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1、PCR 定义 ：聚合酶链式反应简称PCR（英文全称：PolymeraseChainReaction） 是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由变性、退火及延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断 原理：类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右时，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下
2、轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 步骤 ：标准的PCR过程分为三步： 1.DNA变性（90-96）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA 2
3、.退火（25-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。 3.延伸（70-75）：在Taq酶（在72左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5端3 端延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。临床应用用于治疗感染性疾病，肿瘤及遗传病感染性疾病PCR对感染性疾病的诊断。PCR对病原体的检测解决了免疫学检测的“窗口期”问题，可判断疾病是否处于隐性或亚临床状态。定量PCR研究表明，病原体数量与感染性疾病病情的轻重程度、传染性及治疗效果均有相关性。肿瘤癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期和良性的阶段就可出现。PCR技术不但能有效的
4、检测基因的突变，而且能准确检测癌基因的表达量，可据此进行肿瘤早期诊断、分型、分期和预后判断。几乎所有慢性骨髓性白血病患者都可检测到原癌基因易位导致的BCR/ABL融合基因形成，定量PCR技术可通过检测BCR/ABL融合基因的表达确定微量残余恶性细胞存在的数量，以此作为治疗效果和估计复发的危险性的依据。遗传病PCR技术首次临床应用就是从检测镰状细胞和-地中海贫血的基因突变开始的。基因的突变和缺失均会引起各种珠蛋白的表达不平衡，用FQ-PCR检测各种珠蛋白基因表达差异，是地中海贫血诊断的有效手段下面就PCR在生物学领域的应用简介如下：(1) 扩增各种蛋白的基因：可用于基因重组、蛋白表达、构建cDN
5、A文库，目前所用的基因工程生物产品，绝大多数为通过PCR方法而获得的目的基因。(2) PCR后的测序：可以很快地测出常规的PCR产物或单链的DNA序列。(3) 用于分子进化和种系发育的研究：因为在一些巨大分子的序列中含有足够的进化信息，通过PCR对其编码基因的扩增，并与较近或较远的种系比较，研究其分子进化及种系发育是很有用的。(4) 分析和诊断遗传性疾病：根据其基因的缺失或突变对其做出诊断。如苯丙酮酸尿症、地中海贫血等有特定的遗传性基因，可以做出明确的诊断。(5)对人类HLA基因的多肽性分析，用于器官移植的配型。对于某些基因突变，如肿瘤发生的研究等均很有用。Western Blot：概念：We
6、stern免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。原理：原理与Southern Blot或Northern Blot杂交方法类似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫
7、反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。操作步骤（一）蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4，13,000g离心15min。取上清液作为样品。（二）电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。（三）转移：（半干式转移）1、电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min3次。2、膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。3、转膜：转膜装置从下至上依次按阳极
