《蛋白质化学》PPT课件.ppt

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1、第二章 蛋白质化学,本章内容,第一节 氨基酸的结构与分类 第二节 氨基酸的性质 第三节 氨基酸混合物的分离 第四节 蛋白质概论 第五节 蛋白质的一级结构 第六节 蛋白质的三维结构 第七节 蛋白质的理化性质与分离纯化,第一节 氨基酸的结构与分类,氨基酸是蛋白质水解的最终产物，是组成蛋白质的基本单位（构件分子）。从各种生物体内发现的氨基酸已有180多种，但参与蛋白质组成的常见氨基酸只有20种，这20种氨基酸称为常见氨基酸或基本氨基酸。,amino acid, aa 或 AA,一、氨基酸的结构,氨基酸的结构通式,或,氨基酸是含有氨基的羧酸，不同氨基酸的R基不同，（除脯氨酸外）都为L-氨基酸。,据R基

2、团化学结构分类,脂肪族A（16种）,芳香族A (Phe、Tyr、Trp),杂环 (His、Pro),二、基本氨基酸的分类,甘氨酸 （Gly, G）,丙氨酸 （Ala, A）,缬氨酸 （Val, V）,亮氨酸 （Lue, L）,异亮氨酸 （Ile, I）,1. 侧链只是烃链（5种）,脂肪族氨基酸,2. 侧链含有羟基 （2种）,丝氨酸 （Ser, S）,苏氨酸 （Thr, T）,3. 侧链含硫原子（2种）,半胱氨酸 （Cys, C）,甲硫氨酸 （Met, M）,4. 侧链含有羧基或酰胺基（4种）,天冬氨酸 （Asp, D）,谷氨酸 （Glu, E）,天冬酰胺 （Asn, N）,谷氨酰胺 （Gln,

3、 Q）,5. 侧链含有碱性基团（3种）,赖氨酸 （Lys, K）,精氨酸 （Arg, R）,组氨酸 （His, H）,芳香族氨基酸,苯丙氨酸 （Phe, F）,酪氨酸 （Tyr, Y）,色氨酸 （Trp, W）,杂环氨基酸,组氨酸 （His,H）,脯氨酸 （Pro,P）,非 极 性 氨 基 酸,极 性 中 性 氨 基 酸,带正电荷的氨基酸,带负电荷的氨基酸,三、不常见蛋白质氨基酸及非蛋白质氨基酸,在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为不常见蛋白质氨基酸。这些氨基酸都是在蛋白质合成后由相应的基本氨基酸衍生而来的。,非蛋白质氨基酸：存在于生物体内，但不组成蛋白质 的呈游离或结合态的氨基酸

4、，约150种，具有多种生理功能。 （1） L-氨基酸的衍生物 L-瓜氨酸和L-鸟氨酸是合成精氨酸的中间产物。 （2）D-氨基酸 D-Ala存在于肽聚糖中，D-Phe是短杆菌肽S的组分。 （3）、-氨基酸 -Ala是泛酸的前体，-氨基丁酸是传递神经冲动的化 学介质。,第二节 氨基酸的性质,一、氨基酸的构型、旋光性和光吸收,构型：组成蛋白质的氨基酸除Gly以外都有手性碳原子，在三维空间上就有两种不同的排列方式，它们互为镜影，这两种不同的构型分别称为D-型和L-型。,以丙氨酸为例：,如含两个手性碳原子，则有种立体异构体，分别称为-,-，别-和别-氨基酸。,L-苏氨酸 (L-threonine),D-

5、苏氨酸 (D-threonine),L-别-苏氨酸 (L-allo-threonine),D-别-苏氨酸 (D-allo-threonine),自然界中组成蛋白质的氨基酸都是L-型。,(Gly除外),旋光性：,组成蛋白质的氨基酸除Gly以外，都有手性碳原子， 所以都有旋光性，能使偏振光的偏振面的向左或向右旋转，向左旋转的称左旋，用“一”号表示，向右旋转的称右旋，用“”号表示。是AA的物理常数，与结构、PH值有关。,消旋,外消旋,内消旋,光吸收：,组成蛋白质的氨基酸中，Trp、Tyr和 Phe对紫外光有一定的吸收，这是因为它们分子中含有苯环，是苯环的共轭双键造成的，这三个氨基酸的光吸收都在280

