蛋白质的结构与功能授课用.ppt

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1、蛋白质结构与功能,核酸具有传递遗传信息的功能 蛋白质几乎涉及所有的生理过程生命现象的执行者,蛋白质与核酸是体内主要的生物大分子,什么是蛋白质(protein)? 蛋白质是由许多氨基酸（amino acids）通过肽键（peptide bond）相连形成的高分子化合物。,蛋白质研究的历史 1833年，从麦芽中分离淀粉酶，随后从胃液中分离到类似胃蛋白酶的物质。 1864年，血红蛋白被分离并结晶。 19世纪末，证实蛋白质有氨基酸组成，并合成了多种短肽。 20世纪初，发现蛋白质的二级结构，完成胰岛素一级结构测定。 20世纪中叶，各种蛋白质分析技术相继建立，促进了蛋白质研究迅速发展。 1962年，确定了

2、血红蛋白的四级结构。 20世纪90年代，功能基因组与蛋白质组研究展开。,第一节 蛋白质是生命的物质基础,很多蛋白质本身就为药物（如一些多肽、激素等）； 即使有效成分不是蛋白质，但在提取、分离时必然遇到有关蛋白质的处理问题； 蛋白质的研究对有关药物的生产、储存、分析和应用等也具有重要的现实意义。,药学领域,第二节 蛋白质的化学组成,蛋白质平均含N量为总蛋白的16，这是凯氏定氮法测蛋白质含量的理论依据： 蛋白质含量蛋白质含N量6.25 注意：一定要排除非蛋白质的 氮对蛋白质含量测定的影响,主要元素组成：C、H、O、N、S ； 有些还含有少量的P 或金属元素Fe、Cu、Zn、Mn等；个别蛋白质还含有

3、碘。,蛋白质的元素组成,组成蛋白质的基本结构单位是什么呢？,蛋白质的水解,酸水解、碱水解、蛋白酶水解,蛋白质的基本结构单位氨基酸,R=H -Glycine,R=CH3-Alanine,（一）氨基酸的结构,存在自然界的氨基酸有180余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20余种（基本氨基酸），且均属于L-氨基酸（除甘氨酸）。,从氨基酸的结构通式可以看出：,构成蛋白质的基本氨基酸为-氨基 酸，脯氨酸例外，为-亚氨基酸。 各种氨基酸的区别在于R侧链，R不同蛋白 质的空间结构和理化性质也会发生变化。 除R为H（甘氨酸）外，其余氨 基酸的-碳原子都是不对称的， 可形成不同的构型，具有旋光性。 天然蛋白质中基

4、本氨基酸均为L-型。,组成蛋白质的氨基酸共有20 种,（二）氨基酸的分类,极性不带电荷的氨基酸 带负电荷的氨基酸 带正电荷的氨基酸,不同的 aa 在于 R基团 的不同,1.根据R基团的理化性质,I 非极性氨基酸（八种）,I 非极性氨基酸（八种）,吲哚基,II 极性不带电荷的氨基酸（七种）,巯基,II 极性不带电荷的氨基酸（七种）,III 带负电荷的氨基酸（两种）,IV 带正电荷的氨基酸（三种）,COOH,C,H,NH2,组氨酸 His,CH2,N,HN,胍基,咪唑基,非极性氨基酸：缬、甲、脯、丙、亮、异亮、苯、色 写 家 谱 并 晾 一晾 本 色,记忆方法,极性氨基酸：酪、丝、苏、半、甘、天酰

5、、谷酰 老 师 说 半 干 天谷 咸,带负电：天冬氨酸、谷氨酸 带正电：赖氨酸、精氨酸、组氨酸,通常是常见氨基酸的衍生物。例如：,2. 稀有氨基酸,羟基化的氨基酸4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸 存在于结缔组织胶原蛋白中,甲基化的氨基酸甲基组氨酸、甲基赖氨酸 存在于肌球蛋白中,-羟基谷氨酸存在于凝血酶原中，参与凝血,1986年-硒代半胱氨酸，硒元素取代了半胱氨酸中的硫元素； 2002年-吡咯赖氨酸，赖氨酸的-氨基与（4R，5R）-4-取代-吡咯啉-5-羧酸以酰胺键相连而形成的化合物。 是生物体内组成蛋白质的第21和第22种基本氨基酸，均属于L-氨基酸。,以游离或结合态存在细胞或组织中，大部分是常见氨

6、基酸的衍生物或异构型。例如：,3. 非蛋白质氨基酸,鸟氨酸、瓜氨酸是尿素循环的中间代谢产物；,D-谷氨酸、D-丙氨酸 存在于细菌细胞壁肽聚糖中；,-氨基丁酸由谷氨酸脱羧产生，为重要的神经递质。,1.物理性质,形态：均为白色结晶或粉末，不同氨基酸的晶型结构不同。 溶解性：一般都溶于水，不溶或微溶于醇，不溶于丙酮，在稀酸和稀碱中溶解性好。 熔点：氨基酸的熔点一般都比较高，一般都大于200，超过熔点以上氨基酸分解产生胺和二氧化碳。 旋光性：除甘氨酸外都有旋光性，左旋用（-）表示，右旋用（+）表示。氨基酸的旋光性和大小取决于R基的性质，并且与D/L型没有直接的对应关系。,氨基酸的性质,2.化学性质 氨

