《骨髓细胞检验》PPT课件.ppt

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1、,学习目标 第一节 造血与血细胞的分化发育 第二节 细胞化学染色及临床应用 第三节 骨髓检验方法 第四节 正常骨髓象 小结,第十五章 骨髓细胞检验,学习目标,1.阐述血细胞的发育过程及形态演变规律；说出细胞凋亡的概念。 2.描述红细胞系、粒细胞系、巨核细胞系、单核细胞系和淋巴细胞系的正常细胞形态。 3.描述成人正常骨髓象的特征、骨髓涂片观察方法和骨髓细胞分类方法。 4.说出过氧化物酶染色、中性粒细胞碱性磷酸酶染色的原理、方法和临床应用。,学习目标,5.说出造血器官和造血微环境的概念。 6.理解骨髓涂片、染色和骨髓细胞分类中应注意的问题，粒红比值、有核细胞增生程度的概念，骨髓检验的临床应用。 7

2、.理解中性粒细胞碱性磷酸酶、酯酶、糖原和铁粒染色的原理和临床应用。 8.知道各系细胞的异常形态特征和常见非造血细胞形态和骨髓穿刺方法,骨髓细胞检验,骨髓细胞检验是通过抽取骨髓组织并利用形态学、化学及生物学等技术对骨髓细胞进行检验的方法，是血液检验的重要组成部分。本章重点介绍光学显微镜下瑞特-吉姆萨（Wright-Giemsa）染色的骨髓细胞形态学检查方法，对常用的细胞化学染色方法也作简要介绍。,骨髓细胞形态学检查,主要用于观察骨髓与血液中的血细胞数量与质量的变化，以了解造血功能的变化情况，对疾病特别是血液病的诊断、观察疗效、判断预后等均有重大价值。若配用相应的细胞化学染色，则可使诊断的准确性有

3、较大提高。,你知道吗？,人们发现血细胞已有300年的历史，1673年观察到红细胞，1749年观察到各种白细胞，而血小板在1842年被认识。 这些细胞的形态学至今仍是血液学家研究的对象。各种特殊显微镜的发明与应用，使血细胞检验技术不断提高，血细胞形态学的概念更具体生动。目前应用的特殊显微镜有：暗视野显微镜、偏光显微镜、位相显微镜、电子显微镜和干涉显微镜等。,第一节 造血与血细胞的分化发育,一、造血器官与造血微环境 二、造血干（祖）细胞的分化与调控 三、细胞凋亡的概念 四、血细胞的成熟规律 五、血细胞瑞特-吉姆萨染色形态学特征,一、造血器官与造血微环境,（一）造血器官 造血细胞包括红细胞、粒细胞、

4、巨核细胞、淋巴细胞、单核细胞和浆细胞等系统。能够生成造血细胞并支持其分化、发育和成熟的器官称为造血器官。各种血细胞在造血器官内的生成过程称为造血。 在人体发育的不同阶段，主要造血器官是不相同的。,1胚胎期造血器官,（1）中胚叶造血期 （2）肝造血期 （3）骨髓造血期,2出生后造血器官,（1）骨髓造血：红骨髓、黄骨髓 （2）淋巴器官造血：胸腺、脾、淋巴结 （3）髓外造血,一、造血器官与造血微环境,一、造血器官与造血微环境,（二）造血微环境 是由除造血细胞以外的所有参与调控造血的间质成分构成的空间。包括微血管系统、末梢神经、基质细胞和基质细胞分泌的细胞因子，是造血干细胞赖以生存的场所。在适宜的造血

5、微环境中，造血细胞在各种成分的调控下得以增殖、分化、发育和成熟。,二、造血干（祖）细胞的分化与调控,（一）造血干（祖）细胞的分化 造血干细胞（HSC）基本特征： 1有自我更新和自我维持能力 HSC只进行不对称有丝分裂。 2有多向分化能力 HSC能分化为髓系和淋巴系祖细胞。 3具有多态性 HSC群体在形态和生物特性及表面标志上不同。,二、造血干（祖）细胞的分化与调控,造血祖细胞（HPC）：由造血干细胞分化而来。这类细胞部分或完全失去了自我更新能力，只能定向分化为各系统的原始、幼稚细胞，故又称为造血定向干细胞。,二、造血干（祖）细胞的分化与调控,（二）造血的调控 造血干（祖）细胞的增殖、分化和成熟

6、过程是受多种因素影响的复杂活动，如基因水平调控、神经体液因子、体液调控等。不同方面信息相互结合，对造血细胞发挥综合的调控作用。,三、细胞凋亡的概念,细胞的死亡有两种形式，一种是细胞坏死，另一种则是细胞凋亡。凋亡一种细胞死亡的生理形式，是在基因的控制下细胞自主死亡的过程，又称为程序性细胞死亡。 现已证明细胞凋亡具有复杂的分子调控机制，具有重要的生物学意义。细胞凋亡与许多临床疾病的发病机制有关。,四、血细胞的成熟规律,（一）血细胞的发育成熟 血细胞的成熟是指由原始阶段细胞经幼稚到成熟细胞的发育过程，发育成熟过程是连续性的。,四、血细胞的成熟规律,为掌握细胞的发育成熟程度，动态地观察细胞的变化情况，

