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1、3.3蛋白质组学研究3.3.1功能基因组与蛋白质组3.3.2蛋白质组研究方法3.3.2.1二维电泳蛋白质提取与样品制备3.3.2.2二维电泳与细胞蛋白质的分离3.3.3.3图像分析与细胞蛋白谱的建立人类基因组计划被誉为20世纪的三大科技工程之一。其划时代的研究成果人类基因组序列草图的完成，宣告了一个新的纪元“后基因组时代”的到来。其中，功能基因组学（functional genomics）成为研究的重心，蛋白质组学（proteomics）则是其“中流砥柱”。正因为如此，Nature、Science分别在2001年2月15日、16日公布人类基因组草图的同时，分别发表了“And now for t
2、he proteome”（Nature 409：747，2001）、“Proteomics in genomeland”（Science 291：1221，2001）的述评与展望，将蛋白质组学的地位提到前所未有的高度，认为是功能基因组学这一前沿研究的战略制高点，蛋白质组学将成为新世纪最大战略资源人类基因尤其是重要功能基因争夺战的重要“战场”。以人类基因组计划为工程的基因组计划是20世纪仅次于曼哈顿原子弹研制计划与阿波罗登月计划的重大科技工程。其中，HGP旨在完成人基因组24条染色体上5万左右基因的作图(遗传图与物理图)和30亿碱基的DNA全序列的测定。此计划自1990年实施以来进展神速：199
3、4年人基因组全套遗传连锁图发表，1995年全基因组覆盖率高达94的物理图问世；同年，汇集了人基因组初步全物理图，3、12、16、22号染色体高密度物理图以及30余万左右cDNA(EST)序列信息的“人基因组指南”经Nature结集出版3；2000年6月26日，宣告人类基因组序列草图测定完成；2001年2月15日、16日，国际人类基因组计划与美国Celera公司分别在Nature、Science公布人类基因组草图4。与此同时，模式生物与致病微生物等的基因组研究亦如火如荼地展开。自1995年支原体(Mycoplasma genitalium)和流感嗜血杆菌(Hemophilus influenza
4、e)基因组全序列发表5、6以来，已相继有10余种原核生物的基因组全序列发表，如大肠杆菌(K-12)7。更令人振奋的是，第一个真核生物酵母的基因组全序列于1996年完成8，次年，Nature再次推出(酵母基因组指南)专辑。此外，多细胞真核生物线虫(Caenorhabditis elegans)的全基因组序列测定也取得长足进展。截至2001年底，已有不少于75种生物的基因组全序列测定完成。一、蛋白质组研究的开端 “proteome(蛋白质组)一词由Marc Wilkins于1994年在意大利Siena的一次2-DE电泳会议上首次提出。其导师澳大利亚Macquarie大学的。Keihh Willia
5、ms于同年向澳政府提出一项建议；通过对某一种生物的所有蛋白质全部进行质谱筛选与序列分析，以一种不同于DNA快速测序的途径对其提供分子水平的全面分析。1995年，悉尼大学Humphery smith I实验室与Williams等辱家实验室合作，对至今已知最小的自我复制生物Mycolasma genitalium（一种支原体)进行了蛋白质成分的大规模分离与鉴定，并在文献中首次公开使用“pro-teome”一词，同时指出该文所采用的技术体系对于大规模鉴定并分析基因对应的产物以及发现新型蛋白均具有十分重要的意义1。二、蛋白质组的含义根据Wilkins MR等24的定义，“proteome”一词源于“P
6、ROTEin”与“genOME”的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”：Swinbanks3则指出“proteome”代表一完整生物的全套蛋白质。与此同时，Kahn P则认为“proteome”反映不同细胞的不同蛋白质组合2。由此可见，“proteome”有三种不同的含义：一个基因组、一种生物或一种细胞组织所表达的全套蛋白质。三、蛋白质组研究的技术路线与相关技术一般细胞含有数千种乃至上万种蛋白质。蛋白质组研究的宗旨是将组织或细胞所有蛋白质(至少是大部分)。分离与鉴定。为达到目的，它引进了下列技术21：双向电泳(2-DE)，如ISO-DALT、tPG-DALT或NEPHGE；图像分析系统，
