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1、2、 蛋白质分离的双向电泳过程21溶液配制常用水化上样缓冲液（）尿素 8M 4.805gCHAPS 4% 0.4gDTT 65Mm 0.098gBio-Lyte 0.2%(w/v) 50l（40）溴酚蓝 0.001 10l（1溴酚蓝）MilliQ水 定容至100ml（）尿素 7M 4.2g硫脲 2M 1.52gCHAPS 4% 0.4gDTT 65Mm 0.098gBio-Lyte 0.2%(w/v) 50l（40）溴酚蓝 0.001 10l（1溴酚蓝）MilliQ水 定容至100ml()尿素 5M 3.0g硫脲 2M 1.52gSB3-10 2% 0.2gCHAPS 4% 0.4gDTT 6
2、5Mm 0.098gBio-Lyte 0.2%(w/v) 50l（40）溴酚蓝 0.001 10l（1溴酚蓝）MilliQ水 定容至100ml分成10小管，每小管1ml,-80冰箱保存。胶条平衡缓冲液母液尿素 6M 36gSDS 2% 2gTris-HCl 0.05M pH8.8 3.3ml(1.5M pH8.8 Tris-HCl)甘油 20 20mlMilliQ水 定容至100ml分装成10管，-20冰箱保存。胶条平衡缓冲液 胶条平衡缓冲液母液 10ml DTT 0.2g充分混匀，用时现配。胶条平衡缓冲液 胶条平衡缓冲液母液 10ml 碘乙酰胺 0.25g充分混匀，用时现配。低熔点琼脂糖封胶
3、液 低熔点琼脂糖 0.5 0.5g Tris 25mM 0.303g 甘氨酸 192mM 1.44g SDS 0.1% 1ml(10%SDS) 溴酚蓝 0.001 100l(1% 溴酚蓝) MilliQ水 定容至100ml加热溶解至澄清，室温保存。30聚丙烯酰胺贮液 丙烯酰胺 150g 甲叉双丙稀酰胺 4g MilliQ水 500ml滤纸过滤后，棕色瓶4冰箱保存。1.5mol/L Tris碱pH8.8 Tris碱 90.75g MilliQ水 400ml用1mol/L HCl调pH至8.8，加MilliQ水定容至500ml, 4冰箱保存。10% SDS SDS 10g MilliQ水 100m
4、l10%过硫酸铵 过硫酸铵 0.1g MilliQ水 1ml现用现配。10电泳缓冲液（125mM Tris,192mM glycine,0.1% SDS,pH8.3） Tris碱 30g甘氨酸 144gSDS 10gMilliQ水 1L混匀后，室温保存。22操作步骤2.2.1 第一向等电聚焦1.从冰箱中取水化上样缓冲液，室温溶解；在enpendoff管中，2.0mg蛋白干粉加入200l水化上样缓冲液，室温下裂解3-4h；10000rpm常温离心10min,取上清液上样水化。具体的上样体积及蛋白质上样量如下表，ReadyStripTMIPG胶条长度上样体积分析型的上样量（银染）制备型的上样量（考
5、马斯亮兰染色）7cm125-250l10-100ug200-500ug17cm300-600l100-300ug1-3mg2.从冰箱中取-20冷冻保存的IPG预制胶条，于室温放置10min。3.沿着聚焦盘的边缘由左至右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品一定要连贯，同时注意不要产生气泡。4.用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层，分清胶条的正负极，轻轻地将IPG 胶条胶面朝下置于聚焦盘中样品溶液上，使得胶条得正极对应于聚焦盘得正极。确保胶条与电极紧密接触，同时不要使胶条下面的溶液产生气泡。5.在每根胶条上覆盖矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。6.对好正、负极，盖上盖子。
6、设置等电聚焦程序。7cm胶条 水化 12h（17-20） 主动水化 S1 250V 慢速 2 h 除盐 S2 500V 慢速 1 h 除盐 S3 1000V 快速 1 h 除盐 S4 4000V 线性 3 h 升压 S5 4000V 快速 25000 伏h 聚焦 S6 500V 快速 任意时间 保持17cm胶条 水化 12h（17-20） 主动水化 S1 250V 慢速 2 h 除盐 S2 500V 慢速 1 h 除盐 S3 1000V 快速 1 h 除盐 S4 8000V 线性 5 h 升压 S5 8000V 快速 60,000 伏h 聚焦 S6 500V 快速 任意时间 保持l 选择所放置