7、特将各系细胞按其发育过程中形态变化特征和功能的成熟度，划分为原始、幼稚、成熟三个阶段。幼稚阶段形态变化比较大的再细分为早幼、中幼、晚幼三个时期。,四、血细胞的成熟规律,（二）骨髓血细胞的形态演变规律 在骨髓血细胞发育成熟过程中，其外部形态和内部结构都在不断地发生变化。细胞正常发育演变有一定的规律性，如表15-2所示。,四、血细胞的成熟规律,五、血细胞瑞特-吉姆萨染色形态学特征,（一）造血干细胞及各系祖细胞 （二）红细胞系 （三）粒细胞系 （四）巨核细胞系 （五）单核细胞系 （六）淋巴细胞系 （七）浆细胞系 （八）其他细胞及有关成分,五、血细胞瑞特-吉姆萨染色形态学特征,（一）造血干细胞及各系祖

8、细胞 造血干细胞和各系祖细胞分布于造血组织和血液中，细胞数量很少。在瑞特-吉姆萨染色法中只能识别原始阶段及其以后的细胞，对于干细胞只能用脾集落形成试验和体外培养等方法进行检测。其瑞特-吉姆萨染色形态为直径710m的圆形细胞，核圆或有切迹，染淡紫色，结构均匀纤细，胞质染淡蓝色，不含颗粒。,五、血细胞瑞特-吉姆萨染色形态学特征,（二）红细胞系 红细胞系祖细胞在促红细胞生成素的作用下分化为原始红细胞，通过35次有丝分裂，在形态上经过原始、早幼、中幼、晚幼红细胞阶段，脱核成网织红细胞，而后成熟。正常情况下，中幼及其以前的幼稚红细胞，均具有分裂增殖能力，其中早幼和中幼红细胞均可分裂12次。,1红细胞系的

9、正常形态,（1）原始红细胞：胞体直径1520m，圆形或椭圆形，边缘常有伪足或突起。胞核大，约占细胞体积的4/5，圆形或椭圆形，居于细胞中央或稍偏位，染色质为细致的颗粒状，较原始粒细胞稍粗而紧密，染紫红色，可见12个核仁，核膜清楚。胞质量较少，因含有大量游离核糖体，而呈浓密的油墨蓝色，近核处着色浅淡，称核周淡染区，无颗粒。其分裂相染色体粗短，呈1821锐角。,原始红细胞,1红细胞系的正常形态,（2）早幼红细胞：略似原始红细胞，但细胞开始变小，胞体直径1518m，呈圆形或椭圆形。胞核仍占细胞大部分（2/3以上），圆形，多居中，染色质较原始红细胞更紧密并已开始聚集，核仁模糊或消失。胞质量稍多，呈蓝色

10、或稍变浅。,早幼红细胞,1红细胞系的正常形态,（3）中幼红细胞：胞体明显变小，直径815m，圆形。核占细胞的2/31/2，呈圆形，多居中，染色质粗糙浓染，呈团块状或索条状，有明显空隙，呈打碎的墨块状，染深紫红色，核仁消失。胞质量增多，因多少不等的血红蛋白与聚核糖体同时存在而呈不同程度的嗜多色性，染灰蓝色、灰色或灰粉色。,中幼红细胞,1红细胞系的正常形态,（4）晚幼红细胞：胞体更小，直径710m，圆形。胞核小于细胞直径的1/2，早期尚可见墨块状结构，晚期多固缩，染深紫红色，多居偏位，有的细胞可见欲脱核状。胞质因充满血红蛋白，染粉红色。,晚幼红细胞,1红细胞系的正常形态,（5）网织红细胞：见第四章

11、第五节。 （6）红细胞：为红细胞系完全成熟的细胞，见第四章第一节。,2幼稚红细胞的异常形态,（1）巨幼红细胞：它是胚胎早期的幼稚红细胞，出生后仅见于叶酸、维生素B12缺乏的巨幼细胞性贫血或某些血液病时。其形态特征是胞体较一般正常幼稚红细胞为大，胞质丰富，胞核的成熟落后于胞质，染色质细致、疏松。巨幼红细胞的发育也有原始、早幼、中幼、晚幼四个阶段，成熟后为巨红细胞。,原始巨幼红细胞,早巨幼红细胞,中巨幼红细胞,晚巨幼红细胞,2幼稚红细胞的异常形态,（2）红细胞巨幼样变（类巨幼红细胞）：为幼稚红细胞的不典型巨幼红细胞样变化，多见于早幼、中幼阶段。其体积稍大，核圆或畸形，染色质浓集，粗而不匀，胞质量丰

12、富，有时受色可呈假颗粒状或泡沫样。常见于白血病、肿瘤等患者，尤其在化疗后更常见。,2幼稚红细胞的异常形态,（3）巨型原始红细胞：胞体直径3060m。见于急性造血机能停滞，是由于某种因子阻断了原始红细胞向下发育所致，其形态结构大体与原始红细胞相似。,2幼稚红细胞的异常形态,（4）空泡型红细胞：早幼、中幼红细胞的胞质中出现 320个直径小于lm的小空泡。苏丹黑、糖原染色均呈阴性。见于氯霉素或酒精中毒的患者。 （5）异常成熟红细胞：请参见第四章第八节。,五、血细胞瑞特-吉姆萨染色形态学特征,（三）粒细胞系 髓系干细胞在粒-单集落刺激因子（GM-CSF）及白细胞介素-3（IL-3）等影响下，分化发育成

