植化方法学1.ppt

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1、植化方法学,天然药物化学教研室 邱 峰 2003年 4月,植化方法学（一） （各种色谱的分离原理及操作方法）,一、硅胶相关色谱 二、氧化铝相关色谱 三、聚酰胺柱色谱 四、葡聚糖凝胶柱色谱 五、大孔吸附柱色谱 六、离子交换柱色谱 七、反应薄层,一、硅胶相关色谱,1、硅胶的结构(SiO2.XH2O) 2、分离原理 吸附作用：氢键作用、偶极作用和静电作用等 吸附强度的大小取决于硅醇基类型、硅醇基数目（比表面积）、孔体积、平均孔径,OSiOSiOH,O,O,O,O,3、使用范围 由于硅胶的弱酸性、往往适合于分离黄酮、香豆素、蒽醌、萜、甾体等中性或弱酸性类化合物。,黄连生物碱的化学结构,薄层板： 硅胶G

2、薄层板， 110 C 活化1小时 展开剂： 乙酸乙酯-氯仿-甲醇-浓氨水-二乙胺 （8:2:2:1:0.5） 检测方式：UV366nm,黄连生物碱硅胶薄层层析图谱,4、常用硅胶的规格 100140目、100200目（75150m）、200300目（4575 m ）为柱层析硅胶 1040m为薄层层析硅胶 210 m为高效薄层或液相色谱硅胶 5、薄层层析硅胶的种类 硅胶G:含有石膏1214%，粒度1040m，pH67(10%)。 硅胶H:不含石膏，pH67(10%)。 硅胶GF254:含有石膏1214%，pH67(10%)，且含有少量的荧光剂。,6、硅胶含水量与活性之间的关系,细玻璃管法测定硅胶活

3、性 展开剂：苯,7、含水硅胶色谱 硅胶含水达17%以上为分配色谱，适宜分离生物碱、糖类、皂苷、有机酸等。表现在薄层和开放柱上，展开剂或洗脱剂为多相含水系统。,薄层板：硅胶H 展开剂： I: 正丁醇-乙酸乙酯-水 （4:1:1） II: 氯仿-甲醇-水 （65:35:10）下层 显色：10%硫酸,红参中人参皂苷的薄层色谱图,8、硅胶制备薄层 操作方法 1)、薄层的制备 2020cm2的玻璃板一般所用硅胶量为820g，5CMCNa的用量按1:22.5为宜，晾干，根据需要可进行活化。 2)、点样（1050mg） 用玻璃毛细管或移液管将样品溶液线形点样于硅胶板上，点样线宽度要适宜，过窄易超载，过宽影响

4、分离效果。 3)、展开 晾干点样处溶剂后，以选好的展开剂进行展开，对有些化合物预饱和一段时间，分离效果更好。,原点,前沿,4)、标记色带 取出薄层板，晾干，根据荧光画出色带，或部分显色确定色带的位置。 5)、剥离、提取 剥离色带部分的硅胶，以合适的溶剂直接提取或装入小玻璃柱进行洗脱。（忌用含水系统处理） 6)、浓缩 浓缩提取液或洗脱液得色带对应的化合物。多数情况下，需要进一步的精制或纯化处理。,8、制备薄层的操作,原点,前沿,制备薄层展开后的后处理,9、硅胶柱层析的操作（开放柱） 1)、拌样（干法上样）： 将分离样品溶于易挥散溶剂中，与三倍量的柱层析硅胶拌样。滴加样品溶液的同时应不断搅拌均匀，

5、一旦达到制剂软材程度应停止滴加样品溶液，晾干或低温干燥（注意有毒溶剂的处理）后再继续操作，直到样品溶液全部加入。 2)、装柱： 将拌样硅胶1020倍量的柱层析硅胶浸泡于起始溶剂中，搅拌赶出气泡，装入准备好的玻璃柱中，平衡至不再下降为止。 3)、上样： 待硅胶柱平衡好后，将干燥好的拌样硅胶用漏斗加入柱子上部（加入前要保证起始溶剂在柱子中足够的高度以免带入气泡）。 4)、加入保护硅胶或棉花：用起始溶剂洗脱至柱中上端溶剂颜色变浅或无色为止，然后加入适量硅胶或棉花起缓冲作用。,5)、柱层析洗脱剂的选择 起始溶剂原则上对被分离样品中的任何物质都没有洗脱能力。洗脱溶剂的选择以硅胶薄层板的层析行为为指导，被