7、的胶条数。l 设置每根胶条的极限电流。l 设置等电聚焦时的温度。7.聚焦结束的胶条如不立即进行平衡、第二向SDSPAGE电泳，可将胶条置于样品水化盘中，-20冰箱保存1-2天。2.2.2 第二向SDSPAGE电泳1.配制12的丙稀酰胺凝胶，上部留0.5cm的空间，用MilliQ水封面，保持胶面平整。待凝胶凝固候，倒去分离胶表面的MilliQ水，再用MilliQ水冲洗。2.从-20冰箱中取出的胶条，先于室温放置10min，使其溶解。3.在桌上先放置干得厚滤纸，聚焦好得胶条胶面朝上放在干得厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后置于胶条上，轻轻吸干胶条上得矿物油及多余样品。
8、这可以减少凝胶染色时出现得纵条纹。4.将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在槽中加入平衡缓冲液。将样品水化盘放在摇床上缓慢摇晃10-15min。5.第一次平衡结束后，彻底倒掉平衡缓冲液，将胶条竖在滤纸上，吸去多余得平衡液。再加入胶条平衡缓冲液，继续在摇床上缓慢摇晃10-15min。6.用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余得液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板再下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。7.第二次平衡结束后，用滤纸吸去胶条上多余的平衡液。用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸没在1电泳缓冲液中，然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。8.将放有胶条的SDSP
9、AGE凝胶转移到灌胶架上，短板一面对着自己，在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。9.用镊子或平头的针头轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡，同时操作时注意不要碰到胶面。10.放置5min，低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后，将凝胶转移至电泳槽中。11.电泳起始时用低电流（7cm胶条：5-10mA/gel；17cm胶条：10mA/gel）或低电压(7cm胶条：50-75V/gel；17cm胶条75-100V/gel)，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，在加大电流(7cm胶条：10-15mA/gel；17cm胶条：20-30mA/gel)或电压(7
10、cm胶条：150-200V/gel；17cm胶条：300-400V/gel)，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。12.电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以做记号。然后进行染色。23染色方法2.3.1考马斯亮蓝G-250染色固定液：45（V/V）甲醇，1（V/V）乙酸G-250染色液：17（W/V）硫酸铵，34（V/V）甲醇，0.5（V/V）乙酸，0.1（W/V）G-250.步骤：1.固定液固定20min或过夜（无需固定液可）。2.倒出固定液3.加入G-250染色液，18-24h。4.倒出染色液5.用水洗（20min一次，4555温水有助于水洗）6.可用塑料包裹，4贮于密封盆
