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1、,实验一 新城疫血凝与血凝抑制试验,目的意义： 掌握血凝试验（HA）与血凝抑制试验（HAI） 的基本方法； 体会HA与HAI在新城疫病毒及其它病毒诊断和鉴定中的应用。 基本原理： 许多病毒表面具血凝素，具有凝集某些动物或人红细胞的特性，称为血凝现象，可用于鉴定病毒。血凝现象可以被特异性抗体所抑制，称为血凝抑制现象，利用这种特性可进行血清学试验，称为血凝抑制试验。,器材及试剂: 待检病毒:鸡新城疫病毒鸡胚尿囊液； 待检血清：抗鸡新城疫病病毒阳性血清； 生理盐水、1%鸡红细胞、96孔V形微量血凝板、加样器等。,（一）血凝试验（HA）：取96孔板，按以下步 骤操作： 1、第一排1-12孔各加生理盐水
2、50ul，第二排1-12 孔加生理盐水50ul为红细胞对照； 2、吸50ul病毒液于第一排第1孔，混匀后取50ul 至第2孔，依次稀释至第12孔，弃去50ul，各 孔经倍比稀释后稀释度依次为2-12-12 。,实验步骤,3、第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%鸡红细 胞50ul，微型震荡器震荡2min混匀。 4、室温静置10-30分，观察结果。 5、结果判定：红细胞对照组红细胞完全沉降，以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集的病毒最高稀释倍数，作为病毒的血凝价，即HI效价，用2n表示。,血凝试验流程图,（二）血凝抑制试验（HAI）：取一96孔板，按以下步骤操作： 1、4个单位抗原的制备：按
3、HA试验测出的病毒血凝价除以4即为4个单位血凝素的稀释度。 2、待检血清的稀释：第一、二、三排1-12孔各加生理盐水50ul，于第一排第1孔中加入50ul待检血清，反复吹吸3-5次混匀后，取50ul至第2孔混匀，吸取50ul至第3孔，依次稀释至第12孔，弃去50ul，经倍比稀释，血清的稀释倍数为21212 。,3、第一、二排1-12孔各加4个单位血凝素50ul，微量震荡器震荡2min混匀； 4、室温静置20min； 5、第一、二、三排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微量震荡器震荡2min混匀混匀。 6、室温静置10-30分，观察结果；,7、结果判定：第二排为抗原对照，红细胞应全部凝集，第三
4、排为红细胞对照，红细胞应全部沉降。以待检血清能完全抑制病毒凝集红细胞的最高稀释倍数为血清的HAI效价，用2n表示。,血凝抑制试验流程,实验二 病毒的鸡胚培养,目的意义： 了解禽源病毒鸡胚培养的意义及用途 掌握病毒鸡胚培养的基本方法 基本原理： 鸡胚培养是培养某些病毒常用方法,此方法可用于某些病毒的分离、增殖、毒力滴定、中和试验及生产疫苗等。病毒接种鸡胚的途径有多种，主要有卵黄囊接种、绒毛尿囊腔接种、绒毛尿囊膜接种、羊膜腔接种途径等，应根据需要选择适当的途径。,卵黄囊,胚体,羊膜囊,绒毛尿囊腔,气室,鸡胚结构模式图,器材及试剂: 病毒：鸡新城疫病毒弱毒疫苗； 鸡胚：9-11日龄白壳受精卵； 孵卵
5、箱、检卵灯、钢针、注射器、2.5%碘酒、 75%乙醇、固体石蜡、眼科剪、眼科镊等。,实验步骤: 1 .准备鸡胚：接种前用检卵灯观察是否为受精卵 及其活力。 2 接种（绒毛尿囊腔途经）： （1）在检卵灯下，用铅笔勾出气室及胚胎的 位置，并在尿囊膜血管较少的地方作记号。 （2）消毒：用碘酒消毒气室蛋壳，酒精脱碘， 用灭菌钢针在记号处打一孔。,（3）接种病毒：用18mm针头的1ml注射器吸 取鸡新城疫病毒，针头通过打出的孔进针，刺入尿囊腔，注入0.1ml。 （4）用融化的石蜡封闭小孔，39孵化器中 孵化72h。,3 收获： 接种后每4小时照蛋一次，弃去24h内死亡胚。 （1）鸡胚放入普通冰箱内冷藏1
