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1、长沙能润医学检验所 邓鹏,HLA 基因检测,Table of Contents,Table of Contents,什么是HLA MHC、HLA、亚型、关联 什么是HLA分型 I型，II型，III型，IV型 HLA分型与疾病检测 骨髓与器官移植，免疫性疾病，代谢性疾病，神经内科疾病，骨科疾病等,基本概念,人类白细胞抗原 human leukocyte antigen , HLA,MHC,Major histocompatibility complex，,主要组织相容性复合体,（包括HLA、H-2、ChLA、RhLA、DLA、 SLA、RLA、GpLA、B等）,1940年代，Snell和Gore
2、r 小鼠间的肿瘤及皮肤移植试验发现： 决定小鼠间移植排斥与否（即组织相容性）的基因位于17号染色体短臂 命名为组织相容性-2（H-2）,H-2是一个由许多紧密连锁的基因位点构成的复杂系统,1950年代Dausset 经产妇血清进行个体之间抗体与白细胞 凝集和细胞毒试验 发现人的MHC，命名为HLA 基因位于第6号染色体短臂,1960年代，Benacerraf 不同品系的豚鼠对一些抗原的免疫应答能力比较发现： 控制机体对不同抗原的免疫应答能力的基因（Ir基因）位于MHC基因复合体内。,Benacerraf、Dausset和Snell三位科学家 分别从不同角度对MHC的免疫遗传学进行的开拓性研究，
3、 荣膺1980年的诺贝尔医学和生理奖。,HLA共分为4型：I型分子包括HLA-A、HLA-B和HLA-C，广泛存在与各种组织细胞中； II型分子包括HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR，存在于B细胞、巨噬细胞和活化T细胞中； III型分子为补体系统，包括C2和C4位点，存在于血清中； IV型分子可能是一些分化抗原，只存在于淋巴细胞、某些细胞毒性T细胞和白细胞中。,HLA分型,HLA基因系统的多态性及一些主要基因座位的等位基因数 正式命名显示多态性的HLA基因座位有31个，共2 320个等位基因。 图中所示为常见基因座位的等位基因数。 及一些主要基因座位的等位基因数 正式命名显示多态性的HL
4、A基因座位有31个，共2 320个等位基因。 图中所示为常见基因座位的等位基因数。,HLA分型的基本检测方法： 细胞学方法测抗原特异性（型） 血清学方法测抗原特异性（型） （微量淋巴细胞毒试验） 分子生物学方法测等位基因 PCR/SSP PCR/Luminex PCR/SBT PCR/二代测序 PCR/流式细胞仪,HLA抗原和等位基因命名:,用血清学及细胞学方法检测抗原特异性: HLA-B27, HLA-DR4（血清学方法） HLA-DPw2（细胞学方法） 用分子生物学方法检测等位基因： HLA-DRB1*04 05,HLA-B*27 07,例如HLA-B27,HLA-B*2701 HLA-B
5、*2702 HLA-B*2703 HLA-B*2704 HLA-B*27051 HLA-B*27052 HLA-B*2706 HLA-B*2707,HLA-B*2708 HLA-B*2709 HLA-B*2710 HLA-B*2711 . . . HLA-B*2723,Loci Considered to be Matched,A,C,B,DR,DQ,DP,4 M bp,Fathers,Mothers,HLA: 无血源相关 10/10 同胞兄妹 单倍型全相合，半相合 父母亲 半相合,17,脐血干细胞移植,外周血干细胞移植,骨髓干细胞移植,常见HLA与疾病关联 疾病 HLA抗原 相对风险 强直性
6、脊椎炎 B27 89.8 Behcet综合征 B51 10-15 多发性硬化症 DR2 4.8 乳糜泻 DR3 10.8 Graves病 DR3 3.7 系统性红斑狼疮 DR3 5.8 类风关 DR4 4.2 胰岛素依赖型糖尿病 DR3/DR4 25.0 重症肌无力 DR3 2.5,小结,HLA的三个特性使其成为热点： 决定组织相容性 高度多态性 与疾病关联,Table of Contents,HLA 基因分型,低分辨: SSP,rSSO Luminex bead for class I & class II,中等分辨HLA分型,24,Next generation sequencing,高分
7、辨高通量HLA分型,Illumina Sequencing by Synthesis (SBS) chemistry,MiSeq,Pacific Biosciences - Single-molecule real-time sequencing,27,Sequencing based typing (SBT),高等分辨HLA分型,Sanger 测序原理,Sanger 测序原理,A,T,A,G,C,T,A,G,T,G,A,A,C,G,T,C,A,G,T,3,5,T,A,T,C,G,A,5,3,A,C,G,T,A,C,G,dNTP,ddNTP- Dyes,A,T,A,G,C,T,A,G,T,G,