7、如ELSIE 4 8、gellab工、：MELANIE r、QUEST工与PDQlUEST、TYCHOKEPLAR；蛋白质鉴定方法，如氨基酸组成分析、序列测定、肽质量指纹图peptide mass fingerprinting，PMF)二相对分子质量精确测定；HTS(high throughput systern)系统与大规模样品处理机器人；数据库设置与检索系统25，其中，蛋扫质鉴定采用了新近出、现的新型质谱(MS)技术，如MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption ionisation-time Of flight)MS与ESI(electrospr
8、ay ionisation)/MS/MS。大规模蛋白质组分析过程包括样品制备、图像分析、蛋白质成分的分析与鉴定。其技术路线及数据处理见有关章节。其中“层次分析”(hierarchial analysis)包括26：氨基酸分析、肽质量指纹图、氨基酸分析与PMF联合、序列标签途径、N端Edman降解蛋白与微量测序、蛋白质内肽微量测序、MS(MALDITOF，ESl)微量测序、“Ladder”测序、MS对PVDF膜或电泳胶上低拷贝分子的系统筛选、基因组文库中克隆片段的倾向性表达。蛋白质组的研究远比基因组研究复杂。一方面，蛋白质的数自远大于基因的数目，这是由于基因的拼接和翻译后的修饰造成的。人的基因组
9、有，25 00040 000个编码基因1，其表达的蛋白质可以达十几万甚至更多。另一方面，基因是相对静态的，一种生物体仅有一个基因组，而蛋白质是动态的，随时间、空间的变化而变化。一个细胞中的蛋白质可多达上万种，而它们的拷贝数可能相差几百倍到几十万倍。组成蛋白质的氨基酸有20种，加上修饰的氨基酸就更多，而DNA仅由4种核苷酸组成。从技术手段上讲，人们无法采用在基因研究中所普遍采用的PCR技术来使微量的蛋白质得到扩增，至今尚没有一种蛋白质的测序技术可与在基因组研究中起关键作用的自动化的DNA测序技术相媲美。DNA微阵列技术的发展与应用，使得基因的筛选实现了高通量，而目前的蛋白质分析技术离工业规模的高
10、通量还有较大差距。所幸的是，尽管核酸研究的技术近年来取得了突飞猛进的发展，蛋白质的研究技术并未停滞不前。由OFarrel等在1975年建立的双向电泳技术(di-mensional electrophoresis，2-DE)可同时分离数千种蛋白，20世纪80年代固相化pH梯度凝胶的引进使得双向电泳的重复性和加样量得到巨大的改善，从而使今天的蛋白质组研究得以实施3。以计算机技术为基础的多种图像分析与大规模数据处理软件的问世，使得科学家们处理复杂的类似“满天星”样的蛋白质图谱并建立相应的数据库得心应手。80年代后期出现的两种软电离质谱技术基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix assiste
11、d laser desorption ionization”time of flight masss pectrometry，MALDI-TOF-MS)4与电喷雾电离质谱（electro-spray ionization masss pectrometry，ESI-MS），可精确测定生物大分子的相对分子质量及多肽序列，使得微量快速的蛋白质鉴定得以实现。回想10年以前，二个蛋白质化学家一年鉴定23个蛋白质，而现在，蛋白质组研究技术加上基因组提供的信息使得一个科学家一个星期可以鉴定几百个蛋白质。表2-1 DNA分析（cDNA微阵列）与蛋白质分析（2-DE与质谱）方法的比较DNA蛋白质检测水平/灵敏
12、度DNA可用PCR技术扩增蛋白质无法被扩增检测限约为30拷贝/样本(transcripts)检测方法高度特异非特异DNA与其互被序列（DNA/RNA）的杂交能力使得DNA很容易固相化在靶上并用荧光探针检测。高密度阵列检测专用的扫描仪已经出现蛋白质可以用非特异的方法如蛋白染色或较特异的方法如抗体进行检测分子的稳定性DNA是非常稳定的，即使在提高温度的情况下也不丢失生物活性蛋白质在变性情况下将无效分蘖失天然功能。蛋白质需要格外小心以保持其天然构象重复性重复性好重复性不好将DNA固相化在表面已经是成熟的技术，加之DNA固有的稳定性，方法的重复性较好由于蛋白质分子的稳定性不好，方法的重复性需格外关注消