8、碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源,恒流1mA/cm2，转移1.5hr。转移结束后，断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。（四）免疫反应：1、用0.01M PBS洗膜，5min 3次。2、加入包被液，平稳摇动，室温2hr。3、弃包被液，用0.01M PBS洗膜，5min3次。4、加入一抗（按合适稀释比例用0.01M PBS稀释
9、，液体必须覆盖膜的全部），4 放置12hr以上。阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。5、弃一抗和1%BSA，用0.01M PBS分别洗膜，5min4次。6、加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（按合适稀释比例用0.01M PBS稀释），平稳摇动，室温2hr。7、弃二抗，用0.01M PBS洗膜，5min4次。8、加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。注意事项1、一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。2、显色液必须新鲜配置使用，最后加入H2O2。3、DAB有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细。蛋白质电泳技术：1、 醋酸纤维素薄膜电泳 ：醋
10、酸纤维素薄膜电泳是以醋酸纤维素薄膜为支持物，它是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而制成。醋酸纤维素膜薄是一种细密而又薄的微孔膜。醋酸纤维素膜对样品的吸附性较小，因此，少量的样品，甚至大分子物质都能得以较高的分辨率。又由于醋酸纤维素薄膜亲水性较小，故电渗作用也较小，并且它所容纳的缓冲液也较少，因此电流的大部分由样品传导，可以加速样品分离，大大节约电泳时间。醋酸纤维素具有操作简单、快速、价廉、定量容易等优点。目前醋酸纤维素薄膜电泳己广泛应用于科学实验、生化产品分析和临床化验，如分析检测脂蛋白、糖蛋白、脱氢酶、多肽、核酸及其他生物大分子，为心血管疾病、肝硬化及某些癌症鉴别诊断提供了可靠的依据，
11、因而已成为医学和临床检验的常规技术。2、 琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳是一种以琼脂糖凝胶为支持物的凝胶电泳，其分析原理与其它支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。琼脂糖凝胶具有网络结构，直接参与带电颗粒的分离过程，在电泳中，物质分子通过空隙时会受到阻力，大分子物质在泳动时受到的阻力比小分子大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅依赖于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大地提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的
12、强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象。所以常用于血清蛋白、血红蛋白、脂蛋白、糖蛋白等同工酶的分离和鉴定，为临床某些疾病的鉴别诊断提供了可靠的依据。与免疫化学反应相结合发展成为免疫电泳技术，用于分离和检测抗原。3、 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ：聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂又称为共聚体的N,N-甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）在加速剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称PAGE)。应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物大分子的分离、定性、定量及少量的制备，还可测定分子量、等电点等。 4、 等电聚焦电泳 ：等