6、分离成分的Rf值一般在0.10.2为宜（理论上为0.20.3）。,“注”：展开剂和洗脱剂的选择最好参考文献资料。 6)、更换洗脱剂 在一个洗脱剂系统下，一般要求至少洗脱35个保留体积，实验中可根据具体情况决定是否更换，比如到5个保留体积还有较大量的的物质被洗脱下来，就应当继续洗脱下去。 7)、保留体积的估算 浸泡硅胶的溶剂量 + 空柱溶剂量洗脱下来的溶 剂量=保留体积 8)、流速的提高：柱上端加压或下段流出口减压，特别是填料硅胶粒度小时可采用这两种方式加快洗脱速度。 9)、合并相同流份：硅胶薄层指导合并，流份体积根据硅胶柱大小和分离样品量确定。,10、硅胶中低压柱色谱及高效液相色谱,1)、流动

7、相的选择： 通过硅胶薄层摸索液相色谱条件，最好用高效薄层指导来选择流动相，其粒度接近于中低压柱填料的粒度，用自制的硅胶薄层选择流动相时注意粒度和含有水分的影响。另外也可用同类型填料的分析柱摸索流动相条件。 2)、样品溶液的处理： 尽可能选择流动相溶解样品，并用微孔过滤器过滤。选择极性大于流动相的溶剂配制样品溶液会因进样量的不同影响保留时间和分离效果。 3)、检测器的选择： 有紫外吸收的物质尽可能用紫外检测器，无紫外吸收的或紫外吸收较弱的可选用示差 检测器。目前出现的蒸发光散射检测器则是对几乎所有的非挥发性天然化合物适用。,11、硅胶干柱法（适用于有颜色或荧光的物质分离） 干柱层析的优点： 1)

8、、分离效果比湿装柱高。 2)、洗脱液的选择可直接套用薄层层析的最佳分离 条件。 3)、常采用塑料薄膜柱，对有荧光或颜色的物质， 可借助紫外灯分割各色带，避免交叉。 4)、适用于制备性分离。 5)、设备简单，消耗溶剂少，节省时间。,硅胶干柱法的操作,1)、填充： 将硅胶填料（可用薄层层析硅胶）装入玻璃柱或透明塑料薄膜柱中，注意不要留有空隙。 2)、上样： 将拌样硅胶均匀地加入柱的上端，并在拌样硅胶的上方加入与柱内径相同大小的原形滤纸。 3)、展开： 将薄层展开剂条件直接用于干柱层析上，配好足量的展开剂用分液漏斗滴加入柱中，待展开剂渗透到柱子的下端，即停止滴加。,4)、分割： 根据色带或荧光带做好

9、标记，然后用弯勺取出各标记带对应的硅胶（玻璃柱），塑料薄膜柱可直接切割。 5)、洗脱： 用合适的溶剂提取色带或荧光带硅胶，也可装入小玻璃柱用溶剂洗脱下来。 “注意点”： a ：上样量比正常的硅胶柱层析要少，一般1:1001:300； b ：上柱硅胶的粒度越小效果越好，一般用与薄层规格同样的硅胶H，大的开放柱粒度要大些。,12、与硅胶相关的反相色谱填料,常用的反相填料有RP-18(ODS)、RP-8和RP-2,13、反相分离色谱柱操作上的注意点,1)、流动相为含水系统，同样可由相应的TLC确定柱层析的色谱条件，常用的有机溶剂有甲醇、乙腈、四氢呋喃。 2)、柱层析的填料最好以甲醇浸泡上柱，然后用甲

10、醇洗脱23个保留体积，再用水置换出甲醇备用。 3)、样品最好用流动相溶解，尽可能避免溶解在有机溶剂的比例大于流动相的溶液中。 4)、对一些酸碱性物质，为了使峰形变锐，有时流动相加入少量的酸或水，或需配成缓冲溶液（普通的反相色谱柱可耐受的pH为29），实验完毕冲洗柱子时一定要先用水，然后用醇。,常见高效液相色谱柱的种类,鉴定化合物纯度的方法,1、熔点测定法 2、薄层色谱法 3、高效液相色谱法 4、核磁共振法 4、电泳法,二、氧化铝相关色谱,1、层析用氧化铝规格和种类 薄层：200300目 柱层：60100目，100200目 1)、碱性氧化铝：pH910，直接由氢氧化铝高温脱水制得。适用于对碱溶液