13、耗初始的投入是较大的（微阵列、扫描仪、共聚焦显微镜），但短期内得到的数据量相当大目前的蛋白质分析方法依赖昂贵的仪器设备（质谱仪、2-DE装置）专业化方法与相当标准化蛋白质的分析较困难。大部分分析工作如纯化与质谱分析等都需要受过训练的实验室人员来操作时间/自动化已成为高通量的扫描技术目前还不能达到工业需求的高通量翻译后装饰无法研究研究翻译后修饰的惟一方法是研究蛋白质本身动态范围5个数量级712个数量级 蛋白质组学的目的是实现对一个基因组所编码的全部蛋白质及其相互作用的研究。以简单的真核生物酵母为例，其基因组编码蛋白质为6145个。人类基因组约含28 00040 000个编码基因，其表达的蛋白质可
14、能达十几万。如何实现对细胞、组织或体液所含有的成千上万个蛋白质的有效分离，是蛋白质组研究所要解决的首要问题。理想的蛋白质分离方法首先要具备超高分辨率，能够将成千上万个蛋白质包括它们的修饰物同时分离并与后续的鉴定技术有效衔接。这种理想的分离方法还应当对不同类型的蛋白质，包括酸性的、碱性的、疏水的、亲水的，相对分子质量小的、相对分子质量大的均能有效分离。一、二维凝胶电泳技术二维凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)是目前惟一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术。2-DE是由OFarrell和Klose于1975年分别提出的2,17。在2-D
15、E中；蛋白质首先根据等电点的不同在一向等电聚焦电泳中分离，接着被转移到二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，再根据相对分子质量大小不同被分离。由于电泳装置的限制和载体两性电解质的特性，使得2-DE的重复性很差，很难制备大量重复性好的2-DE胶。20世纪80年代初期出现的固相化pH梯度(immobilizedpHgradient，IPG)等电聚焦电泳技术，使2-DE的重复性和上样量大大改善3，不同实验室之间的实验结果可以进行比较，加之后续的微量鉴定技术如Edman微量测序技术以及质谱技术灵敏度的提高，使得2-DE获得了广泛的应用，成为蛋白质组研究中首选的分离技术(详见第四章)。 大部分蛋白质是低丰度蛋白
16、质，而低丰度蛋白质往往是执行重要生物功能的蛋白质，如调控蛋白、信号转导蛋白和受体蛋白等。对酵母基因组和蛋白质组研究的结果显示，密码子偏性系数(codon bias index，CBl)小于0.2的基因编码的蛋白质为低丰度蛋白质，酵母基因组编码的全部6000多个蛋白质有一半的密码子偏性系数小于0.2，其中2500个编码基因的CBI小于0.1。这些蛋白质在传统的2-DE上是看不到的1181。尽管使甩窄范围pH胶条和加大上样量可适当提高低丰度蛋白的检出，但由于2-DE胶的上样量受到胶的负载量的限制，因而不可能无限制加大上样量。蛋白质的检出限与染色方法、起始加样量之间的关系见表 表2-2 蛋白质的检出
17、限与染色方法、起始加样量的关系17银 染a考马斯亮蓝染a蛋白质的丰度蛋白质的量细胞数蛋白质的量细胞数拷贝数/细胞mgbmgb1020.0731.21092007.31.210111002.0071.2108200.71.2101010000.2011.210720.11.210910 0000.0201.21062.01.2108100 0000.0021.21050.21.2107a 银染蛋白质的检测限为1ng，考染蛋白质的检测限为100ng。b以6107个细胞得到1mg可溶酵母蛋白计算。蛋白质的分子质量以50kDa计算。造成低丰度蛋白很难被检测到的原因主要是由于高丰度蛋白质的干扰和低丰度蛋
18、白质的低溶解度。大部分基于2-DE的蛋白质组研究方法都采用“一步法(one-extract-one-gel)”，即一步提取的细胞总蛋白在一块胶上进行电泳分离。这种方法所能识别和检测到的大部分是高丰度的蛋白质。采用窄范围的IPG胶条(23个pH单位)和非常窄范围的IPG胶条(约1个pH单位)，增加了电泳胶的分辨率，加大了样品负载量，使得一些原先观察不到的蛋白质可以被观察到。但是由于样品中相当数量的蛋白质的等电点超出了胶条的pH范围，因而无法达到聚焦并沉淀在胶条的两端，从而大大影响了一向等电聚焦电泳的质量。另外仍需要将高丰度蛋白质去除，以避免高丰度蛋白质对低丰度蛋白检测的干扰。膜蛋白是一些疏水性的
