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1、贵州大学研究生创新基金创新项目申请书项目名称冠突散囊菌野生型与veA基因缺失型蛋白差异比较项目类别（ A ） A一般项目 B重点项目 C创业项目研究性质（ B ） A基础研究 B应用研究 C工程应用 D其他申请金额（大写）叁仟元项目负责人桑石磊指导老师刘作易所在学院、中心、所、部贵州大学生命科学学院申请日期 2013年 12 月1 日贵州大学研究生院2013 年12月1日制定 第一部分 创新团队信息创新团队负责人信息姓名桑石磊性别男攻读学位理学硕士导师姓名刘作易所在学院生命科学学院所学专业微生物学生证号2012021150身份证号411327198804032535入学时间2012年9月毕业时
2、间2015年6月手机号码15180729375宿舍电话E-在本项目中承担的研究任务时间区间研究任务2013年 11月2013 年 11 月培养菌株2013年12 月2013 年 12月TCA-丙酮法提取蛋白2013年12月 2013年 12月蛋白含量测定2013年12 月2014 年 1月双向电泳2014年 2月2014 年 3 月质谱分析2014年 3月 2014年 4月生物信息学查询2014年5月 2014年 6月撰写论文已主持或参加的本基金项目名称无已主持或参加的课题名称异育银鲫“中科三号”与丰产鲫的生物学比较研究发表的论著、取得的科研成果(专利、获奖、鉴定等)和工程实现的社会评价及有关
3、资料(以目录清单形式给出，其书写格式同参考文献)无学位论文题目或研究方向丝状真菌产孢机理初步研究获奖情况（从本科起）u 肇庆学院“歌唱祖国六十华诞”文艺演出三等奖u 生命科学学院动物学实习优秀实习生u 贵州大学研究生三好学生本人承诺本人承诺以上所提供信息真实，并能按既定方案完成研究任务，取得预期成果。本人签章年 月 日创新团队成员信息姓名蒋大庆性别男攻读学位理学硕士导师姓名谢和所在学院生命科学学院所学专业生物工程学生证号2012021100身份证号341181198703191018入学时间2012年9月毕业时间2015年7月手机（小灵通）18285116042宿舍电话E-mailJiangd
4、a_在本项目中承担的研究任务时间区间研究任务2013年 11月2013 年 11 月培养菌株2013年12 月2013 年 12月TCA-丙酮法提取蛋白2013年12月 2013年 12月蛋白含量测定2013年12 月2014 年 1月双向电泳2014年 2月2014 年 3 月质谱分析2014年 3月 2014年 4月生物信息学查询2014年5月 2014年 6月撰写论文已主持或参加的本基金项目名称已主持或参加的课题名称黄山学院周边居民饮用水微生物污染状况调查发表的论著、取得的科研成果(专利、获奖、鉴定等)和工程实现的社会评价及有关资料(以目录清单形式给出，其书写格式同参考文献)蒋大庆,董丽
5、丽. 黄山率水河及周边居民生活饮用水微生物污染状况调查J.农业与技术;2013学位论文题目或研究方向芽孢杆菌在肉类食品发酵制作中的应用获奖情况（从本科起）2012-2013年度荣获贵州大学研究生一等奖学金；贵州大学单项奖学金本人承诺本人承诺以上所提供信息真实，并能按既定方案完成研究任务，取得预期成果。本人签章年 月 日第二部分 推荐专家信息推荐专家1信息姓名性别职称单位研究方向手机（小灵通）办公电话E-mail推荐意见（请推荐专家亲自填写）综合评价存在问题改进建议专家签章 年 月 日 推荐专家2信息姓名性别职称单位研究方向手机（小灵通）办公电话E-mail推荐意见（请推荐专家亲自填写）综合评价