13、为粒-单系祖细胞，然后分化为粒系祖细胞，再进一步分化发育成为原始、早幼粒细胞，又经过中幼、晚幼、杆状、分叶阶段而成熟。,1粒细胞系的正常形态,（1）原始粒细胞：胞体直径1018m，圆或椭圆形。核大而圆，约占细胞体积的4/5以上，偏位或居中，染色质呈细颗粒状，均匀平坦如一层薄纱，核膜不明显，有25个淡蓝色清晰小核仁。胞质量少，呈水彩蓝色，一般无颗粒。原始粒细胞过氧化物酶染色早期阴性，后期可见阳性颗粒。,原始粒细胞,1粒细胞系的正常形态,（2）早幼粒细胞：胞体直径1220m，圆形或椭圆形，略大于原始粒细胞。核圆或椭圆，多偏位，染色质开始聚集，呈较粗的颗粒网状，有时可见核仁。胞质量增多，染稍淡蓝色，

14、含数量不等、大小不一、分布不匀的紫红色嗜天青颗粒（又称非特异性颗粒），早期较少，晚期较多。近核旁常有一不着色区，其间无颗粒。过氧化物酶染色呈阳性反应。,早幼粒细胞,1粒细胞系的正常形态,（3）中幼粒细胞：中幼阶段胞质中开始出现不同的特异性颗粒，即中性、嗜酸性和嗜碱性颗粒，藉此可明确地区分出中性、嗜酸性和嗜碱性中幼粒细胞，其中以中性中幼粒细胞为主。,1粒细胞系的正常形态,中性中幼粒细胞：胞体直径1018m，早期者较大。胞核多偏位，略小于早幼粒细胞，占细胞体积的2/31/2，椭圆形或一侧开始变平。染色质粗于早幼阶段，呈致密索块状，早期尚可见核仁轮廓，晚期核仁消失，核膜明显。胞质染淡红或淡蓝色，其中

15、充满细小、密集的淡紫红色特异性中性颗粒，早期尚可见个别残留的嗜天青颗粒。,1粒细胞系的正常形态,嗜酸性中幼粒细胞：胞体直径1520m，胞核与中性中幼粒细胞相似。胞质内充满粗大、均匀、排列紧密的橘红色嗜酸性颗粒。早期个别颗粒不成熟，可呈嗜碱性。,1粒细胞系的正常形态,嗜碱性中幼粒细胞：少见。胞体直径1015m。胞核圆或椭圆形，轮廓不清楚，染色质较模糊，胞质内含有数量不多、分布不均、大小不等的黑紫色嗜碱性颗粒，有的压在核上，可因染色时溶解或由于脱颗粒而成为小空泡。,中性,嗜酸,嗜碱,中幼粒细胞,1粒细胞系的正常形态,（4）晚幼粒细胞： 中性晚幼粒细胞：胞体略小于中幼阶段，直径1016m。胞核明显缩

16、小，通常小于细胞体积的1/2，一侧凹陷呈肾形、半月形等。染色质浓集成块、紧密深染，无分裂象。胞质量多，染粉红色，充满淡紫红色中性颗粒。,1粒细胞系的正常形态,嗜酸性晚幼粒细胞：胞体大小及核的形态与中性晚幼粒细胞相似，胞质内充满嗜酸性颗粒。 嗜碱性晚幼粒细胞：少见。胞体直径1015m。胞核卵圆、半月形，略有凹陷，常因颗粒遮盖而轮廓不清。胞质中及核上可见少量分布不均的嗜碱性颗粒。,中性,嗜酸,嗜碱,晚幼粒细胞,2粒细胞的异常形态,（1）白血病性粒细胞：其常见的特征为：原始粒细胞大小异常，如小原粒型、大原粒型或大小原粒混合型；核形畸变，如凹陷、折叠、肾形、分叶及扭曲等，因分裂异常而呈双核、母子核、蝶

17、形核等；核仁增大、融合、畸形等；胞核与胞质发育不同步，如胞质中颗粒早熟，原始粒细胞胞质中出现较多的嗜天青颗粒或Auer小体，后者是急性非淋巴细胞白血病诊断标志之一。,2粒细胞的异常形态,（2）粒细胞分叶过多和巨幼变：是维生素B12或叶酸缺乏导致的核酸代谢障碍在粒细胞中的反映，常见中幼、晚幼、杆状核粒细胞出现胞体及胞核变大，并呈幼稚样变化，如核肿胀、疏松，胞质中颗粒减少等，而成熟粒细胞分叶过多（610叶）。此现象也可见于慢粒、红白血病及一些骨髓增殖性疾病的化疗之后。,2粒细胞的异常形态,（3）Pelger-Hut畸形：有原发性和继发性两种。前者中性粒细胞呈先天性分叶过少现象。成熟粒细胞核似晚幼阶

18、段不分叶，且畸形，如肾形、哑铃形、蝶形等。杆状核也粗短。染色质细密，紧缩，浓集成块或索网状，深染。畸形也可涉及嗜酸性粒细胞。此畸形属家族性粒细胞异常，为常染色体显性基因遗传，一般不影响健康。继发性者可见于慢性粒细胞性白血病、骨髓异常增生综合征等。,2粒细胞的异常形态,（4）Jordan异常：本病为家族性疾病，特征是粒细胞及单核细胞的胞质中出现空泡。也可涉及淋巴细胞、浆细胞，但不见于原始阶段细胞。有报告检出此种异常者伴发进行性肌麻痹症或鱼鳞癣。 （5）粒细胞毒性变、退行性变 (参见第三章第五节),五、血细胞瑞特-吉姆萨染色 形态学特征,（四）巨核细胞系 巨核系祖细胞经巨核细胞集落刺激因子（Meg