19、蛋白质。当采用常规的2-DE方法进行分离时，由于膜蛋白在常规提取液中的低溶解度，另外因聚焦而产生浓缩、聚集，使膜蛋白很难溶解并进入二向SDS-PAGE电泳，因而很难被检测到。对全细胞蛋白质采用预分离(pre-fractionation)是提高低丰度蛋白质和膜蛋白检出限的有效方法。一种是被称为“分步提取法(sequential extraction)”的蛋白质预分离技术，其原理是基于蛋白质的溶解度不同，采用3种不同的提取液对全细胞蛋白质进行分步提取和分别电泳(图2-2)。采用分步提取法对细胞总蛋白进行预分离，实际上是在2-DE根据蛋白质等电点和分子质量不同进行二维分离的基础上，增加了溶解性能不同
20、的第三维分离。我们的实验结果显示，采用三步法，观察到的蛋白质点增加了约20，很多低丰度的蛋白质可以被观察到；特别是一些疏水性的蛋白质19。 另一种对蛋白质采用预分离的方法称为“多间隔电解法(multi-compart-ment -electrolyser)”20则。此种方法实质上是一种制备等电聚焦的方法。电泳装置由中间的聚焦室和两端的电极室组成。聚焦室由隔膜分成多个样品室。电极室内装电极液，由阴阳离子交换膜将电解质与样品分开。操作时，将预分离的蛋白质混合物放进聚焦室中，随着等电聚焦电泳的进行，混合物中的蛋白质根据各自的等电点不同而聚焦到相应的样品室中并被分别收集。将经过此种预分离的蛋白样品采用
21、窄范围IPG胶条进行2-DE分离，与未经预分离样品的2-DE谱相比，分辨率和胶的质量均明显改善。2碱性蛋白质的分离与检测碱性蛋白质在传统的2-DE中很难被分开。这主要是由于商业化的IPG胶条的pH范围通常在310。等电点超过10的蛋白质很难被分开。这个问题由于IPG胶条的pH范围目前已经扩大到12而获得部分的解决。另一个影响碱性蛋白质分离与检测的原因，是由于大部分细胞提取物是酸性蛋白质，而酸性蛋白质在碱性pH梯度胶上不能很好地溶解，特别是在上样量较大的情况下。可以通过将酸性蛋白质去除的办法改善碱性蛋白质的分离与检测；如采用上述提到的样品预分离的方法，如制备等电聚焦预分离，可将碱性蛋白质富集，再
22、采用碱性pH梯度胶进行分离。3IPG胶条的改进为了提高2-DE的分辨率和蛋白质的检出率，对IPG胶条的改进研究一直在进行，新的胶条不断出现。一方面，胶条的pH范围在不断变窄，从最初的310发展到目前相差1个pH单位的窄范围IPG胶条。这些胶条的出现，不但大大改善了2-DE的分辨率，增加了上样量，从而提高了蛋白质的检出，而且可以针对不同样品选择不同的胶条，如酸性蛋白的分离，可选用pH35或47的胶条，而碱性蛋白质的分离可选用pH69的胶条。另外，胶条的pH范围也在不断扩大，如pH312的胶条的出现，改善了碱性蛋白质的分离。胶条的长度也有不同，有7cm、11cm、13cm、18cm和24cm。18
23、cm的胶条是目前普遍采用的一向IEF胶条，通常可达到2000以上蛋白质点的分辨率。这样的分辨能力显然不能满足对细胞中全部蛋白质，包括它们的修饰物进行分离的需要。使用24cm的胶条增加了分离的距离，提高了分辨率。目前已有采用40cm的胶条进行一向IEF分离的研究，结果证明是增加蛋白质分辨率和检出的有效方法21。在鼠的蛋白质组研究中，经样品预分离和特定细胞器预分离，采用40cm的IPG胶条，共获得27 752个蛋白质点，其中一块胶上的蛋白质点数达10 000个以上。4高通量与自动化蛋白质组研究的高通量需要研究体系的自动化。如何使2-DEMS为基础的蛋白质组技术体系自动化，是许多研究机构和生物技术公
24、司研究的重点。迄今为止，大量的研究和改进集中在2-DE后的样品处理和蛋白质的识别(图2-3)，如用于胶上蛋白质点切割的自动点切割仪，用于胶上蛋白质酶切、回收与点靶的自动样品处理机等。这些仪器的出现，大大减轻了2-DE后样品处理酌繁复的手工操作，缩短了时间，提高了效率，更重要的是提高了样品处理的重复性，避免了手工操作易产生的污染。另外，一种可同时运行12块胶的二向SDS-PAGE电泳槽已经研制成功并商品化，如Ettan Dalt II(Amersham Pharmacia)、Protean II xi(Bio-Rad)和Investigator(GenomicSolution)，使得二向电泳一次