11、比较稳定的中性色素、甾族化合物、生物碱、醇以及其它中性、碱性物质的分离。 2)、中性氧化铝：可由碱性氧化铝水洗至pH7.5，经活化制得。中性氧化铝使用最广，适于醛、酮、醌、某些苷及酸碱溶液中不稳定的化合物如酯、内酯等化合物的分离。 3)、酸性氧化铝：加入2N盐酸处理，使水提液的pH为44.5，经活化制得。适用于酸性色素及某些醛酸的分离。,2、氧化铝的含水量与活性,3、氧化铝活性的测定 细玻璃管法（展开剂：苯）,4、氧化铝的再生 用甲醇、稀醋酸、氢氧化钠溶液及水洗涤，再经高温活化后，可重复使用。 5、氧化铝应用的局限性 一些酚性化合物（部分黄酮、香豆素类）、酸性物质（部分三萜酸）能与氧化铝结合。

12、此外，层析过程中引起的异构化、氧化、皂化、水合，以及脱氯化氢形成双键等反应，应引起操作者的注意。,三、聚酰胺相关柱色谱,1、聚酰胺的结构 常用有锦纶6(聚己内酰胺)和锦纶66(聚己二酰己二胺),2、聚酰胺的分离原理 1) 反相分配色谱（流动相：含水溶剂）： a、氢键吸附：聚酰胺分子内的酰胺键，可与酚类、酸类、醌类、硝基化合物等形成氢键，因而产生吸附作用。 b、非极性固定相：聚酰胺非极性脂肪链。 2) 正相分配色谱（流动相：有机溶剂）： 极性小的化合物先被洗脱下来，表现在薄层层析上比移值较大。 3、聚酰胺适用范围 黄酮、酚类、蒽醌类、萜类、甾体、生物碱、糖类等物质的分离；去鞣质。,4、聚酰胺的规

13、格 柱层析聚酰胺 2040目，60100目，100200目 薄层层析聚酰胺 200300目 5、层析聚酰胺粉的预处理 聚酰胺粉（锦纶）中常有两种杂质：原料单体、小分子聚合物和蜡质，在使用前需要预处理。 操作方法： 1)、以90%95%的乙醇浸泡，搅拌，除去气泡后装入柱中，用醇洗至洗液透明并在蒸干后无残渣或极少量，一般至少洗脱34倍的体积。 2)、依次用23倍体积的5%NaOH水溶液、2倍体积的蒸馏水、23倍体积的10%醋酸水溶液洗涤，最后用蒸馏水洗至中性。,6、聚酰胺柱层析操作 装柱：以含水溶剂系统层析，常以水装柱（反相分配色谱）；若以有机溶剂系统层析，常以极性较小的起始溶剂装柱（正相分配色谱

14、）。 加样：100ml的聚酰胺可吸附1.52.5g。干法上样可参照硅胶柱层析；湿法上样多用于反相分配色谱，样品溶于或至少均匀分散在水溶液中。 洗脱：根据聚酰胺薄层层析结果确定柱层析的条件。反相分配色谱一般用水、稀至浓的乙醇；正相分配色谱一般用氯仿、氯仿-甲醇的混合溶剂。 再生：5%NaOH洗涤至溶液颜色变淡，然后蒸馏水洗至pH89，再以2倍量10%醋酸洗脱，最后以蒸馏水洗至中性。,黄芩二氯甲烷提取物经硅胶柱分离后的一黄酮组分,Fr.145-236 (四个黄酮类化合物),Fr.23 B,Fr.33 A,Fr.42-52 D,Fr.55-63 C,Polyamide CHCl3 CHCl3-MeO