6、nm附近。,pH=pI,pHpI,pHpI,带电荷为零,带电荷为正,带电荷为负,完全质子化,完全去质子化,兼性离子,二、氨基酸的两性解离及等电点,(pK1),(pK2),不同pH时氨基酸以不同的离子化形式存在！,氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。 等电点(isoelectric point, pI) 在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性，在电场中既不向阳极也不向阴极移动。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。 氨基酸等电点的特点： 1.净电荷数等于零，在电场中不移动； 2.此时氨基酸的溶解度最小。,氨基酸等电点的确定：,根据

7、pK值（该基团在此pH一半解离）计算： 等电点等于两性离子两侧pK值的算术平均数。,氨 基 酸 的 酸 碱 滴 定,酸性氨基酸，以Asp为例：,碱性氨基酸，以Lys为例：,（1）与HNO2的反应,三、氨基酸的化学反应,（2）与茚三酮的反应： 脯氨酸产生黄色物质，其它为蓝紫色。在570nm（蓝紫色）或440nm（黄色）定量测定（0.5-50g/ml）。,(3)与甲醛反应：氨基酸的甲醛滴定法,OH,中和滴定,反应特点 A. 为- NH2的反应 B. 在常温，中性条件，甲醛与- NH2很快反应，生成羟甲基衍生物，释放氢离子。 应用：氨基酸定量分析甲醛滴定法（间接滴定） A.直接滴定，终点pH过高（1

8、2），没有适当指示剂。 B.与甲醛反应，滴定终点在9左右，可用酚酞作指示剂。 C.释放一个氢离子，相当于一个氨基（摩尔比1：1） D.简单快速，一般用于测定蛋白质的水解速度。,反应特点 A.为- NH2的反应 B. 在弱碱性条件下，与DNFB发生芳环取代，生成二硝基苯氨基酸 应用：鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸。 首先由Sanger应用，确定了胰岛素的一级结构。,(4) 与2,4-二硝基氟苯（DNFB）的颜色反应,（黄色）,(5)与苯异硫氰酸酯（PITC）的反应,由Edman于1950年首先提出 为- NH2的反应 用于N末端分析，又称Edman降解法,胱氨酸,二硫键,-HH,（6）半胱氨酸

9、的氧化与还原反应,pI,PK2=4.25,PK3=9.67,PK1=2.19,PK2,PK3,PK1,pI,PK1=1.82,PK2=6.0,PK3=9.17,PK2,PK1,PK3,第三节 氨基酸混合物的分离,一、层析技术 纸层析、薄层层析、离子交换层析、高效液相层析 二、电泳技术 纸电泳,一、层析技术,层析技术又称色谱技术（Chromatography），是一种根据被分离物质的物理、化学及生物学特性的差异，使它们在某种基质中移动速度不同而进行分离和分析的方法。例如：我们利用物质在溶解度、吸附能力、立体化学特性及分子的大小、带电情况及离子交换、亲和力的大小及特异的生物学反应等方面的差异，使其

10、在流动相与固定相之间的分配系数（或称分配常数）不同，达到彼此分离的目的。,1. 层析技术的分类,根据固定相基质的形式分类，层析可以分为纸层析、薄层层析和柱层析。 根据流动相的形式分类，层析可以分为液相层析和气相层析。 根据分离的原理不同分类，层析主要可以分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。,吸附层析是以吸附剂为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而达到分离目的的一种层析技术。 分配层析是根据在一个有两相同时存在的溶剂系统中，不同物质的分配系数不同而达到分离目的的一种层析技术。 凝胶过滤层析是以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相，根据物质的分子大小进行分离的一种层

11、析技术。,离子交换层析是以离子交换剂为固定相，根据物质的带电性质不同而进行分离的一种层析技术。 亲和层析是根据生物大分子和配体之间的特异性亲和力（如酶和底物、抗体和抗原、激素和受体等），将某种配体连接在载体上作为固定相，而对能与配体特异性结合的生物大分子进行分离的一种层析技术。亲和层析是分离生物大分子最为有效的层析技术，具有很高分辨率。,原理：组成层析系统的固定相和流动相具有相反的极性。被分析的样品（如aa混合物）中的各组分依据其自身极性的强弱，与此两相的亲和力不同。与固定相亲和力大者，易留滞于原地，与流动相亲和力大者，易随流动相移动，因而达到分离的目的。,2. 分配层析,（1）纸层析,单向纸