11、里。2.3.2胶体考染法1.用去离子水清洗凝胶两次，每次10min，以去除SDS。2.固定：50乙醇/10冰醋酸/的水溶液，至少30min,可过夜。3.染色：染色液为45甲醇/10冰醋酸/0.25G-250溶液过滤所得，将凝胶浸泡后染色至少2h。4.脱色：多次更换脱色液（25乙醇/8冰醋酸溶液）直至背景脱净。5.保存：用保险膜包裹，可存一个月。2.3.3银染法步骤 试剂 体积（ml） 不同类型胶所需时间(min) 1mm 1.5mm1.固定 10乙酸 / 40乙醇 / 水 2250 215 2602.敏化 75ml乙醇 / 17g乙酸钠 / 10ml 5% Na2S2O3 / 250 30 6
12、01.25ml戊二醛 / 加水至3.水洗 去离子水 35250 315 584.银染 25ml AgNO3 (2.5%) / 100l 甲醛/ 加水至 250 20 605.水洗 去离子水 24250 21 416.显色 6.25g Na2CO3 / 100l 甲醛 7l Na2S2O3(5%) 250 4 67.停止 3.65g EDTA 加水至 250 10 408.水洗 去离子水 23250 35 2303、 等电聚焦蛋白样品的浓度检测31 Bio-Rad RC DC Protein Assay 微离心管检测方法（1）将5l DC试剂S与250l DC试剂A混合（试剂A），每份样品或标准
13、溶液需要127l 试剂A。（2）将标准蛋白稀释为3-5份蛋白浓度在0.2-1.5mg/ml范围内的标准溶液，在每次测未知蛋白浓度前绘制标准曲线。（为得到最佳结果，标准蛋白应与样品使用同样的缓冲液）（3）从每份样品或标准蛋白中取出25l，分别加至清洁、干燥的微离心管中。（4）向每管中加入125l RC试剂，混旋后室温放置1min。（5）向每管中加入125l RC试剂并混旋，之后在15，000g速度下离心3-5min。（6）吸去上清，然后将管子倒置在干净吸水纸上，使溶液彻底被吸干。（7）向每个微离心管中加入 127l 试剂A并混旋，在室温下放置5min或直至沉淀彻底溶解。在进行下一步之前再次混旋。
14、（8）在每个管中加入1ml DC试剂B，立即混旋，室温下放置15min。（9）在750nm下读取吸光度，吸光度测定要在1h内完成。32 Bradford法1、溶液的配制 Bradford储存液 100ml 95% 乙醇 200ml 88% 磷酸 350mg 考马斯亮蓝G-250室温下长期保持稳定。Bradford 工作液 425ml MilliQ 水 15ml 95% 乙醇 30ml 88% 磷酸 30ml Bradford储存液Whatman 1号滤纸过滤，保存于室温棕色瓶中，用前过滤。2.1mg/ml BSA蛋白质标准溶液 10mg BSA标准蛋白 10ml MilliQ 水分装成10小管
15、，-20冰箱保存。2、标准曲线的测定 ID BSA蛋白质 MilliQ水 Bradford Abs 标准溶液（l） （l） 工作液（ml） (A595) Blank 0 100 1 0 0 100 1 0 1 2.5 97.5 1 0.06562.5 97.5 1 0.0656 2 5 95 1 0.16265 95 1 0.1852 3 7.5 92.5 1 0.2248 7.5 92.5 1 0.2543 4 10 90 1 0.261110 90 1 0.3020 5 12.5 87.5 1 0.303412.5 87.5 1 0.3080 6 15 85 1 0.321815 85 1
16、 0.3523 7 17.5 82.5 1 0.3514 17.5 82.5 1 0.4236 8 20 80 1 0.4279 20 80 1 0.42343、未知蛋白浓度的测定步骤：（1）将未知蛋白溶液移至试管，补加MilliQ水至100l。（2）加入1ml Bradford 工作液，充分混匀。（3）3.2min后测A595的OD值。（4）根据测得的A595的OD值，及未知蛋白的稀释倍数，即可算出未知蛋白的浓度。33 考马斯亮蓝G-250染色法1、溶液的配制（1）染色液配制95 乙醇 50ml85 磷酸 100ml考马斯亮蓝 G-250 100mg用MilliQ水稀释定容至1000ml,滤
17、纸过滤，保存于棕色瓶中，4冰箱备用。（2） 300ug/ml标准蛋白质溶液配制 BSA 标准蛋白质 30mg MilliQ水 定容至100ml2、标准曲线的测定ID 标准蛋白质 MilliQ水 蛋白浓度 染色液 ABS 溶液（l） （l） （ug/ml） （ml） (A595)1 0 1000 0 3 0 0 1000 0 3 02 50 950 15 3 0.2879 50 950 15 3 0.28843 100 900 30 3 0.4912 100 900 30 3 0.49484 200 800 60 3 0.7835 200 800 60 3 0.79015 300 700 90
