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1、中南大学湘雅医院产前诊断中心 湖南家辉遗传专科门诊部 邬玲仟,基于深度测序技术的非侵入性 胎儿染色体非整倍体检测,染色体非整倍体,定义：体细胞染色体数目增加或减少一条或数条的个体,类型： a. 单体型：2n-1；X，21，22号丢失常见。 b. 三体型：2n+1；常染色体13、18、21三体常见，性染色体三体型有XXX、XXY、XYY。 c. 多体型：仅见于性染色体；如48，XXXX49，XXXYY。,21三体综合征,唐氏综合征（Downs Syndrome， DS） 先天愚型 足月新生儿最常见的染色体疾病，发病率1/700 至今没有根治方法 我国每年约2000万新生儿,每年约有26600个D
2、S儿出生。我国有大约60万以上的DS患者。,特殊面容：面部扁平、鼻梁低平、眼距宽、外眦上斜、内眦赘皮、张口吐舌等 智力障碍：患者智商（IQ）通常为3060。 生长发育迟缓和肌张力减退：出生体重偏低，肌张力低下，身材矮小，短颈，颈背皮肤松垂，手短而宽、通贯掌、小指弯曲等。 至少1/3的患者伴发先天性心脏病。十二指肠闭锁和气管食管瘘等伴发症也较其它疾病常见。患白血病的风险为正常人群的15倍。,临床表现,18三体综合征,18三体综合征是次于先天愚型的第二种常见染色体三体征。 新生儿发生率约为1/7500。 主要临床表现: 智力障碍、生长发育迟缓、胸骨短、严重的心脏畸形以及肌张力亢进等。颅面部的畸形包
3、括小颌畸形、枕部突出、小耳以及低位耳等。双手呈特征性的握拳状，摇椅足。,13三体综合征发病率为1/2000025000。 主要临床表现：严重的中枢神经系统畸形，内脏畸形，颅面部的畸形，手足畸形等；,13三体综合征,21三体综合征二级预防模式,早孕期筛查 ： NT+PAPP-A 中孕期筛查 ：二联、三联或四联 得到最终的风险值 产前诊断,母亲血清标记物和超声筛查的可信度,结合母亲年龄的三联筛查， 唐氏综合症检出率:65%，假阳性率:4.5-5.0% 增加抑制素A，可以将检出率增加到75% 结合母亲年龄的NT测量，21三体检出率：77%，假阳性率：5%. 结合生化分析和颈透明度的唐氏综合症的检测检
4、出率可以达到89%，假阳性率：5%. Wapner R, et al. (2003) First-trimester screening for trisomies 21 and 18. N Engl J Med 349:14051413,血清学筛查存在的问题,孕周的确定不准确 许多单位未严格控制孕期筛查的时限 取血时间与开单时间，称体重时间不一致的问题 实验室操作缺乏统一的技术规范,染色体综合征侵入性产前诊断,侵入性产前诊断的利与弊,47, XY, +21,利：目前金标准 弊：a）一定的流产风险：1% b）报告周期长：1个月 c）孕妇和家属承受较大思想压力,主要参考文献：Tabor A, e
5、t al. RCT of amniocentesis in 4606 low risk women. Lancet 1986;1:1287-93,全国妇幼卫生检测办公室的调查显示 2007-2009年全国产筛4097801人， 21三体高风险176130人， 产前诊断的93504人， 确诊为21三体胎儿6679例。,产前诊断服务量不能满足需求,基于FISH的产前诊断 优点：所需样本量少，检测周期短（24h-48h）。 缺点：价格昂贵，通量小。 基于定量 PCR的产前诊断 优点：所需样本量少，检测周期短（24h）。价格便宜，通量大。 缺点：对于嵌合型21三体，定理PCR可能会出现假阴性，样本中母
6、血的污染也会影响结果的判断。,目前快速产前诊断方法的利弊,母体外周血含有游离胚胎DNA,主要参考文献：Fetal cf-DNA detected via Y chromosome。Lo YM et al., Lancet 1997,母体外周血的游离胚胎DNA几乎全部来源于绒毛层 胚胎DNA片段比较小，长度在75bp和250bp之间。 母体外周血中的胚胎DNA含量在5%到30%之间。孕周越大外周血中胚胎DNA的含量越高。,母体血浆DNA的存在形式,分娩后母体cffDNA快速降解,Lo et al. Am J Hum Genet 1998; 62:768,cffDNA半衰期16.3min，2h后检
7、测不到 VS 母血胎儿细胞持续存在数年,血浆DNA的高母体DNA背景,母体 DNA,胚胎 DNA,20% 胚胎 DNA,母体DNA高背景带来的检测难度,20% 胚胎 DNA,10,11,21染色体3体带来的微量DNA变化,纯胚胎DNA，唐氏与正常21号染色体的剂量变化： 3 : 2 = 1.5 血浆DNA中胚胎DNA占20%时，唐氏与正常21号染色体的剂量变化： 11 : 10 = 1.1 母体血浆DNA中胚胎的DNA一般占5%到30%，大多小于20% 唐氏与正常21号染色体的剂量变化大多 1.1 当胚胎DNA只占5%时，怀唐氏胚胎的母体血浆DNA的21号染色体量理论上会增加2.5% 21号染
8、色体只占全基因组的1.3%，检测1.3% 的全部DNA的2.5%的增量要求非常高的精确度 荧光定量PCR（realtime PCR）的精确度（CV）在42% 数码PCR（digital PCR)的精确度（CV）在15% 第二代测序的精确度（CV）在0.5%,第二代测序技术用于检测胚胎 染色体拷贝数变化,采集母体血浆 提取血浆DNA 制备测序文库,在第二代测序仪上测序,测得的序列与人的参考基因组比对并作统计分析,母血胎儿游离DNA拷贝数检测技术平台,抽取外周血,分离血浆,文库制备,生物信息分析,新一代测序,自2008年以来医学遗传学国家重点实验室已经收集了700多份各类孕妇外周血桨，同时，所有样
9、本均有金标准的核型分析数据。通过与北京贝瑞和康生物技术有限公司技术合作，成功地完成了其中401例样本的双盲检测，结果显示13、18、21、X、Y五大染色体检测的灵敏度达到100%，特异性99%以上，处在国际领先水平。,研究结果,检测结果总结,假阴性：0/28 = 0% 假阳性：0/373 = 0% 47,XY,+2126/46,XY24：Z = 4.77 46,XX,der(21;21)+21 : Z = 9.59,T21检测结果,假阴性：0/3 = 0% 假阳性：0/398 = 0%,假阴性：0/12 = 0% 假阳性：0/389 = 0%,T13检测结果,T18检测结果,X/Y染色体检测结果,基于新一代测序技术的非侵入性产前非整倍体检测的优点,非侵入性，避免流产，感染等风险，降低孕妇心理担忧 高灵敏度，高特异性 检测周期短5天 通量大，质控容易,合作单位,北京贝瑞和康生物技术有限公司 周代星 高扬 侯颖 张建光 王珺 田凤 周可 香港中文大学 (CUHK) Dennis Lo Rossa Chiu 美国约翰霍普金斯大学(JHU) 高远 谢彬,特别感谢,湖南省妇幼保健院遗传室 王 华主任 在样本采集给予的巨大帮助,chr21 z-scores,谢 谢,