12、层析,迁移率：Rf,双向纸层析图,（2）薄层层析,2离子交换层析,原理：分离氨基酸时，用离子交换树脂作为支持物，利用离子交换树脂上的活性基团与溶液中的离子进行交换反应，由于各种离子交换能力不同，与树脂结合的牢固程度就不同，在洗脱过程中，各种离子以不同的速度移动，从而达到分离的目的。,离子交换原理及流程示意图,树脂是一种人工合成的聚苯乙烯一苯二乙烯组成的具有网状结构的高分子聚合物。,洗脱顺序主要与各种离子所带电荷有关，在电荷相同时，与极性、非极性有关。,阳离子交换树脂：活性基团是酸性的，如磺酸基-SO3H （强酸型），羧基-COOH（弱酸型）,阴离子交换树脂：活性基团是碱性的，如季胺基-N+(C

13、H3)3OH-,基本步骤： 装柱 上样 分步洗脱 分步收集,强酸型阳离子交换树脂,pH23，使所有氨基酸带正电荷，正电荷大小顺序：碱性AA中性AA酸性AA,逐步提高洗脱液pH和离子强度,习题举例:,有一种蛋白质水解物,在pH6时,用阳离子交换柱层 析分离,第一个被洗脱的氨基酸是( ) A. Val (pI5.96) B. Lys (pI9.74) C. Asp(pI2.77) D. Arg(pI10.76) E. Tyr (pI5.66),二、电泳,氨基酸在pH高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过氨基酸在电场中泳动而达到分离各种氨基酸的技术, 称为电泳(e

14、lctrophoresis) 。 分离氨基酸混合物常用纸电泳。,第四节 蛋白质概论,一、蛋白质的定义 蛋白质(Protein，pr) ：是一切生物体中普遍存在的，由天然氨基酸按照一定的顺序，通过肽键连接而成的一条或多条肽链构成的生物大分子；其种类繁多，各具有一定的相对分子质量，复杂的分子结构和特定的生物功能；是表达生物遗传性状的一类主要物质。,二、蛋白质的生物学重要性,1. 蛋白质是生物体重要组成成分 分布广 含量高 2. 蛋白质具有重要的生物学功能 1）催化生物化学反应（酶） 2）结构成分(结缔组织的胶原蛋白、皮肤的弹性蛋白、膜蛋白) 3）贮藏（卵清蛋白、种子蛋白） 4）物质运输（血红蛋白、

15、脂蛋白、电子传递体） 5）细胞运动（肌肉收缩的肌球蛋白、肌动蛋白） 6）激素功能（胰岛素） 7）防御功能（抗体、血凝蛋白） 8）接受传递信息（受体蛋白、味觉蛋白） 9）调节细胞生长、分化和遗传信息的表达（组蛋白、阻遏蛋白） 3. 氧化供能,三、蛋白质的元素组成,主要有C、H、O、N 和 S。 有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘 。 各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16，这是凯氏定氮法 测蛋白质含量的理论依据： 蛋白质含量蛋白质含N量6.25,1. 按组成分类 单纯蛋白质 这类蛋白质只含有-氨基酸组成，不含其它成分。例如：RNA酶、血清清蛋白、肌球蛋白、肌动

16、蛋白、角蛋 白等。 结合蛋白 由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成，这些非蛋 白成分包括糖、脂、核酸、色素等，又称为辅基或配体。 糖蛋白：如细胞膜中的糖蛋白等。 脂蛋白：如血清-，-脂蛋白等。 核蛋白：如细胞核中的核糖核蛋白等。 色蛋白：如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。,四、蛋白质的分类,2.按蛋白质的外形分类 球状蛋白质 外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这一类。但肌动蛋白属于球状蛋白却不溶于水。 纤维状蛋白质 分子类似纤维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质和 不溶性纤维状蛋白质。 不溶性纤维状蛋白质：大多数纤维状蛋白质属此类，如 胶原蛋白、弹性蛋白、角蛋白、丝

17、蛋白等。 可溶性纤维状蛋白质：肌球蛋白和血纤蛋白原可溶于水。,3.按多肽链条数分类 单体蛋白质 仅含一条多肽链。 多聚蛋白质 含两条或多条多肽链。 例如： 牛核糖核酸酶 ：一条多肽链 胰岛素 ：两条（两种）多肽链 血红蛋白：四条（两种）多肽链,胰岛素,牛核糖核酸酶,血红蛋白,五、蛋白质的分子结构层次,一级结构(primary structure) 二级结构(secondary structure) 三级结构(tertiary structure) 四级结构(quaternary structure),蛋白质的一级结构决定高级结构！,第五节 蛋白质的一级结构,一、肽（peptide） 1.肽的结