25、可平行分析的样品数量与一向IEF电泳相匹配(一向电泳槽可平行进行12个样品的分析)，从而大大提高了2-DE分析的通量。一种被称为“分子扫描(molecular scanner)”的方法为以2-DEMS为基础的技术体系的自动化打开了思路22,23。该方法将一个固相化了胰蛋白酶的PVDF(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜插入2-DE电泳胶和另一个PVDF膜之间，后一个PVDF膜作为收集膜，当对上述体系进行电转印时，胶上的蛋白质在向第一个PVDF膜迁移的过程中被胰蛋白酶酶切，酶切肽段穿过带有固相化胰酶的PVDF膜，被第二个PVDF膜收集。收集膜可直接用于MALDI-T
26、OF-MS作肽质量指纹谱分析。该方法实现了2-DE电泳后的样品处理与质谱分析一体化，为整个2-DEMS技术体系的自动化打下了基础。该方法的不足之处在于膜上酶切质谱分析所获得的肽段数目低于目前常规方法所获得的肽段数，使蛋白质特别是翻译后修饰蛋白质的识别与鉴定效率受到影响。3.3.2.1二维电泳蛋白质提取与样品制备样品制备原则：1尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失。2细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶抑制剂可以防止蛋白的降解。3样品裂解液应该新鲜制备，并且分装冻存于80。勿反复冻融已制备好的样品。4通过超速离心清除所有的杂质。5加入尿素之后加温不要超过37，防止氨
27、甲酰化而修饰蛋白。第一节 细胞裂解的方法一、温和的裂解方法 1)渗透裂解：主要应用于血细胞、组织培养细胞；通常用低渗溶液悬浮细胞。 2)冻融裂解：常用于细菌、组织培养细胞；通常用液氮迅速冷冻细胞，随后在37融化，反复几次。 3)去污剂裂解：用去污剂溶解细胞膜、裂解细胞，释放其内容物；常用于组织细胞；通常用含有去污剂的裂解液重悬细胞，也可以直接用样品裂解液或重泡胀溶液进行裂解。另外，如果阴离子去污剂SDS用于裂解细胞，可以用含有兼性离子去污剂、非离子去污剂的裂解液稀释样品，也可以用丙酮沉淀以分离出SDS。 4)酶裂解法：某些细胞含有细胞壁，需要首先用酶来消化细胞壁。例如：用溶菌酶(1ysozym
28、e)来消化细菌的细胞壁；用纤维素酶(cellulase)和果胶酶(pectinase)消化植物；用溶细胞酶(1yticase)消化酵母细胞壁。此法常用于植物、细菌和真菌。通常这些酶在等渗溶液中处理细胞。二、剧烈的蛋白裂解1)超声裂解法：超声仪可产生超声波，通过切应力来裂解细胞。在剧烈搅拌的状态下会产生剪切效果，但需注意应最大可能减少热量和气泡的产生。此法常用于细胞样品。通常用迅速的超声重悬细胞，并在冰上冷却。2)弗氏压碎器(French Pressurecell)：在高压下迫使细胞穿过小孔径而产生剪切力，从而裂解细胞。此法常用于含有细胞壁的微生物，如细菌、酵母和藻类。通常将细胞悬液置于预冷弗氏
29、压碎器中，加压后收集粗提液。3)研磨法：用研钵或研杵研磨细胞，此法常用于固体组织、微生物。组织和细胞通常冻存于液氮中，随后研磨成粉状。可加少量石英砂研磨。4)机械匀浆法：常用于固体组织。匀浆器可用于破碎细胞或一些软组织；而混合器或一些研磨设备用于一些较大的组织。通常将组织切成小片，加入预冷的匀浆缓冲液(35倍于组织体积)，简单匀浆，通过过滤或离心获得裂解液。5)玻璃珠匀浆法：通常剧烈振荡的玻璃珠可以打破细胞壁，释放细胞内容物。此法常用于细胞悬液或微生物。用等体积的预冷裂解液重悬细胞，置于结实的管子里。每克细胞(湿重)加入13g玻璃珠，剧烈振荡1 min，冰浴1min。重复上述步骤。三、用蛋白酶
30、抑制剂防止蛋白裂解1)PMSF(苯甲基磺酰氟)：是一种不可逆抑制剂，常用浓度为1 mmol/L，灭活丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但是其局限在于可在水溶液中迅速失活，因此，现用现加效果较好；另外，在二硫苏糖醇(DTT)或者-巯基乙醇溶液中PMSF的抑制效果可能会减少，因此，在晚些时候可加入含巯基的试剂。2) 金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙酸、乙二醇双四乙酸(EDTA、EGTA）：通常应用1mmolL的工作浓度，通过螯合自由的金属离子来抑制金属蛋白酶活性。3) 肽蛋白酶抑制剂：亮抑酶肽(1eupeptin)，它是可逆性蛋白酶抑制剂，在含DTT的溶液中以低浓度的形式保持活性，抑制一些丝氨酸和半胱氨
