2)加入1ml Bradford 工作液,充分混匀。(3)3.2min后测A595的OD值。(4)根据测得的A595的OD值,及未知蛋白的稀释倍数,即可算出未知蛋白的浓度。33 考马斯亮蓝G-250染色法1、溶液的配制(1)染色液配制95 乙醇 50ml85 磷酸 100ml考马斯亮蓝 G-250 100mg用MilliQ水稀释定容至1000ml,滤
17、纸过滤,保存于棕色瓶中,4冰箱备用。(2) 300ug/ml标准蛋白质溶液配制 BSA 标准蛋白质 30mg MilliQ水 定容至100ml2、标准曲线的测定ID 标准蛋白质 MilliQ水 蛋白浓度 染色液 ABS 溶液(l) (l) (ug/ml) (ml) (A595)1 0 1000 0 3 0 0 1000 0 3 02 50 950 15 3 0.2879 50 950 15 3 0.28843 100 900 30 3 0.4912 100 900 30 3 0.49484 200 800 60 3 0.7835 200 800 60 3 0.79015 300 700 90
18、3 1.0738 300 700 90 3 1.07756 400 600 120 3 1.1804 400 600 120 3 1.18317 500 500 150 3 1.2663 500 500 150 3 1.27128 600 400 180 3 1.3434 600 400 180 3 1.34979 800 200 240 3 1.4482 800 200 240 3 1.450510 1000 0 300 3 1.4802 1000 0 300 3 1.4837 注:充分混匀,室温(20-25)保温15min。4、未知蛋白浓度的测定 步骤: 对照管2 样品管2 待测样品(l)
19、 0 500 MilliQ 水(l) 1000 500 染色液(ml) 3.0 3.0 样品管中的蛋白可根据需要选择稀释倍数。 充分混匀,室温20-25保温15min。测A595处的OD值。 计算:蛋白浓度(ug/ml)查A595标准曲线所得蛋白浓度(ug/ml)样品稀释倍数测试样品用量(ml) 蛋白质样品提取、裂解条件对蛋白质谱的影响较大,尤其是蛋白质提取的缓冲液性质是影响电泳图谱的关键。本章在前一章的基础上,重点优化蛋白质提取缓冲液、样品裂解液、电泳条件等技术方案。1 材料与方法11 供试材料 供试黄瓜品种为山东密刺。将种子催芽后播在装有草炭土:蛭石为1:2(体积比)的营养钵中,温室中培养
20、,待黄瓜长至两片真叶时,取第二片真叶,称取后置于-80冰箱中待用。12 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶浓度的比较1D样品的提取和SDS-PAGE:样品液氮研磨,按1/5的比例加提取液(pH6.8的0.0625M Tris-HCL, 0.5%SDS,5甘油,3-巯基乙醇和10 TritonX-100)-4提取1h,10000rpm -4 下离心20 min。取上清液,加4倍体积的丙酮溶液,-20沉淀过夜,10000rpm -4 下离心20 min,去除上清,沉淀冷冻干燥。24mg蛋白干粉加1ml蛋白样品处理液(2SDS,5巯基乙醇,10甘油,0.02溴酚蓝,0.125M pH8.0 Tris-H
21、CL),沸水浴3-5 min,冷却后供点样用。SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离胶浓度分别为7.5、10、12、15,浓缩胶浓度为4。具体配制参照下表3-1。13 双向电泳中黄瓜叶片蛋白质不同提取方法比较1.3.1三氯乙酸/丙酮法(TCA/acetone法):取1g植物叶片,液氮冷冻研磨,加5ml含0.2%DTT和20%TCA的冷丙酮溶液匀浆,放置于-20冰箱过夜。之后4下13000rpm离心30min,弃上清液,沉淀用含0.2%DTT的丙酮溶液清洗三次(每次均放于-20冰箱沉淀1h)。最后沉淀冻干,放于-80冰箱待用。1.3.2 DTT/丙酮法:取1g植物叶片,液氮冷冻研磨,加5ml含2%DTT的水
22、溶液匀浆。之后4下1000rpm离心30min,取上清液,弃沉淀。上清液加4倍体积的冷丙酮,放置于-20冰箱过夜。之后4下13000rpm离心30min,沉淀用80%丙酮溶液清洗三次(每次均放于-20冰箱沉淀1h)。最后沉淀冻干,放于-80冰箱待用。1.3.3 酚提取法:取1g植物叶片,液氮冷冻研磨,加3ml提取液(1%PVPP,0.7M蔗糖,0.1M KCL,0.5M pH7.5 Tris-HCL,500mM EDTA,1Mm PMSF,2%-巯基乙醇),4下1000rpm离心30min,取上清液加等体积的Tris酚,4下放置30min,之后10000 rpm离心15min,取酚相上清液。此