18、构和命名 肽是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的无分支线形聚合物。其中的氨基酸单位称氨基酸残基。 氨基酸间缩水形成的共价键称肽键(peptide bond)。,+,-HOH,甘氨酰甘氨酸,肽键,甘氨酰甘氨酸,*两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽,*由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多 的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。,* 多肽链(polypeptide chain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而 成的一种结构。,氨基酸的顺序是N 端C 端的排列顺序。如上述五肽可表示为： Ser-Val-Tyr-

19、Asp-Gly 丝氨酰缬氨酰酪氨酰天冬氨酰谷氨酸,COOH,.肽键的结构特点： 氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用，肽 键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。所以连接在肽键两端的基团处于一个平面上，这个平面称为肽平面。在大多数情况下，相邻肽平面以反式结构存在。,酰胺平面 由肽键周围的6个原子组成的刚性平面,键长介于单双键之间,虽是单键却有双键性质 周边六个原子在同一平面上 前后两个a-carbon在对角(trans),C-N 0.149 nm,C=N 0.127 nm,相关名词：,肽单元：参与肽键的6个原子被约束于一个平面上，与此相应 的-C-CO-NH-C-则称为肽单元 。

20、多肽主链：在多肽链中由肽键连接的各氨基酸残基形成的长 链骨架(C-CO-NH-C.)为多肽链的主链。 或：肽链的骨干是由肽单元重复排列而成长链， 称为主链。 多肽侧链：在多肽链中的各氨基酸残基所连接的侧链基团 为多肽侧链。或：氨基酸残基的R-基连在主链上 成为侧链。 说明：各种不同的肽链主链都是一样的，但侧链（R-基） 的顺序即氨基酸的顺序各不相同 。,.肽的理化性质类似于氨基酸性质 ）旋光性 ）两性解离及等电点 ）化学反应 双缩脲反应：含有两个或两个以上肽键的化合物与碱性硫酸铜作用，生成蓝紫色的复合物，肽键越多颜色越深，受蛋白质特异性影响小，可用于肽和蛋白质定量测定及测定蛋白质水解程度。,.

21、天然存在的活性肽,在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白 质的亚单位。 有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在，这 类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。 如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。, 谷胱甘肽(glutathione, GSH),-,GSH过氧化物酶,GSH还原酶,NADPH+H+,NADP+,谷胱甘肽在体内参与氧化还原过程，作为某些氧化还原酶的辅因子，作用是保护巯基酶，或防止过氧化物积累。,抗生素类多肽,短杆菌肽S,体内许多激素属寡肽或多肽,激素类多肽,二、蛋白质一级结构的测定,1.蛋白质一级结构: 蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序，即氨基酸的

22、 线性序列。一级结构中包含的共价键主要指肽键和二硫 键。在基因编码的蛋白质中，这种序列是由mRNA中的 核苷酸序列决定的。,蛋白质的一级结构(Primary structure)包括： (1)组成蛋白质的多肽链数目; (2)多肽链的氨基酸顺序; (3)多肽链内或链间二硫键的数目和位置。 其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。,2.蛋白质一级结构测定的意义,是推测蛋白质高级结构的分子依据 是理解蛋白质生理功能的分子基础 是阐明遗传疾病发生机理的分子手段 是研究生物进化的分子佐证,胰岛素,一级结构,高级结构,正常红细胞与镰刀形红细胞的扫描电镜图,镰刀形红细胞,正常红细胞,-链

23、N端氨基酸排列顺序 1 2 3 4 5 6 7 8 Hb-A（正常人） Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys Hb-S（患 者） Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys,不同生物与人的Cytc的AA差异数目,生物 与人不同的AA数目 黑猩猩 0 恒河猴 1 兔 9 袋鼠 10 牛、猪、羊、狗 11 马 12 鸡、火鸡 13 响尾蛇 14 海龟 15 金枪鱼 21 角饺 23 小蝇 25 蛾 31 小麦 35 粗早链孢霉 43 酵母 44,不同生物来源的细胞色素c中不变的AA残基,35个不变的AA残基，是Cyt C 的生物功能所不可缺少的。其中有