13、电聚焦电泳是利用具有pH梯度的电泳介质来分离等电点(pI)不同的蛋白质的电泳技术。基本原理是在制备聚丙烯胺胶凝胶时，在胶的混合液中加入载体两性电解质。含有载体两性电解质的凝胶，当通以直流电时，载体两性电解质即形成一个从正极到负极连续增加的pH梯度。如果把蛋白质加人此体系中进行电泳时，不同的蛋白质即移动并聚焦于相当其等电点的位置。好的载体两性电解质应具有以下特点：在等电点处有足够的缓冲能力，不易被样品等改变其pH梯度；必须有均匀的足够高的电导，以便使一定的电流通过；分子量不宜太大，便于快速形成梯度并从被分离的高分子物质中除去；不与被分离物质发生化学反应或使之变性等。 等电聚焦电泳与其它区带电泳比
14、较具有更高的分辨率，等电点仅差0.01pH的物质即可分开；具有更好的浓缩效应，很稀的样品也可进行分离，并且可直接测出蛋白质的等电点。所以此技术在高分子物质的分离、提纯和鉴定中的应用日益广泛。但是等电聚焦电泳技术要求有稳定的pH梯度和使用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质易发生沉淀。DNA电泳技术：用于分离，鉴定和纯化DNA片段方法主要有：1. 琼脂糖凝胶电泳：分离范围大50-百万Bp的DNA均可以分离。水平方位，恒定强度和方向的电场。2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳：适合分离小片段DNA（5-500BP），制备比较复杂，垂直方向进行。3. 脉冲场电泳：两个电场交互，电场方向有一定角度，可以分离非常大的片段
15、。DNA电泳与蛋白质电泳区别：DNA电泳一般使用的都是琼脂糖凝胶电泳，电泳的驱动力靠DNA骨架本身的负电荷。 蛋白质电泳（一般指SDS-PAGE）一般使用的都是聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳的驱动力靠与蛋白质结合的SDS上所携带的负电荷。 所以相同点就是样品都是带负电荷的，从负极向正极移动，移动的距离都和样品的分子量有关。而且这两个电泳体系可以互相交换使用。进行大分子蛋白质电泳时，可以考虑换用琼脂糖凝胶，因为该体系孔径大。相反，如果需要精确到各位数碱基的DNA电泳也可以使用聚丙烯酰胺凝胶系统，因为使用该系统可以将相差一个碱基的两条DNA链分开。 不同点首先是样品不同。其次是结果的观察方法不同。DNA
16、电泳普遍使用EB做染料，在紫外灯下观察；而蛋白电泳使用的考马斯亮蓝染色，还需要经过脱色步骤。还有就是胶体系的差别，DNA电泳通常是一胶跑到底，而蛋白质电泳则会有分离胶和浓缩胶之区别。 电泳中样品移动的本质确实是样品所携带的电荷。但是，区分这些条带直接可以用分子量而无需使用电荷数，是因为这些样品的电荷/分子量比都是恒定的了。变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。最初是Lerman 等人于20 世纪80 年代初期发明的，起初主要用来检测DNA 片段中的点突变。Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究 。后来又发展出其
17、衍生技术，温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）。原理：双链DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。不同长度的DNA 片段能够被区分开，但同样长度的DNA 片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。DGGE/TGGE 技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA 片段区分开来。一个特定的DNA 片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域(meltingdomain, MD)和解链行为。当变性剂浓度逐渐增加达到其最低的解链