31、酸蛋白酶的活性；胃蛋白酶抑制剂A，(pepstatin)，抑制天冬氨酸蛋白酶(如酸性蛋白酶)的活性；抑蛋白酶肽（aprotinin)，抑制许多丝氨酸蛋白酶；苯丁抑制素(bestatin)，抑制氨基蛋白酶。但是，这些蛋白酶抑制剂价格昂贵，而且它们是小肽片段，可能会出现在二维电泳图谱中，其中胃蛋白酶抑制剂A在pH=9的时候不能抑制蛋白酶。4) 甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮(TLCK），甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（TPCK)：通常作用浓度在0.10.15mmol/L，这些柑同的成分不可逆抑制许多丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。蛋白质的分步提取技术具体操作步聚如下：第一步：水溶液的提取：约515 mg细胞加入2ml
32、裂解液I（40mmol/L Tris）。反复冻融34个循环，加入适量的Dnase I和Rnase A，振荡混匀。离心收集上清液，冷冻干燥器中抽干后即为第一步提取物。第二步：含Urea/CHAPS/DTT溶液的提取：向第一步的沉淀中加入500l的裂解液II（8mol/L Urea, 4% CHAPS, 100mmol/L DTT,40 mmol/L Tris，0.5% Pharmalyte 3-10，20g/ml Dnase I和5g/ml RnaseA）。剧烈振荡混匀，离心收集上清即为第二步提取物。第三步：含硫脲/SB3-10/TBP溶液的提取：将上一步所余的沉淀用40mmol/L Tris清
33、洗后，加入200l裂解液III（5 mol/L Urea, 2mol/L thiourea, 2%SB3-10， 2mmol/L TBP, 40L Tris，0.5% Phar-malyte 3-10，20g/ml Dnase I和5g/ml Rnase A）。强裂振荡混匀，离心后收集上清，保存于-70（见图3-239）。分步提取法所采用裂解液的溶解性能是逐渐增加的。第一步裂解液只含有40mmol/L Tris，其余为去离子水，只溶解偏亲水性的蛋白质。 生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中，它们所带电荷的性质取决于溶液的酸碱度以及其他相互作用的因素如十二烷基硫酸钠所引起的酸碱度
34、的变化。在电场中，带电离子向正极或负极移动，迁移的方向和速度取决于这些离子所带的电荷和介质的阻力，这种迁移现象即称为电泳。迁移的原理可分为3类：根据分子大小和形状、分子所带电荷、或分子的其他生物学及物理化学特性。为减小电泳过程中由于发热和扩散效应所引起的分子区带扭曲和扩散，目前的电泳大多是在固定化的介质中将样品放入流动相中进行分离，而不采用完全自由态的溶液进行分离。根据所用介质种类不同，电泳可分为两类：纸、乙酸纤维素、薄层材料如硅胶、氧化铝、纤维素等，惰性程度较高，主要用于支持体系，且变形不大，用这些介质分离蛋白质，主要依赖于蛋白质的电荷密度；琼脂糖、淀粉及聚丙烯酰胺凝胶体系可变性较强且有一定
35、的扩散作用，但这些体系在分离蛋白质时，除依赖于蛋白质的电荷密度外，还与蛋白质的相对分子质量大小及分子尺寸相关，提高了对蛋白质的分辨能力。由于聚丙烯酰胺凝胶的凝胶孔径与蛋白质分子大小接近，能达到最好的分离能力，而且聚丙烯酰胺凝胶制胶方便，代价低，重现性好，凝胶透明，易于显色并观察，此外与下游蛋白质鉴定方法如免疫印迹、质谱鉴定等兼容性较好，因而使得聚丙烯酰胺凝胶成为首选的蛋白质分离介质1，2。 聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel，PAG)是通过丙烯酰胺(acrylamide)单体和双功能团交联剂如N，N/甲叉双丙烯酰胺(N，Nmethylene bisacrylamide，常称甲
36、叉丙烯酰胺)按一定比例混合，在有引发剂和增速剂存在下聚合而形成的交叉网状结构，丙烯酰胺单体聚合生成长链聚合物，甲叉丙烯酰胺的双功能基团和链末端的自由功能基团反应从而发生交联，形成网状结构。两个单体的常用物化属性见表41，两个单体和聚丙烯酰胺凝胶的交联结构见图4-13。表4-1 丙烯酰胺凝胶两个单体的常用物化属性属性丙烯酰胺N, N/甲叉双丙烯酰胺分子式CH2=CHCONH2（CH2=CHCONH）2CH2分子质量71.08154.17外观白色结晶粉末白色结晶粉末气味元无贮存密封、避光冷、密封、避光毒性中枢神经毒物中枢神经毒物根据分离目的不同，可以按不同浓度及比例来配制PAG胶。如：等电聚焦凝胶