6、存在问题改进建议专家签章 年 月 日第三部分 创新项目信息一、基本信息项目名称冠突散囊菌野生型与veA基因缺失型蛋白差异比较关键词冠突散囊菌、双向电泳、质谱分析、蛋白差异项目类别（ A ） A一般项目 B重点项目 C创业项目研究性质（ A ） A基础研究 B应用研究 C工程应用 D其他申请金额（大写）叁仟元配套金额（大写）壹万元起止时间2013年 12月至 2014年 6 月总工作量（天）200天依托项目类别贵州省农科院专项项目代码2011037号名称谢瓦氏曲霉间型变种的基因组测序及有性产孢相关基因的初步研究到校经费（大写）二、项目摘要为研究与veA基因产孢相关的蛋白代谢调控途径，本课题将以冠
7、突散囊菌野生型与veA基因缺失型菌株为研究材料，利用TCA-丙酮法提取全蛋白；然后利用双向电泳技术进行差异蛋白比较；最后胶内酶切进行挖点、生物质谱测序技术以及生物信息学数据库检索技术，对差异蛋白进行了研究分析，获得控制产孢相关的功能蛋白，为进一步研究冠突散囊菌的产孢机理打下基础。三、研究意义目前关于此菌的研究主要集中在生理、生化方面，还没有对相关蛋白调控产孢的机理进行研究。本实验室已经获得遗传稳定的veA突变体菌株，veA基因是调控丝状真菌生殖方式的一个重要基因，在冠突散囊菌中能够正向调控有性产孢，也能够反向调控无性产孢。为研究与veA基因产孢相关的蛋白代谢调控途径，本研究利用蛋白质组学技术比
8、较冠突散囊菌野生型与veA基因缺失菌株的蛋白差异，获得控制产孢相关的功能蛋白，对于进一步了解和认识丝状真菌产孢孢调控机理的生物化学与分子生物学机制有着重要意义，同时也为进一步结合更多现代分子生物学分析方法打下基础。四、主要创新点及预期成果主要创新点：1、首次将蛋白质组学技术应用到冠突散囊菌的相关蛋白产孢机理研究， 2、弥补了冠突散囊菌蛋白质组学研究的空白， 预期成果：1、经TCA-丙酮沉淀蛋白，获得两种菌株的全蛋白， 2、通过质谱分析、生物信息学查询，找到差异蛋白，并分析其功能， 3、构建与veA基因产孢相关的蛋白代谢调控网络。五、立项依据（国内外研究现状及发展趋势，列出参考文献并标注）国内外
9、研究现状：1、 冠突散囊菌的研究进展冠突散囊菌是茯砖茶发花过程中产生的优势菌。该菌由贵州省农业生物技术重点实验室通过单孢分离获得并保存。该菌是既能产有性孢子又能产无性孢子的全型真菌。刘作易等人（刘作易，1991）研究表明该菌在在自然界主要以有性世代即以闭囊壳形式存在，其无性世代很难发现。并且渗透压是影响冠突散囊菌产孢的主导条件。冠突散囊菌具有一种重要的生理特性，即渗透压可以调控该菌从有性生殖到无性生殖的转变。其在低渗条件下（自然条件下）只产生纯的有性孢子，随着渗透压的增大子囊孢子的产生逐渐减少，分生孢子逐渐增多，当NaCl浓度达到17%时，只产生纯的分生孢子，而不产生子囊孢子。同时，刘作易等人
10、指出了温度对冠突散囊菌产孢的影响，温度在3037，此菌能很好地形成分生孢子，30以下，随温度降低产分生孢子的能力减弱。刘作易的研究表明冠突散囊菌在可控条件下就极易产生纯有性孢子和无性孢子的这种特性为研究真菌有性发育和无性发育提供了一个极好的研究材料，并最终可以发展成为研究真菌有性和无性发育机理的模式菌株。由于该菌能在自然条件下产生纯的有性孢子，基于该菌的这一特性，我们构建了抑制差减文库（SSH）期望获得调控有性孢子产生的关键基因。在此基础上，我们通过运用生物信息学对SSH文库中的ESTs序列进行分析获得了很多可能与有性产孢相关的基因，通过筛选这些ESTs序列我们决定对esdC及YchF这两个基
11、因进行深入研究。利用RT-PCR及RACE方法获得了esdC和YchF这两个基因的cDNA全长。其中esdC的cDNA全长1474bp，序列分析表明该基因cDNA含有一个开放阅读框（ORF），长为819bp，编码273个氨基酸；YchF cDNA全长1367bp，含有一个ORF，长为1182bp，编码393个氨基酸。为了对有性产孢相关基因的功能进行进一步的研究，本实验室成功构建了根癌农杆菌转化谢瓦氏曲霉间型变种高效稳定的遗传转化体系。并且利用该转化体系成功将veA等基因从谢瓦氏曲霉间型变种基因组DNA中敲除，获得遗传稳定的veA突变体菌株。并对veA突变体进行了细致的显微形态观察，发现该突变体
