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1、植物组织或器官中 丙二醛含量的测定,制作人：刘新 单 位：生命科学学院 植物生理学教研室,一、实验目的,1.掌握植物体内丙二醛含量测定的原理及方法。 2.了解丙二醛积累对细胞的伤害,二、实验原理：,逆境,膜脂的过氧化作用,丙二醛,酸性,粉红色,三、实验材料：,受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片或衰老的植物器官（以正常条件下的作为对照）：,实验仪器：,紫外可见分光光度计 离心机,四、实验步骤：,1 MDA的提取 称2g叶片，加入5ml 磷酸缓冲液（50mmol，pH值为7.8）及少量石英砂，于冰浴中研磨提取，匀浆液以12000g 离心力作用下（4度）离心10min，其上清液即为MDA提取液。
2、 2 MDA的测定 取1ml MDA提取液，加3ml 27三氯乙酸和 1ml 2%TBA。混和液在95度水浴中保温30min后，立即置于冰浴中冷却，然后离心10min，于波长532nm和600nm下测定OD值。,五、结果计算,以测得的OD532减去OD600的非特异吸收值，按155mmol-1cm-1消光系数计算MDA含量。 分别计算衰老和对照组的值。 MDA浓度(mol/L)=6.45(D532-D600)-0.56D450 MDA含量(mol/g FW) D450、D532、D600分别代表450nm、532nm和600nm波长下的光密度值。,六、注意事项：,0.1-0.5的三氯乙酸对MD
3、ATBA反应较合适，若高于此浓度，其反应液的非专一性吸收偏高； MDA-TBA显色反应的加热时间，最好控制沸水浴10-15min之间。时间太短或太长均会引起532nm下的光吸收值下降； 如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间，最好使用低温离心机离心。 低浓度的铁离子能增强MDA与TBA的显色反应，当植物组织中铁离子浓度过低时应补充 Fe3+（最终浓度为0.5 nmolL-1） 可溶性糖与TBA显色反应的产物在532 nm也有吸收（最大吸收在450 nm），当植物处于干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高，必要时要排除可溶性糖的干扰。,思考题：,1. 通过丙二醛含量测定能够解决什么理论和实际问题？ 2. 说明膜脂过氧化作用的对植物的影响。 3. TBA为什么要溶解在三氯乙酸中？ 4. 为什么要测定反应液在600nm下的吸光度？ 5. 丙二醛反应液为什么加热时间过长会影响测定结果？ 6. 如果可溶性糖含量影响丙二醛含量的测定，你有什么办法消除其影响？ 7. 正常植物与衰老时相比丙二醛含量有什么变化，分析其原因。,