37、只需按等电点不同分离蛋白质，而对凝胶按相对分子质量大小的筛分能力要求不高，用低浓度胶即可；在利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)分离蛋白质时，不仅要根据蛋白质的带电密度分离，而且还要根据被分离样品的相对分子质量大小设计相应浓度的PAG胶。不同浓度的凝胶，其机械性能、弹性、透明度、黏性及孔径大小均不同，这些性质取决于凝胶配制时的两个重要参数T和C。T是两个单体(丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺)的总百分浓度，C是甲叉丙烯酰胺占两个单体总重的百分含量。具体计算公式如下：这里a为丙烯酰胺的质量(g)，b为甲叉丙烯酰胺的质量(g)，m为凝胶聚合前的溶液体积(m1)。T和C的值是很关键的。一般的
38、蛋白分离胶T值分布在5到30之间，T值太小凝胶黏度增加，难以处理，太大则凝胶脆性增加，容易破裂。C值一般在3左右，适合于大多数的蛋白质分离。根据我们的经验，第二向电泳要分离蛋白混合物，固定C值为2.6(0.830)，预实验时取T值为13，随后根据目的蛋白的相对分子质量来调整T值，会获得比较满意的结果。 Smithies和Poulikt5(1956)最早引入了二维电泳技术，他们将纸电泳和淀粉凝胶电泳结合来分离血清蛋白质。随后二维电泳技术经历了更多的发展6，并将聚丙烯酰胺介质引入应用，特别是等电聚焦技术在一向的应用，使基于蛋白质电荷属性的一向分离成为可能。目前所应用的二维电泳体系是由OFarrel
39、l等首先于1975年发明7，其原理是根据蛋白质等电点和相对分子质量的特异性，将蛋白质混合物在第一个方向上按照等电点高低进行分离(等电聚焦)，在第二个方向上按照相对分子质量大小进行分离(十二烷基硫酸钠聚丙唏酰胺凝胶电泳，SDS-PAGE)(图4-2)。在最好状态下，传统等电聚焦技术和SDS-PAGE在20 cm左右长度的凝胶中可在各自方向上分辨出100个不同的蛋白质条带，因此，理论上的二维电泳分辨能力可达到10 000个点。目前已有实验室在30cmX40cm的大胶上获得这一分离效果。考虑到大多数实验室并不具备运行这种大胶所需要的条件，普通情况下的凝胶(20cm20cm)分辨到3000个点已是相当
40、不错。但利用特殊的样品制备方法如三步提取或亚细胞器提取，以及下文将要提到的窄范围等电聚焦胶条，都可大大提高二维电泳的分辨能力。二维电泳分离后的蛋白质点经显色方法如考马斯亮蓝染色、酸性银染、碱性银染、负性染色、荧光染色或放射性标记等染色处理后；通过图像扫描存档，最后呈现出来的是在二维方向排列的呈“满天星“状排列的小圆点，其中每一个点代表一个蛋白质。图4-3是我们分离得到的HL-60细胞裂解蛋白质的二维电泳图谱，从该图谱可以初步得到该细胞内蛋白质的分布范围(偏酸性或偏碱性)、表达蛋白质的个数(凝胶点的数目)、蛋白质的大概相对分子质量、等电点（通过相对分子质量和等电点分析校正）、蛋白质相对表达丰度(
41、点的灰度值)。需要说明的是，由于在电泳过程中涉及到亚基内或亚基间二硫键的还原和烷基化处理，亦即高级结构的去除，因此，通过二维电泳分离所得到的实质上是构成蛋白质的各个亚基，而非完整的功能蛋白质。二、一维等电聚焦电泳 蛋白质是由20种不同氨基酸按不同比例通过肽键的连接构成的。由于构成蛋白质的一些氨基酸侧链在一定的pH值的溶液中是可解离的，从而可带有一定的电荷。如酸性氨基酸天冬氨酸和谷氨酸在酸性条件下，其末端羧基将只带一个质子而呈中性状态，但在碱性条件下，末端羧基将失去一个质子而带负电。而碱性氨基酸精氨酸、赖氨酸的氨基和组氨酸的咪唑基在酸性条件下则结合质子而带正电，碱性条件下，这些质子解离，残基呈中
42、性。构成蛋白质的所有氨基酸残基上所带正负电荷的总和便是蛋白质所带的静电荷。在低pH条件下，蛋白质的静电荷为正；而在高pH条件下，其静电荷为负。若在某一pH值的溶液中，蛋白质的静电荷为零，则此pH值即为该蛋白质的等电点(p1)。由于不同蛋白质有着不同的氨基酸组成，所以蛋白质的等电点取决于其氨基酸组成，是一个物理化学常数。不同蛋白质的等电点分布范围很宽，如某种糖蛋白的等电点值可低至1.8，而溶菌酶的等电点值可高达11.7。把蛋白质加入到含有pH梯度的载体时，如果蛋白质所在点的pH值与其等电点不符，则该蛋白质会带一定量的正电荷或负电荷。在高于其等电点的位置时，蛋白质带负电，反之带正电。此时，如果外加