19、-CSF）和血小板生成素（thrombopoietin, TPO）的刺激分化发育，形成成熟巨核细胞，并产生血小板。,1巨核细胞系的正常形态,（1）原始巨核细胞：胞体直径1530m，呈不规则圆形。胞核较大，染暗紫红色，圆或椭圆，常有凹陷或折叠。染色质粗粒状，有聚集紧密感，可见23个不规则的核仁，不清晰，有凹陷感。胞质量少，边缘不规则，常有小突起，染深蓝色，周边浓染，不含颗粒。,原始巨核细胞,1巨核细胞系的正常形态,（2）幼稚巨核细胞：胞体直径3050m。核呈肾形或不规则形，染色质呈粗颗粒或小块状，核仁可有可无。胞质量增多，外形不规则，可有伪足。染深蓝色或粉蓝色，核周出现少许嗜天青颗粒。,幼稚巨核

20、细胞,1巨核细胞系的正常形态,（3）颗粒型巨核细胞：胞体直径4070m，有时可达100m，外形多不规则。核形不规则或分叶，染色质粗糙紧密，呈索条状或块状，不见核仁。胞质丰富，染粉红色或淡蓝色，如充满细小紫红色颗粒则呈浓厚的紫红色或淡红色。无血小板生成，细胞周围可附有血小板。,颗粒巨核细胞,1巨核细胞系的正常形态,（4）产生血小板型巨核细胞：为完全成熟的巨核细胞，胞体直径40100m，有时可达100m以上。细胞质局部或全部形成血小板雏形，胞质边缘不完整，可有伪足伸出，周围已有血小板脱落，待胞质完全脱落后只剩核时则称裸核型巨核细胞。,产血小板巨核细胞,2巨核细胞的异常形态,（1）小型巨核细胞：胞体

21、直径1020m，甚至更小，多为一个核，较大型者可有两个或多个核，染色质因高度深染常看不清结构，偶见12个小核仁。核周围有少量或中等量的不规则胞质，常有伪足样突起。胞质内颗粒丰富或颗粒过少甚至缺失，因而染粉色、蓝色或蓝粉色，周围常可见血小板。小巨核细胞常见于慢性粒细胞性白血病、巨核细胞白血病、骨髓增生异常综合征等。,2巨核细胞的异常形态,（2）巨核细胞分叶过多和巨大变化：在缺乏维生素B12或叶酸时，巨核细胞呈巨大、幼稚、多叶等变化。在恶性贫血和巨核细胞白血病时，可见多核现象。 （3）变性巨核细胞：多见于幼稚阶段巨核细胞。胞体大，胞质丰富，染蓝色，呈玻璃样变，颗粒少或无颗粒，可见空泡，核中也可见空

22、泡。常见于特发性血小板减少性紫癜患者的骨髓涂片中。 （4）异常血小板。,考考你,各阶段幼稚血细胞都有自己的特征，你能找出下列细胞的分界线吗？ （1）中幼红细胞与晚幼红细胞； （2）原始粒细胞与早幼粒细胞； （3）早幼粒细胞与中幼粒细胞； （4）幼稚巨核细胞与颗粒型巨核细胞； （5）颗粒型巨核细胞与产血小板型巨核细胞。,五、血细胞瑞特-吉姆萨染色形态学特征,（五）单核细胞系 单核细胞来自粒-单核系祖细胞。粒-单核系祖细胞在巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的作用下，分化为单核系祖细胞，继而进一步分化发育，经过原始、幼稚阶段，34次分裂增殖后而成熟。单核细胞非终末细胞，进入组织或体腔后，发育成巨噬

23、细胞。,1单核细胞系的正常形态,（1）原始单核细胞：胞体直径1520m，呈圆形或不规则形。核大，圆或不规则形，扭曲折叠，染色质纤细疏松似网，染淡紫红色，核膜不明显，有13个圆形或椭圆、甚至不规则的核仁。胞质量较其它原始细胞丰富，染不透明的蓝色或灰蓝色，无颗粒，偶见钝伪足。,1单核细胞系的正常形态,（2）幼稚单核细胞：胞体直径1525m，圆形或不规则形。核大，多不规则，可呈凹陷、切迹或折叠状。染色质略粗于原始阶段，核仁不清晰或消失。胞质量多，染灰蓝色，近核处出现细小的紫红色嗜天青颗粒。,原始单核细胞和幼稚单核细胞,2单核细胞的异常形态,（1）白血病性单核细胞：白血病时单核细胞可有胞核胞质发育不同

24、步现象，核形异常，呈笔架状、杆状、分叶状等。胞质出现Auer小体等病理性形态变化。 （2）毒性和退行性变：单核细胞核肿胀，染色质松散，胞质嗜酸性变，出现空泡、毒性颗粒等。,2单核细胞的异常形态,（3）激活型单核细胞：单核细胞在炎症刺激特别是某些毒性强的急性或慢性刺激时，出现增生，胞体变大，直径达2030m，核形多样化，胞质丰富，常有多个伪足。有时可见空泡或吞噬异物，可能是单核细胞向巨噬细胞过渡的形态。,五、血细胞瑞特-吉姆萨染色 形态学特征,（六）淋巴细胞系 本系由淋巴系干细胞进一步分化而来，过氧化物酶染色阴性。在光学显微镜下，仅能区别原始、幼稚、成熟阶段，而不能区别T淋巴细胞和B淋巴细胞。,