18、区域浓度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链。当浓度再升高依次达到各其他解链区域浓度时，这些区域也依次发生解链。直到变性剂浓度达到最高的解链区域浓度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA 完全解链。不同的双链DNA 片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域及各解链区域的解链浓度也是不一样的。当它们进行DGGE时，一开始变性剂浓度比较小，不能使双链DNA 片段最低的解链区域解链，此时DNA 片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样。然而一旦DNA 片段迁移到一特定位置，其变性剂浓度刚好能使双链DNA 片段最低的解链区域解链时，双链DNA 片段最低的解链区域立即发生解链。部分解链的DNA
19、 片段在胶中的迁移速率会急剧降低。因此，同样长度但序列不同的DNA 片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链浓度，因此它们会在胶中的不同位置处发生部分解链导致迁移速率大大下降，从而在胶中被区分开来。然而，一旦变性剂浓度达到DNA 片段最高的解链区域温度时，DNA 片段会完全解链，成为单链DNA 分子，此时它们又能在胶中继续迁移。因此如果不同DNA 片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开来。在DNA 片段的一端加入一段富含GC 的DNA 片段（GC 夹子，一般30-50 个碱基对）可以解决这个问题。含有GC 夹子的DNA 片段最高的解链区域在GC 夹子这一段序列处，
20、它的解链浓度很高，可以防止DNA 片段在DGGE 胶中完全解链。简略版（在现代遗传学中DNA 序列突变的分析占有十分重要的地位。由于在较大DNA 序列中检测一个细微的突变非常困难，因而现在人们建立了几种方法来解决这一难题。变性梯度凝胶电泳(DGGE)能把长度相同而核苷酸顺序不同的双链DNA 片段分开。这种方法利用了DNA 分子从双螺旋型变成局部变性型时电泳迁移率会下降的现象。不同的DNA 片段发生这种变化所需梯度不同。DGGE 的凝胶中沿电场方向变性剂(甲醛和尿素)含量递增，当DNA片段通过这种变性剂递增的凝胶时，不同分子的电泳迁移率在不同区域会发生降低。这就可使核苷酸顺序不同DNA 片段分开
21、。此方法可作为测序的初始步骤在杂合个体中分离等位基因。许多研究表明变性递度凝胶电泳分离能力很强，它可以把相差仅1bp 的DNA 片段分开。）实验步骤1PCR反应（同前）其中，上游引物加40bp GC Clamp。2PCR产物经琼脂糖凝胶电泳确认。3垂直变性梯度凝胶电泳变性梯度递增的方向与电泳方向垂直。所使用的胶为6%聚丙烯酰胺凝胶，变性浓度为0100%。其中，含7 M尿素和40%去离子甲酰胺的胶为100%变性，不含尿素和去离子甲酰胺的胶为0%变性。垂直变性梯度凝胶电泳主要是检测引物的最适解链条件（即变性浓度）。PCR产物加上样缓冲液后上样，300400l/孔，电压150V，温度60，时间24小
22、时。4平行变性梯度凝胶电泳变性梯度递增的方向与电泳方向平行。根据垂直变性梯度凝胶电泳检测的解链区域的变性浓度，制备相应变性浓度的平行变性梯度凝胶，检测各标本是否存在突变。PCR产物加上样缓冲液后，25l30l/孔，电压150V，温度60，时间36小时。5染色5分钟，凝胶成像仪分析结果。注意事项1、该实验中提取DNA，以及DGGE操作中接触到得很多药品都有毒，还有致癌、变性等毒害，一定要严格操作，做好防护保护自己。2、严格按操作步骤Caspase（天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶）：是一组存在于细胞质中具有类似结构的蛋白酶。它们的活性位点均包含Cys残基，能够特异性的切割靶蛋白Asp残基后的肽
23、键。并且，caspase能选择性的切割某些蛋白质，从而造成细胞凋亡。与caspase有关的凋亡通路主要有两种：一种是死亡受体介导的信号传导途径，另一种是线粒体依赖途径。 死亡受体介导的信号传导途径:最具代表性的死亡受体是FADD(又名Fas或APO一11，是一种跨膜受体蛋白，既能与细胞外的CD95抗体及CD95配基结合。又能与细胞内的接头蛋白FADD结合，FADD的C端含有死亡域DD, N端含有死亡效应域DED。同时CD95及caspase-8分别含有DD及DED， 当死亡诱导信号CD95抗体或 CD95配基作用于CD95后，CD95的构象发生改变，通过其DD与FADD的DD结合, FADD又
