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1、,时间分辨荧光技术,一、回顾标记免疫学发展,标记免疫技术的检测水平,放射免疫 （精度：10-12mol/L ） 酶联免疫 （精度：10-9 mol/L ） 化学发光 （精度：10-15mol/L ） 电化学发光 （精度：10-17mol/L ） 时间分辨荧光（精度：10-18mol/L ）,放射性免疫分析法（RIA）,应 用 放免自60年代问世以来对临床诊断起了革命性的贡献，是一项较为成熟的诊断技术。 夹心法、竞争法的标记原理为以后的检测技术的发展奠定了基础。,问 题 放射性（125 I），对环境的污染及对身体的危害 125 I 的半衰期短而导致其试剂有效期短 被标记物的稳定性差 操作繁琐，费
2、时 无法保存备用,酶免疫分析法（ELISA）,应 用 酶免的最大优势在于避免了对环境和人体危害 试剂有效期较长 曾经一度被认为是取代放免的检测手段,问 题 灵敏度、重复性不及放免，易造成漏检和假阳性 因酶的纯度和反应过程容易受环境因素影响，导致稳定性不好,化学发光免疫分析法（chemiluminescent immunoassay）,应 用 单个样本检测速度快，适合做急诊 灵敏度较高 自动化程度高 分类： 以丫啶酯直接标记 以HRP标记，鲁米诺为发光底物Amerlite系统 以AP(碱性磷酸酶 )为标记物，AMPPD为发光底物,问 题 样品不能重复检测 本底较高 仪器故障率较高 试剂稳定性较差
3、 检测精度不高，在超微量分析及早期诊断方面能力不足 非开放性试剂；试剂价格高,电化学发光免疫分析法（ECL）,应 用 80年代末期问世的新型化学发光免疫分析方法 基本原理：根据三联吡啶钌Ru(bpy)3和三丙胺在电场触发下产生发光的化学发光反应 本底较小、灵敏度较高、线性范围较宽 以罗氏为代表,缺 点 非开放性试剂系统、不能做科研 试剂价格过高,二、时间分辨荧光技术 （Time-Resolved Fluorescence）,时间分辨荧光发展史,1979年，提出“时间分辨荧光免疫分析”理论，1989年该技术获诺贝尔化学奖提名。 90年代以来，时间分辨荧光分析技术因其灵敏度高，操作简便，标准曲线范
4、围宽，不受样品自然荧光干扰，无放射性污染等特点，其方法学研究和临床应用的发展十分迅速。 时间分辨荧光分析技术正在成为现代医学研究中最有发展前景的分析手段,时间分辨免疫荧光技术的定义,用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，标记抗原、抗体、激素、核酸探针等物质 当反应体系发生后，如抗原抗体免疫反应、核酸探针杂交等反应，经解离增强作用，用时间分辨荧光仪，测定最后产物的荧光强度 根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的,TRF分析原理图（1）,加样本,微量反应孔,包被好的抗体,振荡、洗板,待测项目（抗原）,加入Eu标,螯合剂,Eu,重链,振荡、洗板,加入解离增强液,
5、H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,仪器检测,标记物为稀土金属-镧系元素,铕(Eu)、钐（Sm)、镝(Dy)、锝(Tb) 镧系元素荧光特点： 1、荧光寿命极长 镧系元素螯合物（60900 us) 普通荧光免疫中荧光团：1100us 样本中蛋白质荧光：110us，易猝灭,利用镧系元素荧光物理特性，荧光激发后在固定时间段检测特异性荧光而在此时间之前，非特异性荧光已完全衰减为0,TRF分析原理图（2）,标记物为稀土金属-镧系元素,2、Stokes位移大（大约290nm） 铕：激发光340nm、发射光613nm 荧光素的Stokes位移为280nm 3、荧光特异性强（发射光谱带很窄
6、：615 5nm） 4、解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍,巨大Stokes位移,发射光谱与激发光谱间存在的巨大Stokes位移。可以通过干涉滤光片将发射光谱与激发光谱完全分离,TRFIA为临床检测带来的先进性,灵敏度更高，检测范围更广,以下数据均出自于各制造厂家自己的产品说明书 试剂 DELFIA（WALLC） Immulite（DPC化学发光） ACS-180(拜尔） AFP 0.1-1000IU/ml 0.2-300IU/ml 1.0-1000IU/ml CEA 0.1-500ng/ml 0.2-500ng/ml 0.5-100ng/ml HCG 0.5-10000U/L 5-50