25、1淋巴细胞的正常形态,（1）原始淋巴细胞：胞体直径1018m，圆或椭圆形。胞核较大，占整个细胞的大部分，居中或偏位，多为圆形或椭圆形，有时可见浅切迹，染色质呈颗粒状，但比原始粒细胞粗，在核仁及核膜周围聚集使核膜清楚，有清晰的淡蓝色小核仁，多为12个，有凹陷感。胞质量少，呈透明蓝色，环核淡染区明显，无颗粒。,原始淋巴细胞,1淋巴细胞的正常形态,（2）幼稚淋巴细胞：胞体直径1016m。胞核圆形或椭圆形，居中或偏位，染色质较原始淋巴细胞略粗糙，排列较紧密，核膜明显，核仁模糊或消失。胞质量略增多，呈淡蓝色，偶见少许圆形粗大的暗紫红色嗜天青颗粒，一般不超过10颗。,幼稚淋巴细胞,2淋巴细胞的异常形态,（

26、1）白血病性淋巴细胞：急性淋巴细胞性白血病时，原始淋巴细胞或幼稚淋巴细胞变化很大，有大型、小型和混合型等类型，核有凹陷、切迹或不规则形。染色质丰富，呈粗颗粒状，致密浓染。核仁异常，胞质量少，可有空泡。慢性淋巴细胞性白血病的淋巴细胞核多有切迹，核浓缩紧密，染深紫黑色，胞质量极少。 （2）异型淋巴细胞：常见于病毒感染时。其形态特征请参见第十七章第三节。,五、血细胞瑞特-吉姆萨染色 形态学特征,（七）浆细胞系 浆细胞是高度分化的淋巴细胞，是由B淋巴细胞转化而来。各期浆细胞过氧化物酶染色均为阴性。,1浆细胞的正常形态,（1）原始浆细胞：胞体直径1418m，椭圆或圆形。核大，占细胞的2/3以上，圆形，常

27、偏于一侧或略偏，染色质较粗疏，呈颗粒网状，核仁25个。胞质量较多，染深蓝或灰蓝色，有浑浊感，有不明显的核旁淡染现象，无颗粒。,原始浆细胞,1浆细胞的正常形态,（2）幼稚浆细胞：胞体直径1216m，椭圆或圆形。核占细胞的1/2以上，偏于一侧或略偏，圆或椭圆形，染色质开始聚集，核仁模糊或消失。胞质染深蓝色或呈嗜多色性，有浑浊感，可见半圆形核旁淡染区，称初浆区，有时可含有空泡或少数嗜天青颗粒。,幼稚浆细胞,1浆细胞的正常形态,（3）浆细胞：胞体直径815m，椭圆形或不规则形。核小，占细胞的1/3以下，圆或椭圆形，明显偏位，核的长轴与胞体长轴相垂直。染色质紧密成块，似龟背或车轮状，核膜清楚。胞质量丰富

28、，染深蓝、灰蓝或红蓝相混色，有泡沫感，核旁淡染区明显。浆细胞多成片增殖于血管壁周围，正常骨髓中有少量，慢性炎症时易见到。,浆细胞,2浆细胞的异常形态,在病理情况下，浆细胞可出现异常形态，如火焰细胞、拉塞尔（Russell）小体、莫特（Mott）细胞、晶状体及大小异常等，常见于多发性骨髓瘤，也可见于反应性浆细胞增生及浆细胞白血病等。,异常浆细胞,五、血细胞瑞特-吉姆萨染色 形态学特征,（八）其他细胞及有关成分 1网状细胞 2内皮细胞 3吞噬细胞 4组织嗜碱细胞 5成骨细胞,6破骨细胞 7脂肪细胞 8各种退化的细胞成分 9幼红细胞造血岛,第二节 细胞化学染色及临床应用,一、过氧化物酶染色 二、中性

29、粒细胞碱性磷酸酶染色 三、铁粒染色 四、糖原染色 五、酯酶染色,血细胞化学染色,血细胞化学染色是以形态学为基础，结合化学或生物化学技术，对血细胞内各化学成分、代谢产物作定位、定性、半定量和定量观察的方法。血细胞化学染色可用于研究血细胞的生理、病理，为血液病的诊断和鉴别诊断，判断疗效及观察预后，提供重要依据。,血细胞化学染色的基本要求,血细胞化学染色的基本要求是：原位显示细胞成分和结构；在染色时尽可能保持细胞的生前结构、化学成分和酶的活性；反应产物在显微镜下具有一定的稳定性，成为不移位的有色沉淀。,血细胞化学染色,血细胞化学染色可以显示的细胞成分包括：蛋白质（包括一些酶类和氨基酸等）、核酸（包括

30、RNA、DNA）、糖原、脂类等。 进行血细胞化学染色，要经过固定、显示（染色）和对有关成分进行定性或定量分析三个阶段。,1固定,固定的目的是将细胞的生前结构和化学物质保存下来。固定的方法有物理法和化学法。物理法有冻结干燥和火焰固定等，化学法最常用的是甲醛、乙醇、丙酮和乙酸固定等方法。化学固定法在细胞化学染色中应用较广。,2细胞化学的显示(1),常用的显示手段有：金属沉淀法，如显示维生素C或磷酸酶等；偶氮偶联法，如显示氨基酸、磷酸酶、非特异性酯酶、SH基等；碱性复红反应（Schiff醛反应），如显示糖原、DNA等；联苯胺反应，显示过氧化物酶；普鲁士蓝反应，显示三价铁等。,2细胞化学的显示(2),