24、通过DED与procaspase-8的DED结合共同形成死亡诱导信号复合物DISC，DISC形成后，可诱导 pmcaspase-8自身激活，产生活性的caspase-8a/b，活化的caspase-8则进一步激活下游的caspase-3, caspase-3激活后作用于特定的凋亡底物，引起细胞凋亡 。 总结Caspase:1.它是一种Cys蛋白酶，用Cys作为裂解底物的亲核基团2.其催化活性对底物的Asp有特异性要求，caspase以活性很低的酶原形式合成，通过蛋白酶水解去除氨基端的一段序列而被激活3.活化的caspase能够特异地水解一套地物，从而导致细胞凋亡，此过程为不可逆反应4.正常情况
25、下细胞内总存在有Caspase的抑制剂，以防止caspase酶原偶然被激活而对正常细胞造成损伤。（看已下载的相关PPT）1.蛋白质组学的定义及研究内容蛋白质组学(Proteomics)是研究在特定时间或环境下某个细胞或某种组织的基因组表达的全部蛋白质。蛋白质组学的真正含义在于：它不是按照传统的方式孤立地研究某种蛋白质分子的功能，而是应用各种蛋白质组学技术研究某种蛋白质在复杂的细胞环境中的功能。蛋白质组学旨在列出全部蛋白质的细目，弄清每一个蛋白质的结构和功能及蛋白质群体内的相互作用，对比在疾病和健康状态下它们的表达水平的变化。蛋白质组学分为表达蛋白质组学和细胞图谱蛋白质组学。前者利用各种先进技术
26、研究蛋白质表达的整体变化，即研究在机体的生长发育、疾病和死亡的不同阶段中，细胞与组织的蛋白质组分的变化；后者主要通过分离蛋白质复合物系统地研究蛋白质间的相互作用。研究蛋白质组方法：蛋白质组研究需要有足够的技术支撑，如质谱分析()，酵母双杂交系统，蛋白质微阵列技术以及能够进行大规模数据处理的计算机系统和软件等6。现阶段蛋白质组的研究可分为3个主要步骤：应用双向凝胶电泳、“双向”高效柱层析分离蛋白质；应用氨基酸组成分析、或末端氨基酸序列分析及质谱分析鉴定所分离的蛋白质；应用生物信息学数 据库对鉴定结果进行存储、处理、对比和分析。3.1双向凝胶电泳双向凝胶电泳(two-di mensionalpol
27、ycacrylamidegelelectrophoresis，2-D电泳)是分离蛋白质最基本的工具。其原理是：第一向是等电聚集电泳：用值呈梯度排列的凝胶，分离等电点不同的蛋白质。第二向是十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPEGE)：由于带负电荷的SDS可与蛋白质多肽链结合，掩盖了蛋白质原有的电荷差别，故可分离分子量不同的蛋白质。双向凝胶电泳不仅用于蛋白质的分离，同时也用于蛋白质的纯化，一张凝胶可分离纯化出几千个甚至上万个蛋白质。目前美国的Proteome公司已开发了一种全自动化的仪器，灌腔、电泳、染色全部实现自动化。双向凝胶电泳技术存在的问题是不易分离极酸或极碱、极大(200kD)或极小
28、(10kD)的蛋白质，不易检测低拷贝(1000拷贝)蛋白质或难溶解蛋白质。此外，还有三种新的方法可以用作对2电泳的补充：带有同位素的亲和性标签标记法，二维液相色谱串联质谱测量法，毛细管区带电泳。3.2“双向”高效柱层析“双向”高效柱层析原理：第一向用分子筛柱层析，按蛋白质不同分子量进行分离；第二向用反向柱层析，利用蛋白质表面疏水性质进行分离。第二向的分离原理与双向凝胶电泳中利用蛋白质等电点分离完全不同，因此两种方法可相互补充。双向高效柱层析的优点：(1)可分离得到较多的蛋白量以供鉴定；(2)可与质谱分析联用，分离流出的蛋白峰直接进入质谱仪进行鉴定。3.3氨基酸组成分析氨基酸组成分析可提供蛋白质
29、一级结构信息。原理是用酸水解蛋白质，测定蛋白质中各氨基酸所占摩尔百分数(%)或各氨基酸的摩尔比率，与数据库中已知蛋白质的理论值进行比较。氨基酸组成分析经济、快速，但灵敏度低。3.4-或-端氨基酸序列分析-端氨基酸序列分析常用Edman降解法测定蛋白质端氨基酸序列，端氨基酸序列分析常用羧肽酶法、化学降解法测定蛋白质端氨基酸序列。目前均可用自动测序仪。-端4个氨基酸残基序列即可鉴定43%83%蛋白质、-端5个氨基酸残基序列即可鉴定74%97%蛋白质，若两者结合使用，判断结果的准确性会更高。3.5质谱分析以往仅用于小分子挥发物质的分析，由于新的离子化技术的出现，如：介质辅助的激光解析/离子化、电喷雾