23、过程反复提取2-3次。最后酚相用5体积0.1M冷乙酸铵溶液-20沉淀过夜。之后13000 rpm离心30min, 沉淀用0.1M冷乙酸铵溶液清洗三次,再用冷丙酮洗一次, 最后沉淀冻干,放于-80冰箱待用。1.3.4 三氯乙酸/丙酮法/酚(TCA/acetone/phenol)提取法: 取1g植物叶片,液氮冷冻研磨, 加4ml冷丙酮, 4下13000rpm离心3min,再用冷丙酮洗两次并离心。沉淀转入研钵中,室温干燥20min。干粉末重新研得更细,并转到新管中,得到得组织粉末用10%冷TCA/丙酮溶液清洗3-4次,直到上清液无颜色为止。最后用80%冷丙酮洗两次,每次沉淀彻底重新旋弃,并离心。取0
24、.050.1g干粉末在2.0ml管里重新悬浮于0.8mlTris酚和0.8mlSDS溶液(含30%蔗糖,2%SDS,0.1M Tris-HCL Ph8.0, 5%-巯基乙醇)中。该混合物彻底涡旋30S, 4下13000rpm离心30min, 酚相移到新管中,用5体积0.1M冷乙酸铵溶液-20沉淀过夜。之后13000 rpm离心30min,沉淀用0.1M冷乙酸铵溶液清洗两次,再用80%冷丙酮洗两次,最后沉淀冻干,放于-80冰箱待用。表3-1SDS-PAGE 分离胶和浓缩胶的配置Table 3-1 Formulations for SDS-PAGE Separating and Stacking
25、GelsSeparating Gel(0.375M Tris,pH8.8)Stacking Gel(1.25M Tris,pH6.8)Monomer Concentration(%T,2.67% C)7.5%10%12.5%15%4.0%Acrylamide/bis(30%T,2.67%C Stock)Distilled water1.5M Tris-HCl,pH8.80.5M Tris-HCl,pH6.810%(W/V)SDS10% ammonium persulfate(fresh)TEMEDTOTAL MONOMER25.0ml48.5ml25.0ml-1.0ml500l50l100ml
26、33ml40ml25ml-1.0ml500l50l100ml41.625ml31.875ml25.0ml1.0ml500l50l100ml50.0ml23.5ml25.0ml-1.0ml500l50l100ml1.3ml6.1ml-2.5ml100l50l10l10ml第一向IEF采取IEF方法()。第二向SDS-PAGE电泳分离胶浓度为15,电泳条件为20V/gel 20min,80V/gel 2h。G-250胶体考染法染色。14 不同裂解缓冲液的比较Buffer 15M Urea 3g2M thiourea 1.52g100mM DTT 146.4mg0.4% CHAPS 40mg0.25
27、% SB3-10 25mgCarrier ampholyte 25l (40%)Bromophenol blue 20l (1%)0.25% Tween 20 25l10% Isopropanol 1.0ml12.5% Saturated isobutanol 1.25ml5% Glycerol 0.5ml加MilliQ水至 10ml Buffer 28M Urea 4.8g2M thiourea 1.52g100mM DTT 146.4mg0.4% CHAPS 40mg0.25% SB3-10 25mgCarrier ampholyte 25l (40%)Bromophenol blue 2
28、0l (1%)0.25% Tween 20 25l10% Isopropanol 1.0ml5% Glycerol 0.5ml加MilliQ水至 10mlBuffer 35M Urea 3g2M thiourea 1.52g20mM DTT 30.8mg2mM TBP 100l2% CHAPS 0.2g2% SB3-10 0.2g0.5% Carrier ampholyte 125l (40%)Bromophenol blue 20l (1%)0.25% Tween 20 25l10% Isopropanol 1.0ml5% Glycerol 0.5ml加MilliQ水至 10mlBuffer 49.5M Urea 5.7g2M thiourea 1.52g1% DTT 0.1g2mM TBP 100l4% CHAPS 0.4g0.2% Carrier ampholyte 50l (40%)Bromophenol blue 20l (1%)0.25% Tween 20 25l10% Glycerol 3.3ml (30%)10mM PMSF 500l (200mM)