6、2h，使胎血凝固。 （2）分别用碘酒和酒精消毒卵壳，用灭菌剪刀除去气室卵壳及壳膜，撕开下面的尿囊膜。 （3）将鸡胚稍倾向一侧，用灭菌吸管吸出尿囊液待检。 （4）观察鸡胚的发育及是否有无病变。,实验三 鸡白痢平板凝集试验,目的意义： 了解平板凝集试验在鸡白痢诊断及监测中的应用 学习鸡白痢平板凝集试验的操作方法。 基本原理： 细菌等颗粒性抗原与特异性抗体结合后，在有电解质的情况下，会出现肉眼可见的凝集块，称为凝集反应。直接凝集反应可分为玻片凝集与试管凝集。凝集试验是疾病诊断及体内抗体水平测定的常用方法。,器材及试剂: 抗原和血清：鸡白痢凝集抗原、鸡白痢标准阳性血清、阴 血清、待检血清 生理盐水、玻
7、片、加液枪（20-200ul）、接种环等。 实验步骤: 1.取一洁净玻片，用蜡笔划成方可格，编号 2.各方格分别加被检血清0.08、0.04、0.02、0.01ml。 3.将凝集抗原摇匀，重直滴一滴于各格血清上。 4.用火柴棒混匀，摊开直径1cm左右。,5. 静置3-4分，再拿起玻板轻轻转动，按下列标准记反应结果： +：出现大片凝集，液体完全透明，即100%凝集 +：有明显凝集片和颗粒，液体几乎完全透明，即75%凝集 +：有可见的凝集片和颗粒，液体不甚透明，即50%凝集 +：仅仅可以看见颗粒，液体混浊，即25%凝集 -：液体均匀混浊，无凝集现象 （同时应设阳性、阴性血清及抗原对照） 6. 结果
8、判定：,实验四 鸡传染性法氏囊病琼脂扩散试验,目的意义： 掌握琼脂免疫扩散试验的操作技术 体会其在鸡传染性法氏囊病诊断及监测中的意义 基本原理： 鸡传染性法氏囊病病毒抗原与相应抗体在适当电解质存在下结合，在半固体琼脂中扩散, 经过一定时间形成肉眼可见的沉淀物，据此判断是否存在相应的抗原或抗体，作为诊断鸡传染性法氏囊病的依据之一。,器材及试剂: 生理盐水、琼脂糖、硫柳汞、平皿、打孔器、移液器、吸头 等。 实验步骤: 1、制板:加融化的1%琼脂于洁净玻片或培养皿内，厚2.5-3.0mm。 2、打孔：待琼脂凝固后打孔，多为梅花形，一般孔径3-4mm，孔距4-5mm。 3、加样：于中央孔加入标准沉淀抗
9、原，周围1、4孔内加阳性血清对照，2、3、5、6孔为待检血清。,4、加样完后，将琼脂板置于湿盒中，37 扩散24-48h。 5、结果判定：若待检血清与抗原孔之间出现白色沉淀线，则表示阳性，若不出现沉淀线，为阴性。 若用于检测血清效价，则以出现沉淀线的血清最高稀释倍数表示（2n）。 用于两种抗原比较时，沉淀线有多种情形，应具体分析。,制板,打孔,封底,加样,置湿盒中,扩散,琼脂扩散试验流程图,实验五 禽霍乱的诊断,目的意义： 认识禽霍乱病原巴氏杆菌两极染色的特性 熟悉禽霍乱的诊断方法和步骤 认识病原菌分离鉴定在禽病诊断中的作用 基本原理： 禽巴氏杆菌病又称为禽霍乱，主要表现为败血症，即实质器官的
10、出血、肿大与坏死。巴氏杆菌在病禽组织内呈典型的两极着色，纯培养物呈卵圆形或短杆状；在血或血清琼脂上生长良好，呈露珠样小菌落并有不同颜色的荧光；能发酵多种糖；多杀性巴氏杆菌能致死小白鼠、家兔等。故常依据形态特征、培养特性、生化特性和动物实验等来鉴定。,器材及试剂: 病料：患病鸭组织（肝、脾、肺）或体液 （血、胸腹腔渗出液）； 培养基：5-10%兔血琼脂平板； 动物：小白鼠或成年健康家兔； 无菌生理盐水、吸管、注射器、针头、酒精 灯等。,实验步骤: （一）形态学检查：病料或心血涂片，瑞氏染色。 （二）培养特性检查：将病料接种于血琼脂平板 37培养24h。 （三）生化鉴定：,鸭 霍 乱 心 血 涂 片中的多杀性巴氏杆菌,（四）动物回归实验：将病料剪碎并研磨，用灭菌生理盐水制成1:10悬液，也可将血琼脂平板培养物制成悬液，皮下注射小白鼠，0.1-0.3ml/只。注意观察小鼠的表现，待发病死亡后，即行解剖，观察小鼠病变，用肝、脾触片或心血涂片，瑞氏染色镜检，应有两极浓染的球杆菌。同时上述病料接种血琼脂平板，次日观察细菌生长情况和菌落特征。,临床症状,病理变化,触片染色镜检,培养特性,生化特性,血清学试验,初步诊断,动物回归试验,确诊,流行病学调查,