18、3 1.0738 300 700 90 3 1.07756 400 600 120 3 1.1804 400 600 120 3 1.18317 500 500 150 3 1.2663 500 500 150 3 1.27128 600 400 180 3 1.3434 600 400 180 3 1.34979 800 200 240 3 1.4482 800 200 240 3 1.450510 1000 0 300 3 1.4802 1000 0 300 3 1.4837 注：充分混匀，室温（20-25）保温15min。4、未知蛋白浓度的测定 步骤： 对照管2 样品管2 待测样品（l）
19、 0 500 MilliQ 水（l） 1000 500 染色液（ml） 3.0 3.0 样品管中的蛋白可根据需要选择稀释倍数。 充分混匀，室温20-25保温15min。测A595处的OD值。 计算：蛋白浓度（ug/ml）查A595标准曲线所得蛋白浓度（ug/ml）样品稀释倍数测试样品用量（ml） 蛋白质样品提取、裂解条件对蛋白质谱的影响较大，尤其是蛋白质提取的缓冲液性质是影响电泳图谱的关键。本章在前一章的基础上，重点优化蛋白质提取缓冲液、样品裂解液、电泳条件等技术方案。1 材料与方法11 供试材料 供试黄瓜品种为山东密刺。将种子催芽后播在装有草炭土：蛭石为1：2（体积比）的营养钵中，温室中培养
20、，待黄瓜长至两片真叶时，取第二片真叶，称取后置于-80冰箱中待用。12 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶浓度的比较1D样品的提取和SDS-PAGE：样品液氮研磨，按1/5的比例加提取液（pH6.8的0.0625M Tris-HCL, 0.5%SDS，5甘油，3-巯基乙醇和10 TritonX-100）-4提取1h，10000rpm -4 下离心20 min。取上清液，加4倍体积的丙酮溶液，-20沉淀过夜，10000rpm -4 下离心20 min，去除上清，沉淀冷冻干燥。24mg蛋白干粉加1ml蛋白样品处理液（2SDS，5巯基乙醇，10甘油，0.02溴酚蓝，0.125M pH8.0 Tris-H
21、CL）,沸水浴3-5 min，冷却后供点样用。SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离胶浓度分别为7.5、10、12、15，浓缩胶浓度为4。具体配制参照下表3-1。13 双向电泳中黄瓜叶片蛋白质不同提取方法比较1.3.1三氯乙酸/丙酮法(TCA/acetone法):取1g植物叶片，液氮冷冻研磨，加5ml含0.2%DTT和20%TCA的冷丙酮溶液匀浆，放置于-20冰箱过夜。之后4下13000rpm离心30min，弃上清液，沉淀用含0.2%DTT的丙酮溶液清洗三次(每次均放于-20冰箱沉淀1h)。最后沉淀冻干，放于-80冰箱待用。1.3.2 DTT/丙酮法:取1g植物叶片，液氮冷冻研磨，加5ml含2%DTT的水
22、溶液匀浆。之后4下1000rpm离心30min，取上清液，弃沉淀。上清液加4倍体积的冷丙酮，放置于-20冰箱过夜。之后4下13000rpm离心30min，沉淀用80%丙酮溶液清洗三次(每次均放于-20冰箱沉淀1h)。最后沉淀冻干，放于-80冰箱待用。1.3.3 酚提取法:取1g植物叶片，液氮冷冻研磨，加3ml提取液(1%PVPP,0.7M蔗糖,0.1M KCL,0.5M pH7.5 Tris-HCL,500mM EDTA,1Mm PMSF,2%-巯基乙醇)，4下1000rpm离心30min，取上清液加等体积的Tris酚，4下放置30min，之后10000 rpm离心15min，取酚相上清液。此