31、其他尚有物理学方法，如脂溶染色显示脂质、荧光显示、放射自身显影、偏光显微镜、相差显微镜等技术。体外活体染色和细胞免疫化学染色亦常用于临床细胞学诊断。,3细胞化学定性和定量分析(1),可有几种方法。最简单的是粗略估量，按染色反应的强弱、受色的深浅，人为地划分为、+、+、+、+五个等级。也可用百分法反映细胞阳性率，但不能反映受色的强弱。积分法是常用的半定量法，将上述的等级估量与百分率相结合进行计算，它既能反映细胞阳性率的高低，又能反映细胞受色的强弱。,3细胞化学定性和定量分析(2),最精确的定量手段则是用显微分光光度计测定单个细胞内化学成分含量，以细胞受色反应的强弱比色，常用于DNA定量、精氨酸测

32、定和各阶段幼稚红细胞胞质中血红蛋白定位、定量等。,一、过氧化物酶染色,（一）四甲基联苯胺法 （二）改良Pereira碘化钾法 （三）苏丹黑B（SB）染色,（一）四甲基联苯胺法,原理 粒细胞和单核细胞的胞质中含有过氧化物酶（peroxidase，POX），能催化过氧化氢释放出新生态氧，氧化无色的受体四甲基联苯胺，使其生成蓝色的四甲基联苯胺蓝，后者再与亚硝基铁氰化钠结合，形成呈稳定的蓝色颗粒，原位沉淀于细胞质中。,（一）四甲基联苯胺法,试剂 14.16mmol/L TMB液 2亚硝基铁氰化钠饱和液 3稀过氧化氢液（用前配制） 4瑞特染液,（一）四甲基联苯胺法,操作 1临用时取4.16mmol/L

33、TMB乙醇液lml加亚硝基铁氰化钠饱和液10l，使之成淡棕黄色液体。 2在新鲜干燥的血片或骨髓片上，加上述混合液0.5ml，涂抹使其盖满膜面，固定lmin，再加稀过氧化氢液0.7ml，混合染色6min。 3流水洗去染液，再用瑞特染液作对比复染1015min，洗去染液，干后油镜检查。,（一）四甲基联苯胺法,结果 阳性：胞质中含蓝绿色颗粒（瑞特染液复染者呈蓝黑色），强阳性者色深，颗粒粗大紧密；弱阳性者呈少量稀疏细小的蓝色颗粒。 阴性：无蓝色颗粒。,四甲基联苯胺法各系细胞染色表现,（1）粒细胞系：除早期原始粒细胞阴性外，晚期原始粒细胞及以后各阶段细胞均含有不同程度的蓝绿色颗粒，随粒细胞的成熟而增多，

34、直至充满胞质。但衰老的中性粒细胞过氧化物酶的活性降低，反应程度减弱，甚至呈阴性反应。嗜酸性粒细胞颗粒更粗大，呈深蓝色。嗜碱性粒细胞为阴性。,四甲基联苯胺法各系细胞染色表现,（2）单核细胞系：除早期原始阶段呈阴性反应外，其它阶段多呈弱阳性反应，其颗粒细小，散在分布，部分细胞可呈阴性反应。 （3）某些网状细胞及吞噬细胞：可呈不同程度的过氧化物酶阳性反应。 （4）其他血细胞过氧化物酶染色皆为阴性。,过氧化物酶染色阳性,过氧化物酶染色的临床应用,主要是帮助鉴别急性白血病的类型。急性淋巴细胞白血病时POX呈阴性反应，FAB分型规定原始和幼稚细胞阳性率3。急性髓系白血病时呈阳性反应，在急性粒细胞白血病时，

35、其细胞多呈阳性反应；急性单核细胞白血病时，多呈弱阳性反应。,（二）改良Pereira碘化钾法,原理 细胞中的过氧化物酶分解过氧化氢，产生新生态氧，碘化钾在新生态氧的氧化作用下生成碘，碘与煌焦油蓝形成蓝绿色复合物，定位于胞质中。,（二）改良Pereira碘化钾法,试 剂 1固定液 2pH5.5磷酸盐碘化钾缓冲液 310g/L煌焦油蓝水溶液 4过氧化氢液 5染色应用液 临用时取pH5.5磷酸盐碘化钾缓冲液5ml，加煌焦油蓝水溶液25滴和过氧化氢液13滴，混匀后4小时内用完。,（二）改良Pereira碘化钾法,操 作 1新鲜血片或骨髓片置于固定液中固定3060s。 2流水冲洗1015s，晾干。 3加

36、染色应用液盖满片膜，染色25min，弃去染液，晾干。 4油镜下观察。,（二）改良Pereira碘化钾法,结果 过氧化物酶染色阳性产物呈蓝绿色颗粒，分布在细胞浆内或盖在核上。未出现者为阴性反应。成熟红细胞染均匀淡绿色，有核细胞的核染紫红色，胞浆一般为淡紫灰色，各系细胞核浆受色不一样，易于区分。,（三）苏丹黑B（SB）染色,苏丹黑B染色也是一种鉴别细胞类型的细胞化学染色法，其原理为SB是一种脂溶性染料，可溶解于细胞质内的中性脂肪、磷脂及类固醇结构中，而使胞质中的脂类物质呈棕黑色或深黑色颗粒显示出来，即使是细胞内微细结构的脂类也可显示。 血细胞SB染色结果基本与过氧化物酶染色相同，二者临床意义也相似

37、。,二、中性粒细胞碱性磷酸酶染色,（一）Kaplow偶氮偶联法 （二）改良Gomori钙-钴法,（一）Kaplow偶氮偶联法,原 理 中性粒细胞胞质中的碱性磷酸酶（neutrophil alkaline phosphatase，NAP），在pH9.29.8缓冲液中，能水解基质液中的磷酸萘酚钠，释放出磷酸与萘酚，萘酚再与重氮盐偶联成不溶性有色偶氮染料，沉淀于细胞质中。,（一）Kaplow偶氮偶联法,试 剂 1固定剂 2丙二醇缓冲液 （1）贮备液（0.2mol/L 2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇液 （2）应用液（0.05mol/L pH9.75） 3基质液（用前临时配制） 410g/L亮绿,（