8、A,A,C,G,T,C,A,G,T,3,5,T,A,T,C,G,C,A,5,3,T,A,T,A,G,C,T,A,G,T,G,A,A,C,G,T,C,A,G,T,3,5,T,A,T,C,G,C,A,5,3,T,T,G,A,T,A,G,C,T,A,G,T,G,A,A,C,G,T,C,A,G,T,3,5,T,A,T,C,G,C,A,5,3,T,G,C,T,G,A,A,C,A,C,G,T,A,C,G,T,Sanger 测序原理,A,T,A,G,C,T,A,G,T,G,A,A,C,G,T,C,A,G,T,3,5,T,A,T,C,G,A,5,3,A,T,A,G,C,T,A,G,T,G,A,A,C,G,T,
9、C,A,G,T,3,5,T,A,T,C,G,C,A,5,3,T,A,T,A,G,C,T,A,G,T,G,A,A,C,G,T,C,A,G,T,3,5,T,A,T,C,G,C,A,5,3,T,G,A,T,A,G,C,T,A,G,T,G,A,A,C,G,T,C,A,G,T,3,5,T,A,T,C,G,C,A,5,3,T,G,C,T,G,A,A,C,HLA分型模板的扩增,Long PCR (each: HLA-A, -B, -C, -DR, -DQ, DP, MICA) 2. Amplicons (PCR: exon + loci),Long PCR to amplify the target gen
10、e,www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1206614109,Assembly and Alignment,Problems in sequence assembly,Amplicons - HLA Coverage,HLA-A,HLA-B,HLA-C,HLA-DQB1,HLA-DPB1,HLA-DQA1,HLA-DRB1,HLA-DRB3,HLA-DRB4,HLA-DRB5,HLA-DPA1,4.1kb,2.6kb,4.2kb,10.3kb,9.7kb,7.3kb,7.1kb,4.1kb,Table of Contents,AS的病因,基因有关：HLA-B27
11、的转基因大鼠成功地培育出强直性脊柱炎的动物模型。目前已发现包括B27在内的3种基因与此病相关；并且有明显家族发病倾向。 免疫有关：MHC，T-Cells 感染有关：相关学说认为，来自尿道、前列腺、精囊的抗原经Batson循环到达骶髂关节、脊柱和眼睛等部位而发生相关病变，解释了男性好发的原因。,AS的经典检查,体征： 骶髂关节炎检查：“4”字试验、骶髂关节压迫试验、髂棘推压试验、骨盆挤压试验 附着点炎检查：坐骨结节、肋软骨、肋胸关节、耻骨联合等压痛 脊柱和胸廓检查：Schober试验、指地距、枕墙距、胸廓活动度等,骶髂关节,AS的经典检查,B27测序的AS检查,HLA-B27与AS,患病率：0.
12、3%，20-30岁，男女比例 10:1，有家族倾向； 主要侵犯：中轴关节（骶髂关节、脊柱骨突、脊柱旁软组织） 可伴发外周关节及关节外表现，严重者发生脊柱畸形和关节强直 B27检测可作为有相关症状或高危人群AS早期的筛选方法！ AS不是RA的一种特殊类型！,HLA基因座位的等位基因和真正的疾病易感基因处于紧密连锁不平衡，而HLA基因本身并不是引起疾病的真正基因，仅仅是遗传标志。,连锁不平衡学说 分子模拟学说 关节源性肽假说 其他： T细胞受体库假说 超抗原假说 B27修饰因子假说 Cys67模型,B27抗原与某些G（-）菌之间存在类似的分子结构，能发生分子模拟或交叉反应，机体免疫系统把B27当作
13、病原体抗原产生免疫应答，对机体产生免疫损害。,认为关节源性肽只存在于关节组织中，特异性地由HLAB27提呈，正常情况下递呈水平低，反应T细胞处于耐受状态；当某些具有同源结构蛋白的病毒或细菌感染时，则可致敏耐受的T细胞，从而识别以低水平递呈的关节源性肽，引起自身免疫反应而损伤组织。,长沙能润医学公司的优势,长沙能润医学成立于2010年，专注于：基因资源与基因检测、肿瘤基因研究与转化、免疫细胞治疗和存储。为医疗机构、制药与健康体检公司提供特色精准医学解决方案。 集团旗下拥有以下业务版块：基因检测、细胞治疗、生物培训、生物双创项目投资、精准医疗科研。集团还参股投资了免疫诊断试剂国家工程实验室、国家基
14、因检测技术示范中心、智慧医院工程建设公司燕通生物、海南乐城合家精准医疗医院等机构。与中科院、中南大学湘雅医学院、湖南师大医学院及斯坦福、犹他、华盛顿、UAB、耶鲁等大学教授合作共建实验室。 在未来，集团将以“基因科技服务健康”为宗旨，以双创平台为基础，以基因细胞技术系统为主导，系统模块化，模块产品化为策略，整合产、学、研、金、用资源，努力成为杰出的精准医学服务提供商。,公司基因检测实力雄厚，与中南大学湘雅医学院百人计划邹义洲教授长期合作，有3台ABI3730测序仪，1台Luminex, 公司员工80%具有硕士及硕士以上学历，具有丰富的基因检测服务经验，已经完成上万个案例。,THANKS FOR YOUR ATTENTION,