23、过程反复提取2-3次。最后酚相用5体积0.1M冷乙酸铵溶液-20沉淀过夜。之后13000 rpm离心30min, 沉淀用0.1M冷乙酸铵溶液清洗三次,再用冷丙酮洗一次, 最后沉淀冻干,放于-80冰箱待用。1.3.4 三氯乙酸/丙酮法/酚（TCA/acetone/phenol）提取法: 取1g植物叶片，液氮冷冻研磨, 加4ml冷丙酮, 4下13000rpm离心3min，再用冷丙酮洗两次并离心。沉淀转入研钵中,室温干燥20min。干粉末重新研得更细，并转到新管中，得到得组织粉末用10%冷TCA/丙酮溶液清洗3-4次，直到上清液无颜色为止。最后用80%冷丙酮洗两次，每次沉淀彻底重新旋弃，并离心。取0
24、.050.1g干粉末在2.0ml管里重新悬浮于0.8mlTris酚和0.8mlSDS溶液(含30%蔗糖,2%SDS,0.1M Tris-HCL Ph8.0, 5%-巯基乙醇)中。该混合物彻底涡旋30S, 4下13000rpm离心30min， 酚相移到新管中，用5体积0.1M冷乙酸铵溶液-20沉淀过夜。之后13000 rpm离心30min，沉淀用0.1M冷乙酸铵溶液清洗两次，再用80%冷丙酮洗两次，最后沉淀冻干，放于-80冰箱待用。表3-1SDS-PAGE 分离胶和浓缩胶的配置Table 3-1 Formulations for SDS-PAGE Separating and Stacking
25、GelsSeparating Gel(0.375M Tris,pH8.8)Stacking Gel(1.25M Tris,pH6.8)Monomer Concentration(%T,2.67% C)7.5%10%12.5%15%4.0%Acrylamide/bis(30%T,2.67%C Stock)Distilled water1.5M Tris-HCl,pH8.80.5M Tris-HCl,pH6.810%(W/V)SDS10% ammonium persulfate(fresh)TEMEDTOTAL MONOMER25.0ml48.5ml25.0ml-1.0ml500l50l100ml
26、33ml40ml25ml-1.0ml500l50l100ml41.625ml31.875ml25.0ml1.0ml500l50l100ml50.0ml23.5ml25.0ml-1.0ml500l50l100ml1.3ml6.1ml-2.5ml100l50l10l10ml第一向IEF采取IEF方法（）。第二向SDS-PAGE电泳分离胶浓度为15，电泳条件为20V/gel 20min,80V/gel 2h。G-250胶体考染法染色。14 不同裂解缓冲液的比较Buffer 15M Urea 3g2M thiourea 1.52g100mM DTT 146.4mg0.4% CHAPS 40mg0.25
27、% SB3-10 25mgCarrier ampholyte 25l (40%)Bromophenol blue 20l (1%)0.25% Tween 20 25l10% Isopropanol 1.0ml12.5% Saturated isobutanol 1.25ml5% Glycerol 0.5ml加MilliQ水至 10ml Buffer 28M Urea 4.8g2M thiourea 1.52g100mM DTT 146.4mg0.4% CHAPS 40mg0.25% SB3-10 25mgCarrier ampholyte 25l (40%)Bromophenol blue 2
28、0l (1%)0.25% Tween 20 25l10% Isopropanol 1.0ml5% Glycerol 0.5ml加MilliQ水至 10mlBuffer 35M Urea 3g2M thiourea 1.52g20mM DTT 30.8mg2mM TBP 100l2% CHAPS 0.2g2% SB3-10 0.2g0.5% Carrier ampholyte 125l (40%)Bromophenol blue 20l (1%)0.25% Tween 20 25l10% Isopropanol 1.0ml5% Glycerol 0.5ml加MilliQ水至 10mlBuffer 49.5M Urea 5.7g2M thiourea 1.52g1% DTT 0.1g2mM TBP 100l4% CHAPS 0.4g0.2% Carrier ampholyte 50l (40%)Bromophenol blue 20l (1%)0.25% Tween 20 25l10% Glycerol 3.3ml (30%)10mM PMSF 500l (200mM)