15、H (100:1-1:1),A,B,C,D,Fr.145-236中的四个黄酮类成分,四、葡聚糖凝胶柱层析 1、交联葡聚糖的化学结构,2、常用葡聚糖凝胶种类、分离原理 Sephadex G 系列分子筛,葡聚糖凝胶G系列的性质,Sephadex LH20分子筛和反相分配色谱 羟丙基交联葡聚糖凝胶，吸水量每克2ml。可在水和有机溶剂中使用，洗脱剂的选择从被分离物质的性质和溶解度两方面考虑。,3、葡聚糖凝胶柱色谱的操作 Sephadex LH20 1)、柱子的选择 细长柱(长11.5m，直径23cm) 2)、 浸泡 用上柱的洗脱溶剂浸泡34小时（分离小分子的G-10、15和LH20），然后搅拌排气泡。

16、 3)、 装柱 空柱加洗脱液1/4左右，尽可能一次性加入所有凝胶，沉降、平衡至柱床不再下降为止。柱床越高，分离效果越好。,4)、加样 待液面离柱床表面12mm时，用滴管加入样品溶液（洗脱剂溶解），样品溶液要尽量体积小、浓度大。 5)、洗脱 洗脱剂的选择根据上柱样品的性质和样品的溶解度。分离中性物质可选择水、电解质和缓冲液；对阻滞较强的组分，可选择含水有机溶剂，或单用有机溶剂。 6)、收集和检出 带有颜色的物质可根据外观色带判断； 有强UV吸收的物质可用紫外灯照射来区分色谱带； 无或较弱紫外吸收的物质可用薄层层析行为判断。 7)、再生 用0.5N 氢氧化钠和0.5N氯化钠混合液浸泡，再用水洗至中

17、性。,葛根素大鼠灌喂后尿中代谢产物的分离,葛根素及其在大鼠尿中的代谢产物,Sephadex G系列在操作上的注意事项 （分离寡聚糖、多糖、多肽、蛋白） 浸泡溶剂：非有机溶剂，主要有水、电解质和缓冲液。 洗脱溶剂：水、电解质和不同pH值的缓冲溶液。 检测方法：寡聚糖、多糖用硫酸显色法； 多肽、蛋白可用硫酸铜或考马思亮蓝显色,多糖分离实例,蛋白分离实例,植化方法学实验内容,一、普通硅胶柱色谱 二、制备薄层色谱 三、反应薄层 四、制备高效液相色谱,大黄中的主要化学成分,双蒽酮类成分（番泻苷A、B）、鞣质、没食子酸、二苯乙烯苷类成分。,植化方法学实验须知 1、大黄用量50g，提取溶剂95%乙醇，回流提

18、取 两次，每次200ml. 2、回收溶剂用常压蒸馏装置，可使用减压泵。 3、考虑实验室条件和时间原因，建议直接对提取浸 膏进行分离，不做分配萃取处理。提取浸膏的用 量根据色谱条件确定。 4、要求采用两种手段分离：硅胶柱色谱(2cm40cm) 和硅胶制备薄层色谱（每组10块2020cm2玻璃板 ，制备薄层需首日制备）。接硅胶玻璃柱下口的 塑料管须在准备室自制。,5、分离所用的玻璃仪器包括试管、锥形瓶、烧杯等 需要事先洗刷烘干。实验结束后清洗干净归原位。 6、建议首日完成大黄的提取、溶剂回收，拌样，合 并用薄层、制备薄层的制备。有时间的同学可摸 索柱色谱和制备薄层色谱的条件。 7、摸好色谱条件后应立即向准备实验的两位老师申 请订购溶剂的种类和数量（实验室事先只准备摸 条件的用量）。,8、实验室准备的溶剂：石油醚，氯仿，乙酸乙酯，丙酮，甲醇； 吸附剂：薄层色谱硅胶（1040m ），柱色谱硅胶（200300目）； 显色剂（装置）：1%氢氧化钾溶液，2%三氯化铁溶液，10%硫酸乙醇溶液，紫外灯。,9、回收溶剂或废溶剂禁止到入水槽，装入试剂瓶标明。 10、实验过程中使用石油醚等易燃易爆溶剂，实验室禁止用火。 11、实验过程中保持实验室清洁，实验结束时打扫卫生。 12、实验报告须每人上交一份，具体格式不限，但需达到让他人能够重复实验的程度，实验记录自存。,