43、一个强电场，蛋白分子会在电场作用下分别向正极或负极漂移，当达到其等电点位置时，蛋白不带电，就不再漂移，这就是等电聚焦电泳的基本原理。一、lEV凝胶制备 根据以上原理，早期的等电聚焦以低浓度聚丙烯酰胺凝胶为介质，在外加电场的该介质中，连续排列着从正极到负极pI值逐渐增加的合成载体两性电解质(synthetic carrier ampholyte，SCA)。载体两性电解质是一些可溶性的两性小分子，它们在其pI附近有很高的缓冲能力。当电压加在载体两性电解质混合物间时，最高pI值的分子(带最多正电荷)移向负极，最低pI值(带最多负电荷)的分子移向正极，其余分子将根据其pI值在两个极值之间分散，从而形成
44、一个连续的pH梯度。根据等电聚焦的基本原理，当蛋白混合物加入到固相介质中并处于外加电场下，各个蛋白质将在迁移至与其等电点相同的pH位置时停止移动，一旦偏离该位置，该蛋白质将带与其偏离方向相同的电荷，因而向另外一个方向移动，直至达到动态平衡，从而实现根据等电点不同而在电荷方向的分离。载体两性电解质的引入是等电聚焦技术的一大突破，但该技术仍然存在以下几点缺陷：1)由于SCA是通过复杂的合成过程得到的，其重复性很难控制，由此不同制备批次之间会存在相当大的变化，从而使一向分离时，同一蛋白质在不同批次等电聚焦中所出现的位置有所偏差。这样就限制了2-DE分离的重复性。 2)SCA分子相对较小，难以在IEF
45、胶内固定，在IEF过程中由水合正离子引起的电渗流(electroendosmosis)将致使SCA分子向负极迁移(负极漂移)，结果会使pH值不稳定性增加。当利用管状IEF胶时，由于玻璃毛细管壁表面的硅羟基带负电，与这些负电荷基团对应，将在管胶表面聚集一层正电荷形成双电层，这种作用加剧了负极漂移。 3)由于负极漂移作用对碱性区蛋白质的影响尤其严重，结果常会导致碱性区蛋白质难以成功聚焦甚至导致碱性区蛋白质的丢失。 4)每一次灌制SCA凝胶的重复性难以控制，而且这种凝胶机械稳定性差，易拉伸变形或断裂，同样导致重复性的降低。 由OFarrell所推出的非平衡pH梯度电泳(non-equilibrium
46、 pH gradient electrophoresis，NEPHGE)，在快速形成的pH梯度中根据蛋白质移动能力进行分离，该法可以用来分离碱性蛋白质8，但在结果的重现性上，仍然没有很好的解决。真正的一向等电聚焦技术韵突破要归功于在Immobilines试剂(Amersham Pharmacia Biotech，APB)的基础土开发的固相pH梯度(immobilized pH gradient，IPG)技术9。Immobilines是拥有CH2CHCONHR结构的8种丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧酸或叔氨基团，它们构成了分布在pH310范围不同值的缓冲体系。根据一定的配方计算后，将适宜的IP
47、G试剂添加至混合物中用于凝胶聚合，在聚合中，缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中，形成pH梯度。为了使操作方便，lPG胶在一层塑料支持膜上聚合，在洗去引发剂和剩余单体后，将干燥后的胶板切成3mm宽的干胶条，保存于200C备用。与传统载体两性电解质预制胶相比，IPG胶具有机械性能好、重现性好、易处理、上样量大的特点，而且避免了电渗透作用，因而可以进行特别稳定的IEF分离，达到真正的平衡状态。由于Immobilines可以随意调配，这样就可以控制生产不同pH分离范围的干胶条。如宽范围胶条有pH310、pH312，窄范围胶条有pH47、pH611、pH58等，甚至可以限定到一个pH单位，可以根据样品的分布范围来选择胶条pH值范围。Alnersham Pharmacia Biotech公司和Bio-Rad公司都有大量不同pH范围的商业化胶条可供选择(见表4-2)。此外根据需求，还可以选择不同长度的IPG胶条，如APB公司目前就有7cm、11 cm、13cm、18 cm、24em五种长度的胶条可供选择。专门配合IPG胶的等电聚焦设备已商品化，如APB公司的IPGphor及其附件，Bio-Rad公司的PROTEAN IEF(图4-4)，其编程自动化及高至8000V或10 000V的电压使得IEF在一个晚上即可完成，大大缩短了2-DE