38、一）Kaplow偶氮偶联法,操 作 1新鲜血片或骨髓片用410的固定剂固定30s。 2蒸馏水洗片。在涂片上滴加新配过滤的基质液，在室温下作用1015min。 3水洗。10g/L亮绿复染 2min。 4水洗。晾干镜检。油镜观察。,（一）Kaplow偶氮偶联法,结 果 中性粒细胞胞核与胞质均染成绿色，阳性时出现碱性磷酸酶颗粒，因重氮试剂不同，碱性磷酸酶颗粒呈红色或紫黑色沉淀。,（一）Kaplow偶氮偶联法,计分方法 在镜下计数100个成熟中性粒细胞，按胞质中沉淀的阳性颗粒的多少，分五级计分。求出每一级计分所占计数细胞的百分率，将其百分率乘以该分值，得出该级细胞的积分，然后将各级细胞的积分相加，即为

39、总积分值。全部阳性反应的百分率相加即为阳性率。,（一）Kaplow偶氮偶联法,参考值 成人中性粒细胞碱性磷酸酶阳性率平均为37.3%，以弱阳性为主。积分为751分。由于各实验室条件不同（如实验方法、试剂质量和结果判断），参考值有很大差别，最好建立自己实验室的参考值，这里的数据仅供参考。,（一）Kaplow偶氮偶联法,临床应用 中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）是成熟粒细胞S颗粒释放的一种酶。因此NAP活性反应主要出现于中性粒细胞成熟阶段，其他细胞皆为阴性。,（一）Kaplow偶氮偶联法,临床应用 NAP活性增高见于细菌性感染、类白血病反应、再生障碍性贫血、某些恶性肿瘤、急性淋巴细胞白血病及慢性粒细

40、胞白血病急性变时。,（一）Kaplow偶氮偶联法,临床应用 NAP活性减低见于慢性粒细胞白血病、急性粒细胞白血病、绿色瘤、红白血病、阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）、病毒感染等。,NAP染色可用于鉴别诊断(1),1慢性粒细胞白血病与中性粒细胞类白血病反应的鉴别 前者无继发感染时NAP活性明显下降，积分值常为零。但急性变时常明显增高。类白血病反应时则显著增高。 2PNH与再生障碍性贫血的鉴别 前者NAP活性常降低，后者NAP活性常增高。,NAP染色可用于鉴别诊断(2),3急性白血病细胞类型的鉴别 急性淋巴细胞白血病时活性增高，急性粒细胞白血病时活性降低。 4细菌与病毒性感染的鉴别 化脓性感染时

41、NAP活性明显增高，急性感染高于慢性感染，球菌感染高于杆菌感染，病毒性或寄生虫感染时无明显变化。,碱性磷酸酶染色,（二）改良Gomori钙-钴法,原理 中性粒细胞内的碱性磷酸酶在pH9.29.8时，将基质液中的-甘油磷酸钠水解，产生磷酸钠。磷酸钠与钙离子作用生成磷酸钙，磷酸钙与钴离子作用生成磷酸钴，磷酸钴与硫化铵反应生成黑色的硫化钴颗粒，沉淀于细胞胞质中。,（二）改良Gomori钙-钴法,试剂 1基质液(临用前配制) 220g/L硝酸钴水溶液 320g/L硫化铵（或用前以10ml蒸馏水加硫化铵4滴而成） 42g/L核固红染色液,（二）改良Gomori钙-钴法,操作 1取新鲜血片或骨髓片用95乙

42、醇固定510min，待干。 2置37基质液中温育46h，防止蒸发。 3水洗，用20g/L硝酸钴染5min。 4流水洗净硝酸钴，再以20g/L硫化铵染5min。 5流水洗净硫化铵，用2g/L核固红染液复染5min。 6流水冲洗，待干，油镜观察。,（二）改良Gomori钙-钴法,结 果 积分判断（一） 4分（+） 全细胞充满黑色颗粒，结成团块，甚至覆盖于细胞核上。 3分（+） 细胞质内充满黑色颗粒，但颗粒之间有空隙；或胞质内有3/4面积充满了致密的黑色颗粒沉淀。,（二）改良Gomori钙-钴法,结果 积分判断（二） 2分（+） 胞质面积的1/2呈黑色或灰黑色颗粒沉淀；或全部胞质染成均匀灰色，无颗粒

43、。 1分（+） 胞质面积的1/4呈黑色或灰黑色颗粒沉淀；或全部胞质染成均匀浅灰色，无颗粒。 0分（） 胞质内无灰色或黑色沉淀。,三、铁粒染色,人体中的铁以铁蛋白的形式存在。铁蛋白的聚合体称含铁血黄素。用普鲁士蓝反应可显示铁的存在，称为铁粒染色。骨髓中含有一定量的铁粒，称细胞外铁；红细胞胞质中含有铁粒，称为细胞内铁。胞质中含有铁粒的中、晚幼红细胞，称为铁粒幼红细胞；含铁粒的成熟红细胞，称为铁粒红细胞。,三、铁粒染色,原理 含铁血黄素中的铁离子在盐酸环境中与低铁氰化钾作用，成为蓝色的低铁氰化铁沉淀，定位于含铁的部位。,三、铁粒染色,试 剂 1酸性低铁氰化钾 2 2g/L核固红,三、铁粒染色,操 作