12、在有性产孢过程中存在缺陷，证明了veA确实参与调控谢瓦氏曲霉间型变种有性产孢的过程。2、 冠突散囊菌产孢机理的研究进展产孢是丝状真菌实现繁殖的重要生命过程，无性和有性孢子作为丝状真菌的两种产孢形式受到基因的时空差异表达的调控，从而导致不同的繁殖过程。丝状真菌的产孢机理研究目前主要集中在丝状真菌的两个模式菌种-构巢曲霉（Aspergillus nidulans）和粗糙链孢菌(Neurospora crassa)。在产孢相关基因的研究中，尤其是模式生物构巢曲霉中，无性产孢相关基因报道的较多。丝状真菌的有性产孢过程还不清楚，对丝状真菌的有性发育基因的研究主要集中于对veA,nsdD, nsdC,es
13、dC,stuA,steC,noxA,rosA,nosA, lsdA,phoA,tubB和steA的研究。有性发育的调节过程中一个重要的因子就是veA基因。veA基因是调控丝状真菌生殖方式的一个重要基因，在冠突散囊菌中能够正向调控有性产孢，也能够反向调控无性产孢。3蛋白质组学在真菌中的研究进展真菌蛋白质组学研究，特别是有关丝状真菌方面的研究，在近 5 年才逐渐引起人们的关注，新增了大量基础研究数据。 大量的真菌基因组序列被分析并公布其结果， 蛋白质组学的研究技术得到快速的发展。目前，对蛋白谱的分析常用的技术路线有 3条：双向电泳-质谱（2D-PAGE-MS）、色谱-质谱及毛细管电泳-质谱（CE-
14、MS）分析。双向电泳技术作为最常用的蛋白质组学分析技术， 可对 pI 3-10，分子质量为 10-200 ku 的蛋白进行较好地分离，但该技术容易受外界环境的干扰， 对一些特殊性质的蛋白质（分子质量过大的蛋白，极端酸性或碱性的蛋白，疏水膜蛋白）不能很好地分离，并且操作繁琐，结果不稳定以及灵敏度低等。 色谱-质谱连用技术采用自动化、高通量的方法，提高了极端pI 蛋白质、膜蛋白及低丰度蛋白的检测准确性。毛细管电泳-质谱技术可应用于较少的样品， 并在较短时间内获得鉴定结果， 是目前分析微量蛋白质样品的主要分析手段，其包括二维毛细管电泳-质谱（2D-CE-MS）和液相色谱-毛细管电泳-质谱（LC-CE
15、-MS）等。参考文献1 齐祖同，孙曾美.茯砖茶优势菌种的鉴定J.真菌学报,1990,9(3):176-179.2 刘作易，秦京，王迺亮. 茯砖茶“金花”菌分离及鉴定.贵州农院学报,1990, 9（1）: 69-74.3 梁晓岚.四川茯砖茶主要霉菌的分离鉴定及优势菌种的筛选J.广东茶叶,1996,(4):13-15.4 刘仲华, 黄建安, 王增盛, 施兆鹏. 茯砖茶加工中色素物质的变化与色泽品质的形成. 茶叶科学, 1991, 11: 76-80.5 姚茂君, 黄群, 陈林杰, 李彦坡. 冠突散囊菌的分离及其液态发酵特性. 食品与发酵工业, 2007, 33: 28-31.6 Kato N, B
16、rooks W, Calvo AM. The expression of sterigmatocystin and penicillin genes in Aspergillus nidulans is controlled by veA, a gene required for sexual developmentJ. Eukaryotic Cell, 2003, 2:11781186.7 Han KH, Han KY, Yu JH.The nsdD gene encodes a putative GATA-type transcription factor necessary for se