30、离子化，各种新的质谱技术开始用于生物大分子的分析。其原理是：通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(/值)的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的/值，分析鉴定未知蛋白质。质谱技术主要用于检测双向凝胶电泳或“双向”高效柱层析分离所得的蛋白质及酶解所得的多肽的质量，也可用于蛋白质高级结构及蛋白质间相互作用等方面的研究。三条肽段的精确质量数便可鉴定蛋白质。近年来，串联质谱分析仪发展迅猛，其数据采集方面的自动化程度、检测的敏感性及效率都大大提高，大规模数据库和一些分析软件(如：SEQUEST)的应用使得串联质谱分析仪可以进行
31、更大规模的测序工作。目前，利用2电泳及技术对整个酵母细胞裂解产物进行分析，已经鉴定出1484种蛋白质，包括完整的膜蛋白和低丰度的蛋白质。3.6酵母双杂交系统对于研究蛋白质间的相互作用，酵母双杂交系统是非常有力的工具。其基本原理是：由于所有真核生物转录激活因子都由两部分独立的功能域组成，即结合功能域()和激活功能域()。的作用是与特异的启动子结合，的作用是引导聚合酶复合物，两者靠近并协同作用，才能使结合位点下游的基因得以转录。如果将待测蛋白之一与融合，蛋白之二与融合，若待测的两种蛋白有相互作用，则和靠近并激活报道基因的转录，借此可研究蛋白质间的相互作用。为了大规模高通量研究蛋白间的相互作用，近年
32、来发展了一种酵母双杂交扫描法。首先建立两类含不同文库的酵母菌株，在第一类菌株中，读码框()以融合蛋白形成被表达，在第二类菌株中，以融合蛋白形式被表达，将两类菌株配对，用缺陷的培养基筛选二倍体，只有表达两种可以相互作用的蛋白质的酵母细胞才可以在该培养基上生长。该方法的应用模式有两种：一种是微阵列模式，即先将第一类酵母菌(表达已知蛋白-融合蛋白)克隆在阵列的栅状网孔内，以此筛查第二类菌株(表达待测蛋白融合蛋白)，从而确定待测蛋白质可与哪一已知蛋白质相结合；另一种是库筛查模式，即先将一组产生的融合蛋白建成一个库，而后通过待测蛋白质与库中的蛋白质的反应寻找可以相互作用某个或某些蛋白质。最近，从酵母双杂
33、交系统衍生出一种新的方法，称为“反向双杂交”，主要用于鉴定可以干扰蛋白质间相互作用的化合物和多肽。与传统方式不同，这种方法可以用于开发在体内具有活性的药物。此外，酵母双杂交系统的作用已经扩展至对蛋白质的鉴定，通过这种方法已经发现与酵母菌剪接相关的15种蛋白质，以及噬菌体7的55种蛋白质、痘苗病毒的226种蛋白质、酿酒酵母的5345种蛋白质。酵母双杂交系统提供的蛋白质间可能的相互作用的信息，还需通过进一步的生物化学试验加以确定和排除。3.7微阵列技术严格的讲，微阵列技术并非蛋白质组技术的范畴，但是却不失为大规模研究蛋白质功能的一种好方法。通常在转录中受到协同调控的基因将编码同种功能的蛋白质，如果
34、某一段序列与已知功能的序列在很大程度上相同，说明它们编码的蛋白质的功能也可能相同，例如酵母细胞中与细胞分裂周期和芽孢形成相关的基因可能编码功能相同的蛋白质。蛋白质阵列技术已经发展起来，蛋白质样品以纳升小滴共价吸附在玻璃、硅、塑料等载物片上，每一个载物片可以点10000个样品，可用于鉴定一个生物有机体的全部修饰酶。例如：蛋白质微阵列技术已经检测出酵母中近乎全套的蛋白激酶。3.8生物信息学蛋白质组的研究要求有自动化处理大规模数据的工具，从而促使生物信息学迅速发展。目前许多与蛋白质组相关的软件可通过与EXPASY蛋白质组学服务器链接而获得(./.)，这些软件可用于鉴定蛋白质的种类，分析蛋白质的理化特
35、性，预测可能的翻译后修饰以及蛋白质的三维结构，其中注释蛋白质和二维凝胶电泳数据库是蛋白质组研究的生物信息学核心。4.蛋白质组学与疾病蛋白质组学可以让我们对人类疾病的发病机制有更加清楚的认识。在基因水平检测基因的突变和多态性，在蛋白质水平分析健康及病变组织不同水平的基因表达，对于疾病的发病机制的研究二者均具有重要意义，但对于疾病的诊断治疗方面后者更为重要。正常及患病个体的组织、体液中的蛋白质分布、特征及差异都是将蛋白质组学技术应用于分子诊断学的基础。例如：骨髓瘤患者尿液中沉淀物?BenceJones蛋白、抗上皮细胞肿瘤特异性抗体、病变肝细胞中的53蛋白均可以作为肿瘤的标记，用于肿瘤的诊断。目前，