7、00U/L 2-1000U/L TSH 0.005-100U/ml 0.002-75U/ml 0.03-150U/ml FSH 0.05-256mU/ml 0.1-170mU/ml 0.3-200mU/ml Prog 0.08-120nmol/L 无 0.1-40ng/ml Prolactin 0.04-250ng/ml 0.5-150ng/ml 0.3-200ng/ml,时间分辨荧光免疫检测的标准曲线相当稳定， 同一批次的试剂盒可用两点法加批次的参考曲线定标,0.5 1 2 5 10 20 50 100 200 500 U/L,5,100,2000,Cps.10 3,DELFIA hFSH,
8、N=6,标准曲线稳定，试剂保质期时间长,时间分辨荧光与化学发光方法学比较,时间分辨荧光 化学发光 发光效率 95% 1% 重复检测 可无数次 不可重复 本底噪声 零本底 干扰大 灵敏级数 10-18 10-15 标记物 原子 大分子化合物 标记位点 可达20个/抗体 1个/抗体 标准曲线 稳定达一年以上 稳定 2 到 4周 多标记 有，最多可达四标记 无 科研开发 有 无,时间分辨荧光和电化学发光的比较,时间分辨荧光 电化学发光 标记物 四种原子: Eu, Sm, Tb, Dy 一种原子: 钌 多标记技术 有 无 做科研 能(1000多种科研项目) 无 试剂种类 58种临床,24种科研, 28
9、种临床, 无科研试剂 共82种 试剂价格 低 高,时间分辨荧光免疫-突出优点,零本底、灵敏度高 线性范围宽 试剂有效期长 标准曲线稳定性好 易于自动化 对环境及人体没有任何影响 TRFIA作为一项具有广阔发展潜力的新兴生物学技术，将会给标记免疫学带来一场革命。,三、时间分辨荧光免疫技术 的临床应用,(临床检测试剂盒简介),内分泌科检查 1 、甲状腺功能系列 T3 三碘甲状原氨酸 T4 甲状腺素 FT3 游离三碘甲状原氨酸 FT4 游离甲状腺素 TSH-U 促甲状腺素(超敏感) TBG Ab 甲状腺结合球蛋白 TPO Ab 甲状腺过氧化物酶,时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍,临床意义概述： 甲状
10、腺是人体一个重要的内分泌腺，也是最大的内分泌腺体，甲状腺疾病也是目前最常见最多发一种内分泌疾病，对人体的正常功能可产生明显影响，甚至危及生命。 以上各项目的联合检测，为临床医生对病患者甲状腺功能的评价提供更基础、全面的依据。,时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍,2 、糖尿病系列 InS 胰岛素 CP C肽 临床意义概述： 了解残留胰岛细胞的功能，特别是用于区分胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)和非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM); 用于胰岛素瘤的诊断等。,时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍,时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍,3 、生长激素 hGH 生长激素 临床意义概述： 对诊断肢端肥大症是一项特异的
11、方法； hGH低下还见于侏儒症和垂体前叶功能减退症如席汉综合征等。,妇产科检查（性激素） hCG 绒毛膜促性腺激素 LH-Spec 黄体生成素(特异性) FSH 促卵泡激素 PRL 催乳素 E2 雌二醇 Testo 睾酮 Prog 孕酮 SHBG 性激素结合球蛋白,时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍,时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍,临床意义概述 性激素是由性器官或肾上腺皮质分泌的，维持和调节机体内正常生命，生理活动和生殖功能的一类甾体激素。 检测这些激素的含量对于生殖生理的研究、疾病的诊断、治疗、随访及计划生育工作的开展具有重要的意义。,肿瘤科检查 AFP 甲胎蛋白 PSA 前列腺特异抗原 B