17、xual development of Aspergillus nidulansJMolecular Microbiology ,2001, 41(2):299309.8 Kim Hye-Ryun. K. Chae, K. Han and D. Han. The nsdC Gene Encoding a Putative C2H2-Type Transcription Factor Is a Key Activator of Sexual Development in Aspergillus nidulans J.Genetics 182:771-783.9 Aguirre, J. Spati
18、al and temporal controls of the Aspergillus brlA developmental regulatory geneJ. Molecular Microbiology. 1993,8:211218.10 Miller KY, Toennis TM, Adams TH, Miller BL. Isolation and transcriptional characterization of a morphological modier: the Aspergillus nidulans stunted (stuA) gene. Molecular Gene
19、tics and Genomics, 1991,227:285292.11 Lee D W, Kim S, Kim S J. The lsdA gene is necessary for sexual development inhibition by a salt in Aspergillus nidulansJ.Current Genetics,2001,39( 4):237-243.12 Wei Huijun, Requena H and Fischer R. The MAPKK kinase SteC regulates conidiophore morphology and is e
20、ssential for heterokaryon formation and sexual development in the homothallic fungus Aspergillus nidulansJ. Molecular Microbiology ,2003,47(6), 1577-1588.13 杨何义, 应万涛, 钱小红. 蛋白质组技术的研究进展J.自然科学进展, 2002,12 (1) : 13- 17.六、研究内容及重点、难点研究内容本实验室已经构建了冠突散囊菌veA基因缺失型菌株以及保存的冠突散囊菌野生型菌株，收集冠突散囊菌野生型菌株产生有性孢子时期的菌丝体，以及veA
21、菌株产生无性孢子时期、既产生有性孢子又产生无性孢子时期的菌丝体，通过TCA-丙酮法提取蛋白，然后，利用 IEF/SDS-PAGE 双向电泳技术进行差异蛋白比较；最后胶内酶切进行挖点、生物质谱测序技术以及生物信息学数据库检索技术，对冠突散囊菌野生型与veA基因缺失菌株差异蛋白质进行了研究，构建与veA基因产孢相关的蛋白代谢调控网络。重点：蛋白质的提取、质谱分析难点：保证蛋白的纯度、双向电泳胶图的分析七、研究方案（包括研究方法、技术路线等）研究方案1 研究材料供试材料为用单胞分离方法从贵州茯砖茶中分离并鉴定的冠突散囊菌菌株，以及构建的veA基因缺失菌株（veA菌株）。2蛋白提取收集冠突散囊菌野生型
22、菌株产生有性孢子时期的菌丝体，以及veA菌株产生无性孢子时期、既产生有性孢子又产生无性孢子时期的菌丝体，并提取其全蛋白质。3蛋白含量测定使用定量试剂盒2-D Quant Kit测定蛋白含量4双向凝胶电泳第一向IEF 等电聚焦电泳和第二向 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳5质谱分析切取蛋白点胶粒，胰酶溶解。酶解液用MAL-DI-TOF-TOF质谱仪Ultraflexm（Bruker公司）进行分析，肽指纹图谱及肽序列用LIFT软件串联。6生物信息学查询根据各肽段的 m/z 数据，设置适当的搜索参数，在 NCBInr、Swissprot 、PIR蛋白数据库中搜索理论上酶解肽段能与之相匹配的蛋白质，根据搜索