44、 1选髓粒丰富的骨髓片，用甲醇固定10min。水洗，待干。 2用新配制的酸性低铁氰化钾染液染色30min。若室温过低可置于垫湿滤纸的大培养皿中，覆盖后放37环境。 3用流水充分冲洗至少5min后，用核固红染液复染510min。 4流水冲洗，干后镜检。,三、铁粒染色,结 果 1细胞外铁 先用低倍镜观察涂片，特别是涂片尾部和髓粒附近，注意翠蓝色颗粒，再用高倍和油镜观察有无染成深蓝色的铁颗粒，按下列5级标准判断：,三、铁粒染色,结 果 （） 全片无细胞外蓝色颗粒。 （） 有少数蓝色颗粒，或偶见蓝色圆形小铁珠，珠粒似嗜酸性颗粒大小。 （+） 有较多的铁粒和小珠。 （+） 有许多铁粒、小珠和许多蓝色小块

45、。 （+） 有极多的铁粒、小珠和许多蓝色小块，密集成堆。,三、铁粒染色,结 果 2细胞内铁 油镜下计数100个中、晚幼红细胞，计算胞质中含有蓝色颗粒的细胞（铁粒幼红细胞）的百分率。根据细胞内颗粒的数目、大小、染色深浅和分布情况，将铁粒幼红细胞分为如下几型：,三、铁粒染色,结 果 型 幼稚红细胞质中仅含12个小铁粒。 型 幼稚红细胞质中含35个小铁粒。 型 含610个小铁粒或14个粗大颗粒。 型 含10个以上小铁粒或5个以上粗大铁粒。 型（环形铁粒幼红细胞） 含铁粒6粒以上（包括6粒），其中2/3以上的铁粒分布在核周，其围绕范围占核周的1/2以上。此为诊断铁粒幼红细胞性贫血的重要依据。,三、铁粒

46、染色,参考值 细胞外铁 +，多为+。 铁粒幼红细胞百分率1244，平均21.4，以型为主，仅见少数型，不见型、型及环形铁粒幼红细胞。所见铁粒细小浅染，呈散在分布。,三、铁粒染色,鉴别缺铁性与非缺铁性贫血 细胞外铁：反映骨髓中贮铁量。缺铁性贫血时细胞外铁显著减少，甚至为阴性。非缺铁性贫血如溶血性贫血、巨幼细胞性贫血时细胞外铁正常或增加。,三、铁粒染色,鉴别缺铁性与非缺铁性贫血 细胞内铁（铁粒幼红细胞）：反映骨髓中可利用的铁量。缺铁性贫血时铁粒幼红细胞明显减少，只占028，平均3.4，多为型细胞，铁粒细小、色淡。非缺铁性贫血，如巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、再生障碍性贫血等，铁粒幼红细胞增多，但仍以

47、、型为主。,三、铁粒染色,诊断铁粒幼细胞性贫血 铁粒幼细胞性贫血时，出现较多的环形铁粒幼红细胞，可占幼稚红细胞的15以上（正常人为0），细胞外铁也显著增多。铁粒染色是诊断铁粒幼细胞性贫血的重要方法,铁粒幼红细胞,环铁粒幼红细胞,细胞外铁,四、糖原染色,糖原是糖在体内的重要贮存形式，是细胞代谢时的能量来源，它在细胞内增多反映细胞生命力旺盛。临床常用的染色方法是过碘酸碱性复红反应，即过碘酸雪夫（periodic acid Schiffs）反应，简称PAS反应。,四、糖原染色,原 理 过碘酸氧化糖原中的1,2-乙二醇基，产生醛基，醛基与Schiff液中的无色品红结合，形成红色的化合物，定位于胞质中，

48、红色的深浅与细胞内参与反应的1,2-乙二醇基的量成正比。,四、糖原染色,试 剂 110g/L过碘酸 2Schiff液 320g/L甲基绿染色液,四、糖原染色,操 作 1新鲜血片或骨髓片用95乙醇固定10min，水洗，待干。 210g/L过碘酸氧化20min(冬天置37水浴)。 3水洗35分钟，洗掉多余的过碘酸，晾干。 4Schiff液室温下染色3060min。 5自来水冲洗5分钟，再用蒸馏水冲洗。 6用20g/L甲基绿复染1020分钟。 7流水冲洗，干后镜检。,四、糖原染色,操 作 8唾液淀粉酶对照片处理法：在已固定过的涂片上盖满正常人新鲜唾液，在37中保温30min，水洗，再按照上述步骤27进行。,四、糖原染色,结果 阳性反应为胞质出现红色颗粒、红色团块或弥漫红色，胞核染绿色。,四、糖原染色,正常血细胞的染色反应 （1）粒细胞系统：原始粒细胞为阴性。早幼粒细胞至中性分叶核粒细胞呈阳性反应，随细胞逐渐成熟阳性反应增强，多呈均匀细小红色颗粒。嗜酸性粒细胞颗粒本身不着色，而颗粒间的胞质呈红色。嗜碱性粒细胞为阳性反应，其表现为大小不一的紫红色颗粒。,中性粒细胞糖原染色,四、糖原染色,正常血细胞的染色反应 （2）红细胞系统：幼稚红细胞和红细胞均呈阴性反应。 （3）单核细胞：仅有少数细小弥漫性分布的阳性颗粒。 （4）淋巴细胞：大多数淋巴细胞为阴性反应，少数淋巴