12、2-M Beta 2微球蛋白 NSE 神经元烯醇化酶 PAP 前列腺酸性磷酸酶 CEA 癌胚抗原 PSA Free / total 前列腺特异抗原/总量,时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍,临床意义概述： 肿瘤标志物（Tumor Markers,TM)是指示体内肿瘤存在并反映其一定的生物特性的生化物质。通过测定其存在或含量，对于肿瘤可辅助诊断，分析病情，指导治疗，监测复发或转移及判断预后等。对现有TM项目进行综合分析、多元分析，筛选出有价值的TM，确定一个最佳组合方式具有极大的临床意义。,时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍,遗传科检查 1 、产前筛查 PAPP-A 妊娠相关血浆蛋 Free hCG
13、Beta 游离绒毛膜促性腺激素 亚单位 AFP 甲胎蛋白 E3 游离雌三醇 h AFP/Free hCG 甲胎蛋白/游离绒毛膜促性腺激素 亚单位 临床意义概述： 是预防患有严重遗传性疾病和先天畸形胎儿出生的一项有效措施。随着产前诊断技术的不断完善，产前诊断不仅为患儿的出生提供了客观依据，也使医师能在分娩过程中和分娩后给予合适的处理。,时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍,时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍,2 、新生儿筛查 Neoneotal hTSH 新生儿筛查促甲状腺素 Neoneotal T4 新生儿筛查甲状腺素 Neoneotal 17 -OH-Prog 17-羟基酮 Neoneotal P
14、KU 新生儿筛查苯丙氨酸 临床意义概述： 通过先进的实验室检测及早发现某些危害严重的先天性遗传代谢性疾病，从而早期诊断、早期治疗，避免宝宝因脑、肝、肾等损害导致智力、体力发育障碍甚至死亡。,血液科检查 1 、贫血检查 Ferritin 铁蛋白 Vit B12 维生素B12 folate 叶酸 2 、白血病分型、免疫细胞分型、细胞毒试验等 其它科研,时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍,时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍,传染科检查 乙肝系列 HBsAg 表面抗原 HBsAb 表面抗体 HBeAg e抗原 HBeAb e抗体 HBcAb 核心抗体 开发中：抗HBcIgM 临床意义概述： 为乙型肝炎临床
15、早期诊断和治疗提供病原学依据。 能动态观察疗效和监测病情，对乙肝疫苗免疫力的评价和高危人群预防免疫具有重要意义。,泰莱-I型时间分辨系统,泰莱-型时间分辨系统,使用TRFIA的理由,一、专为中国医院量身定制 仪器、试剂的国产化，更适应我国国情，为各级医院开展高灵敏度的特种检验提供可行、低成本的方案。 二、先进的方法学 TRF因其更灵敏、方法更特异，技术更简单、操作更方便、成本更低所以更具生命力。,使用TRFIA的理由,三、可测项目多 开放性试剂系统；试剂多达72种，其中临床48种，科研24种，能做1000多项科研项目，比美大型免疫分析仪。有助于推进我国基础医学与临床医学的发展，并为提高人民的健康水平和改善人民的生活质量做出贡献。 四、对操作人员没有伤害,使用TRFIA的理由,五、试剂有效期长、标准曲线稳定 低分子量原子标记，标记位点可达20个/抗体对标记物的结构与活性影响小，无衰变，决定了试剂的高稳定性。减少了因定标和试剂保存期短而造成的试剂浪费。 六、结果可靠 方法学的优异性、高灵敏度、可重复测试，更宽的检测线性范围，受环境因素影响更少。,专家评价,主要技术性能已达到国外同类型半自动测试仪的先进水平。具有国内领先水平，特别是其操作系统实现了全中文Windows界面下的操作与数据处理，更为适应国内医院使用，为国内首创。,谢谢！,