23、结果，结合蛋白质在胶上的等电点和分子量最终确定目的蛋白质。技术路线菌株培养蛋白提取蛋白含量测定双向凝胶电泳质谱分析生物信息学查询野生型产生有性孢子菌丝体缺失型产生无性孢子、既产无性又产有性菌丝体 八、研究基础（与本项目相关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩）1，本实验室（贵州省农业生物技术重点实验室）已具备从事分子生物学方面的硬件与软件设施。2，我们已分离和保存了具有可控产孢的冠突散囊菌菌株以及构建了veA缺失型菌株。3，本实验室已经根据该菌的不同产孢时期构建了SSH cDNA文库（抑制差减文库）。并且已经证实有性发育关键基因veA在该菌中的存在（马权,刘永翔,刘作易.冠突散囊菌有性孢子发育
24、基因veA cDNA片段的克隆J.贵州农业科学，2011，39（3）：25-27）。4本人已经培养了两种菌株，并且提取了全蛋白。九、研究条件（实验设备、工作环境等）实验设备：各种规格的移液枪（Eppendorf）、高速台式台式离心机（Eppendorf）、高速冻离心机Allegra21R（Beckman）、荧光定量PCR仪iQTM5（BIO-RAD）、PCR扩增仪（BIO-RAD）、凝胶成像系统（英国基因公司）、琼脂糖凝胶电泳仪（安玛西亚公司）、DU800紫外分光光度计（Beckman Coliter）、SS-325型高压灭菌锅（日本Tomy Kogyo公司）、超纯水系统（Purelab 公司
25、）、-86C超低温冰箱（Thermo Forma）、常温冰箱（海尔集团）、-20C低温冰箱（海尔集团）、BS300S-WEI电子天平（德国赛多利斯）、PH酸度计（德国赛多利斯）、电热恒温培养箱、超净工作台、制冰机等其它小型仪器均为国产仪器。工作环境：本实验室拥有专门的自习室，学习环境安静卫生。导师刘作易教授的悉心指导，并且有其他博士师兄师姐耐心帮助，是做实验的好地方。十、可行性分析1、 本实验室已分离和保存了具有可控产孢的冠突散囊菌菌株以及构建了veA缺失型菌株；2、 贵州省农科院实验平台可以保证该实验的顺利进行。3、 贵州大学图书馆、相关数据库为该课题提供了丰富信息资料来源。4、 导师刘作易
26、一直从事该领域研究，在理论和技术上可确保该课题的顺利完成，并且还有众多师兄师姐的指导帮助。5、 本团队对此课题具有强烈的兴趣，有信心完成所申请的课题内容并取得科学、可信的实验结果。十一、进度计划起止时间工作任务研究成果2013年 11月2013 年 11 月培养菌株2013年12 月2013 年 12月TCA-丙酮法提取蛋白2013年12月 2013年 12月蛋白含量测定2013年12 月2014 年 1月 双向电泳2014年 2月2014 年 3 月 质谱分析2014年 3月 2014年 4月 生物信息学查询2014年5月 2014年 6月 撰写论文十二、经费预算起止时间支出项目（详细清单）
27、预算金额（元）2013年 11月2013 年 11 月培养菌株所需的培养基100元2013年12 月2013 年 12月TCA-丙酮法提取蛋白、蛋白含量测定所需试剂200元2013年12 月2014 年 1月双向电泳所需试剂1800元2014年 2月2014 年 3 月质谱分析1000元合计（元）3100元第四部分 评审专家信息项目名称姓名职称单位研究方向手机（小灵通）办公电话E-mail评审得分创新性20分学术或应用价值20分研究基础及科研能力20分课题论证20分可行性20分评审意见综合评价存在问题改进建议评审结论通 过（ ）建议资助金额（ ）元建议修改后通过（ ）不通过（ ）专家签章 年 月 日14