36、应用蛋白质组学技术已发现许多与癌症相关的异常糖基化的蛋白质，但将这些研究结果应用于临床诊断其价值尚待评估。到目前为止，心功能障碍的发病机制仍未阐明。如果用蛋白质组学的研究方法分析心肌蛋白质表达的变化，将为阐明心脏疾病相关的细胞病变机制提供新的思路，也将有助于发现新的诊断标记、治疗方法。人类心脏蛋白质联合二维电泳数据库(./.)已建立，目前已鉴定几百种心脏蛋白质。对于感染性疾病而言，由于许多微生物的部分或全部基因组的测序工作已经完成，这将有助于鉴定该微生物所产生的全部蛋白质，以寻找新的诊断标记，寻找用作疫苗的抗原及毒力决定簇等。5.蛋白质组与药物开发药物作用的靶标多为蛋白质。如何发现更多的药物作
37、用的靶蛋白是药品开发面临的主要挑战。蛋白质组研究能发现那些在健康人组织细胞中正常表达或不存在，而在患者组织细胞中异常表达或出现的蛋白质，为药品开发提供新的药物靶标，或新的生物标记，还能发现与药物毒性相关的蛋白质，用于预报药物的毒副作用，从而减少到临床试验阶段才发现该药物的副作用所造成的中间阶段的损耗。除了药物作用的靶蛋白的选择外，观察药物对靶蛋白的作用及药物毒性的研究也同样重要。在这一研究领域中，可采用CD-标记(CD-tagging)技术研究用药期间蛋白质组中的任一成员在分子和细胞水平的各种变化。其原理是将带有CD-tagging的CD盒插入某一个表达基因的内含子，结果该基因转录的增加了一段
38、外来序列，该基因编码的蛋白质增加了一个特殊的外来肽?抗原决定簇或荧光蛋白，这种外来肽作为标记物，可用高效价的抗体识别或各种荧光检测方法观察，标记的基因及转录产物的变化可用多聚酶链反应()、逆转录多聚酶链反应()、测序等方法观察。因此，标记技术可用来研究基因的转录、翻译水平的变化，评估基因的功能状态，探查蛋白质表达的组织特异性，以及蛋白质在细胞或细胞器中的定位，等等。该项技术的特点是：(1)尤其适用于标记内含子丰富的基因；(2)被标记的基因、转录产物及蛋白质均保留正常的功能；(3)不影响基因的正常调控；(4)可在组织细胞原位观察研究标记基因、标记蛋白；(5)也可从组织细胞中分离提纯标记蛋白，然后
39、用于生化、功能检查。蛋白质组学正日渐走向成熟。相信对于未来医学的发展，无论是基础、临床研究，还是药物开发，蛋白质组学的贡献都将不可估量。蛋白质组学(proteomics) ：指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律蛋白质组学常用的研究方法：酵母双杂交系统、抗体芯片、LCM技术、mic Solution Inc、SPR技术、色谱分离技术、双相电泳技术、有机质谱等等。 LCM技术获得的细胞可以用于蛋白质样品的制备。蛋白质样品中的不同类型的蛋白质可以通过
40、二维电泳进行分离。胶染色后可以利用凝胶图象分析系统成像，然后通过分析软件对蛋白质点进行定量分析，并且对感兴趣的蛋白质点进行定位。Genomic Solution可以为研究者提供除质谱外的所有蛋白质组学研究工具，包括二维电泳系统，成像系统及分析软件，胶切割系统，蛋白质消化浓缩工作站，点样工作站等；同时还可以提供相关试剂和消耗品。蛋白质相互作用的研究，酵母双杂交和噬菌体展示技术无疑是很好的研究方法。LCM-二维电泳-质谱的技术路线是典型的一条蛋白质组学研究的技术路线，除此以外，LCM-抗体芯片也是一条重要的蛋白质组学研究的技术路线。版本二：【一 双向电泳。双向电泳(2-DE)与质谱(MS)的结合是
41、最常见的蛋白质组学的研究手段。双向电泳包括第一向等电聚焦(IEF)和第二向SDS-PAGE。双向电泳可以提供包含有分子量和等电点信息的二维图谱二 多维色谱法。在多维色谱法中，蛋白样品通常先被消化成肽段，然后经过离子交换、反相HPLC而被分离。该方法的中HPLC可以直接和质谱偶联，可有效的分析极酸或极碱、高度疏水等传统2-DE方法难以分析的蛋白质，而且易于实现分析的自动化。三 荧光差异凝胶电泳技术(DIGE)。DIGE可用三种不同的荧光染料来分别对样品进行标记，荧光染料可以通过酰胺键与蛋白质的赖氨酸-氨基共价结合。将标记的样品混合然后在同一块双向电泳凝胶上分离。这样在一块双向电泳凝胶上可获得三幅
42、图像，即在一块凝胶内分析不同的蛋白样品。DIGE有效地改善了传统2-DE的重复性。四 定量蛋白质组学方法： ICAT(isotope-coded affinity tags)方法。ICAT是用于定量蛋白质组学研究的稳定同位素标签法的一种。在稳定同位素标签法中，质谱可以通过识别标记的肽段和未标记的肽段之间的信号强度差异来达到定量的目的。在ICAT方法中，带有生物素半分子的同位素标签对样品中蛋白质的半胱氨酸残基进行标记，标记的蛋白样品经过消化成为肽段后，经阳离子交换色谱和亲和素亲和纯化，然后进入质谱鉴定。相同肽段在质谱上会表现为双峰，峰的强度直接反应了该肽段对应的蛋白质在两种样品中的相对强度。IC
