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1、植物总DNA的提取,化学生物学实验,中南民族大学 药学院,化学生物学教研室,1.实验目的,1,2,学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。,学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。,2.实验原理,植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下， 结合 65 水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在
2、高盐（0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿 / 异戊醇 (24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。,由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/2801.8，纯的RNA样品A260/2802.0，并且1g/ml DNA溶液A260=0.020。,3.实验器材与试剂,1、高压灭菌锅 2、冰箱 3、恒温水浴锅 4、高速冷冻离心机
3、5、紫外分光光度计 6、剪刀 7、陶瓷研钵和杵子 8、磨口锥形瓶（50ml） 9、滴管 10、细玻棒 11、小烧杯（50ml） 12、离心管（50ml） 13、植物材料,3.实验器材与试剂,1、3CTAB buffer（pH8.0） 100mM Tris 25mM EDTA 1.5M NaCl 3% CTAB 2% -巯基乙醇 2、TE缓冲液（pH8.0） 10mmol/L TrisHCl 1mmol/L EDTA 3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V） 4、95乙醇 5、液氮,4.实验步骤,1、称取0.1g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。 2、将叶片剪成l cm长，置于预
4、冷的研钵中，倒入液氮，尽快将叶片研磨成 粉末。 3、将液氮挥发完后，加入0.5 ml预热（60）的CTAB提取缓冲液，转入 一离心管中，置于65水浴保温0.5 h，不时地轻轻摇动混匀。 4、取出稍冷后，加等体积的氯仿：异戊醇混合液，轻轻颠倒混匀，室温下 7000 rpm离心10 min。 5、用一开口较大的滴管将上层水相吸入另一干净的离心管中，加2倍体积 的乙醇（95%乙醇），轻轻混匀，使核酸沉淀下来，室温下10000 rpm 离心10 min。 6、倒掉上清夜，向离心管中加1 ml洗涤缓冲液，轻轻转动离心管，使核酸 沉淀悬浮起来，洗涤2 min，在室温下5000 rpm离心5 min。 7、重复洗涤一次，并于室温下使DNA沉淀干燥，变为透明状。 8、将DNA沉淀溶于100l TE溶液中，于-20保存备用。 9、用于后续浓度及纯度的检测，将DNA沉淀溶于1 ml TE溶液中，在分光 光度计上测定该溶液在260nm/280nm紫外光波长下的吸光度值。,5.注意事项,1.,液氮研磨时，小心操作，以免冻伤。,2.,所有操作均需温和，避免剧烈震荡。,6.思考题,1. CTAB、EDTA、巯基乙醇的作用分别是什么？,2. 液氮研磨的原理是什么？,