24、的可能参加维持分子构象；有的可能参与电子传递；有的可能参与“识别”并结合细胞色素还原酶和氧化酶。,3.一级结构测定的原则和基本流程,一级结构测定的原则： 将大化小，逐段分析，制成两套肽片段，找出重叠位点，排出肽的前后位置，最后确定蛋白质的完整序列。,目前往往采用从待测蛋白质的基因序列反推出蛋白质的一级结构。,蛋白质顺序测 定基本战略,通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列,按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列,分离编码蛋白质的基因,测定DNA序列,排列出mRNA序列,一级结构测定的基本流程:,（1）拆分蛋白质分子的多肽链; （ 2）鉴定多肽链的N一末端和C一末端残基; （3）用两种或几种不同的断裂

25、方法将多肽链裂解成较小 的片段; （4）测定各肽段的氨基酸序列; （5）重建完整多肽链的一级结构; （6）确定半胱氨酸残基间形成的二硫键的位置； （7）酰胺基位置的确定。,测定蛋白质的一级结构前的准备工作,A. 样品纯度必须97%以上； 聚丙烯酰胺凝胶电泳要求一条带 B. 测定蛋白质的相对分子质量； SDS-PAGE，凝胶过滤法，沉降系数法 C. 测定蛋白质多肽链种类和数目； 种类： SDS-PAGE 数目：N末端氨基酸残基摩尔数/蛋白质摩尔数 D. 测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数； E. 测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。, 酸水解：常用6 mol/L的盐酸或4

26、mol/L的硫酸在105-110条件下进行水解，反应时间约20小时。 此法的优点是不容易引起水解产物的消旋化。 缺点是色氨酸被沸酸完全破坏；含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解；门冬酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羧基。 碱水解：一般用5 mol/L氢氧化钠煮沸10-20小时。 由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。部分的水解产物发生消旋化。该法的优点是色氨酸在水解中不受破坏。 酶水解：应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化。水解的产物为较小的肽段。,4.蛋白质的一级结构测定,1）多肽链的拆分获得单条线形多肽链 由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行

27、拆分。如：血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体等。,拆分非共价键：可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理。 拆分二硫键：几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。,拆分,巯基的保护,2）N-末端和C-末端氨基酸残基的确定为氨基 酸序列排列建立两个重要的参考点,N端分析方法：, 二硝基氟苯法（DNP法、DNFB法或FDNB法）, 丹磺酰氯法（DNS法）,丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质, 苯异硫氰酸(酯)法（PITC法、PTC法、PTH法、Edman降解法 ）,

28、由于其连续反应特性， 成为蛋白质序列分析仪 的分析原理！, 氨肽酶（aminopeptidase, Apase）法,Ala,Val,Gly,氨肽酶法：氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的 水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数 量，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸 氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。,C末端分析方法,肼解法：多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。,羧肽酶法：羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端

29、逐个的水解。 目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。,（3）多肽链部分裂解成较小的片段化大为小， 获得短肽段,酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶等。 化学法：溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。,胰蛋白酶： R1=赖氨酸Lys和精氨酸Arg侧链（专一性较强，水解速度快）。,或胰凝乳蛋白酶： R1=苯丙氨酸Phe,色氨 酸Trp,酪氨酸Tyr,糜蛋白酶,胃蛋白酶： 在疏水性氨基酸处部分水解，最适反应pH为23。,（4）测定各短肽段的氨基酸序列

30、,方法 ：蛋白质序列分析仪 原理：1. Edman 法 2. DNS- Edman 法 3. 有色- Edman 法,（5）重建完整多肽链的一级结构-获得多肽链的完整序列,利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。,对角线电泳步骤： 1.碘乙酰胺封闭-SH 2.胃蛋白酶酶切蛋白质（pH2） 3.第一向电泳（ pH6.5） 4.过甲酸氧化处理-S-S-键生成-SO3H 5.第二向电泳（ pH6.5） 6.分离出含二硫键的两条短肽 7.测序，与拼接出的多肽链比较，确定二硫键的位置。,（6 ）确定半胱氨酸残基间形成的二硫键的位置,对角线电泳动态图解,（7）酰胺基位置的确定,AspAsn、GluGln 方法：酶解肽链，产生含有单个Asx或Glx的肽，用电泳法确定是Asp还是Asn。,