43、AT的缺点是无法标记缺乏半胱氨酸残基的蛋白质、会丢失转录后修饰信息、相同肽段由于标记上的差异在HPLC中会产生不一致的洗脱表现以及增加的生物素基团会增加质谱解析的复杂性。 cICAT (cleavable isotope-coded affinity tags)。也是稳定同位素标签法，基于ICAT。cICAT采用了13C和酸性可裂解生物素而克服了ICAT的部分缺点。 iTRAQ 。iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)法可同时分析多达四个不同样品的，该方法不会丢失转录后修饰信息，因而可以用于信号转导中的蛋白质磷酸化
44、修饰的研究。蛋白质组学在生物医学方面的应用：主要包括几个方面:通过寻找差异表达蛋白质,以发现疾病相关的蛋白质;寻找用于诊断的疾病相关的标记分子;寻找疾病相关的蛋白质药靶,以用于药物设计;研究疾病的致病机理等。以下将对这几个方面进行简要的综述：常见的几种研究差异表达蛋白的蛋白质组学方法包括蛋白芯片技术、双向电泳技术、多维液相色谱技术以及它们和质谱鉴定的有机结合临床医药对人类而言，蛋白质组学的研究最终要服务于人类的健康，主要指促进分子医学的发展。如寻找药物的靶分子。很多药物本身就是蛋白质，而很多药物的靶分子也是蛋白质。药物也可以干预蛋白质-蛋白质相互作用。 在基础医学和疾病机理研究中，了解人不同发
45、育、生长期和不同生理、病理条件下及不同细胞类型的基因表达的特点具有特别重要的意义。这些研究可能找到直接与特定生理或病理状态相关的分子，进一步为设计作用于特定靶分子的药物奠定基础。生物信息学：生物信息学(Bioinformatics)是研究生物信息的采集，处理，存储，传播，分析和解释等各方面的一门学科，它通过综合利用生物学，计算机科学和信息技术而揭示大量而复杂的生物数据所赋有的生物学奥秘。蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平的标志和基础。瑞士的SWISS-PROT拥有目前世界上最大，种类最多的蛋白质组数据库。丹麦、英国、美国等也都建立了各具特色的蛋白质组数据库。生物信息学的发展已给蛋白质组研究提供了
46、更方便有效的计算机分析软件；特别值得注意的是蛋白质质谱鉴定软件和算法发展迅速。最近发展的质谱数据直接搜寻基因组数据库使得质谱数据可直接进行基因注释、判断复杂的拼接方式。随着基因组学的迅速推进，会给蛋白质组研究提供更多更全的数据库。另外，对肽序列标记的从头测序软件也十分引人注目。生物信息学基本概念早在1956年，在美国田纳西州盖特林堡召开的首次“生物学中的信息理论研讨会”上，便产生了生物信息学的概念。1987年，林华安博士正式把这一学科命名为“生物信息学”（Bioinformatics）。被尊称为“生物信息学之父”。生物信息学（Bioinformatics）：(1)生物信息学包含了生物信息的获取
47、、处理、储存、分析和解释等在内一门交叉学科，(2)它综合运用数学、计算机科学和生物学的各种工具进行研究，(3)目的在于阐明大量生物学数据所包含的生物学意义。生物信息学当前的主要研究任务蛋白质组学： （1）蛋白质组图像数据处理，蛋白及其修饰鉴定（2）构建蛋白质数据库，相关软件的开发和应用；（3）蛋白质结构、功能预测；（4）蛋白质连锁图。生物信息学的研究内容 生物信息学主要包括以下几个主要研究领域：1、序列比对（Alignment）。 基本问题是比较两个或两个以上符号序列的相似性或不相似性。序列比对是生物信息学的基础，非常重要。两个序列的比对有较成熟的动态规划算法，以及在此基础上编写的比对软件包B
48、ALST和FASTA，可以免费下载使用。这些软件在数据库查询和搜索中有重要的应用。有时两个序列总体并不很相似，但某些局部片断相似性很高。Smith-Waterman算法是解决局部比对的好算法，缺点是速度较慢。两个以上序列的多重序列比对目前还缺乏快速而又十分有效的算法。 2、结构比对。 基本问题是比较两个或两个以上蛋白质分子空间结构的相似性或不相似性。已有一些算法。 3、蛋白质结构预测，包括2级和3级结构预测，是最重要的课题之一。 从方法上来看有演绎法和归纳法两种途径。前者主要是从一些基本原理或假设出发来预测和研究蛋白质的结构和折叠过程。分子力学和分子动力学属这一范畴。后者主要是从观察和总结已知结构的蛋白质结构规律出发来预测未知蛋白质的