7、基酸的两性解离与等电点,氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。,等电点（isoeletric point，PI）：当溶液浓度为某一pH值时，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，成为兼性离子，净电荷为0，呈电中性，此时溶液的pH值即为氨基酸的等电点。,在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，pH变化时，迁移发生变化。,pI 是氨基酸的特征常数,pHpI 阳离子,pH=pI 两性离子,pHpI 阴离子,紫外吸收性质,酪氨酸、色氨酸R基团有共轭双键，具有紫外吸收特性，其最大吸收波长在280nm附近。 大多数蛋白质含有这两种氨基酸，因此测定蛋白溶液280nm处吸光

8、值是检测蛋白浓度的快速简便有效的方法,在加热条件及弱酸环境下，氨基酸与茚三酮反应生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm处。 由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可以作为氨基酸的定量分析方法。,茚三酮反应（灵敏度为1ug）,寡肽、多肽的组成单位 多种生物活性物质的前体：NO前体精氨酸；褪黑色素前体-色氨酸。 作为神经递质（谷氨酸、-氨基丁酸） 氧化分解产生ATP 作为糖异生的前体,氨基酸的生理功能,蛋白质分子中氨基酸是如何连接的呢？,两个氨基酸分子头尾连接起来,肽键的形成,一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。,肽键与肽链,由两个氨

9、基酸组成的肽称为二肽，三个氨基酸组成的肽称为三肽，依此类推。 由十个以下氨基酸组成的肽称为寡肽（oligope- ptide）;十个以上氨基酸组成的肽称为多肽或多肽链（polypeptide）。 肽链中的氨基酸因为脱水缩合而非原来的完整分子单元，故将其称为氨基酸残基（residue）。,肽链中AA的排列顺序和命名,在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序。 多肽链有两端： N-端：多肽链中有游离-氨基的一端，也称氨基端； C-端：多肽链中有游离-羧基的一端，也称羧基端。 氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：

10、Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu,第三节 蛋白质的分子结构,蛋白质是具有三维空间结构的高分子物质，根据蛋白质肽链的折叠方式和复杂程度，将蛋白质结构分为.,1,2,3,4,蛋白质的结构层次,Mathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.195,一级结构（primary structure ） - 氨基酸序列 二级结构（secondary structure ） - 主要由氢键稳固的局部构象，如-helix, -sheet等 三级结构（tertiary structure ） - 一条多肽链中所有原子或基团在三维空间的整体排布 四级结构（quarterna

11、ry structure ） - 多个多肽链的组合,空间结构,蛋白质结构的层次,蛋白质的一级结构,蛋白质的一级结构指蛋白质分子中多肽链的氨基酸排列顺序（注意方向），包括二硫键的位置。,主要的化学键：肽键，二硫键,一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学的基础，但不是决定蛋白质空间构象的唯一因素。,蛋白质的一级结构的测定,蛋白质的一级结构指蛋白质多肽链中AA的排列顺序以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置。 其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物学功能的基础。,如何测定蛋白质一级结构：氨基酸序列,(1)直接进行氨基酸测序： Edman degradation F. Sanger (Cambr

12、idge U.) Insulin- 胰岛素 (A, B chains),(2) 由 cDNA 序列反推氨基酸序列： DNA 定序法： F. Sanger,Juang RH (2004) BCbasics,1. 小片段肽链测序：,二硝基氟苯（FDNB）法,二甲氨基磺酰氯（DNS-Cl）法,Edman降解法（苯异硫氰酸酯法）,氨肽酶法,肼解法,羧肽酶法,N末端氨基酸的分析,C末端氨基酸的分析,N末端基氨基酸测定,主要涉及三步反应：偶联反应、环化断裂反应、转化反应。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。,Edman降解法（苯异硫氰酸酯法，PITC法）,脱去N末端氨基

13、酸后，剩下的肽链仍然是完整的。,苯异硫氰酸酯（PITC),碱性条件，偶联,酸性条件，断裂环化,PTC-肽,多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。,C末端基氨基酸测定,肼解法,羧肽酶是一种肽链外切酶，它能特异地从多肽链的C-端将氨基酸依次水解下来，是C末端分析常用的方法。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；,C 末端基氨基酸测定,羧肽酶法,测序步骤,A.多肽链的拆分 由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基),B.二

14、硫键的断裂 可在尿素或盐酸胍存在时，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。,蛋白质一级结构的测定,C.测定蛋白质分子中多肽链的数目 蛋白质末端分析 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,蛋白质一级结构的测定,D.多肽链断裂成多个肽段 以便建立两个重要的氨基酸序列参考点 可采用两种或多种不同的断裂方法（断裂点不同）将多肽样品断裂成两套或多套肽段，并将其分离开来。 酶解法: 胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、羧肽酶和氨肽酶 化学法：(Cyanogen bromide) 溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。,蛋白质一级结

15、构的测定,蛋白质一级结构的测定,E.分析多肽链的N-末端和C-末端残基 以便建立两个重要的氨基酸序列参考点 N末端 二硝基氟苯（DNFB）法 丹磺酰氯（DNS）法 Edman降解法 氨肽酶法 C末端 肼解法 还原法 羧肽酶,蛋白质一级结构的测定,F.片段重叠法确定肽段在多肽链中顺序示意,两套或两套以上不同方法断裂的肽段样品，切口彼此错位，两套肽段正好相互跨过切口而重合，达到互补的目的。,借助重叠肽确定肽段次序：,末端残基 H S 末端肽段 HOWT APS （OUS） 第一套肽段 HOWT OUS EOVE RLA PS 第二套肽段 HO WTOU SEO VERL APS 推断全顺序 HOW

16、TOUSEO VERLAPS,氨基末端残基 H 羧基末端残基 S 第一套肽段 第二套肽段 OUS SEO PS WTOU EOVE VERL RLA APS HOWT HO,举例：,所得资料,核酸推导法,原理：蛋白质的氨基酸顺序是由核酸的核苷酸顺序决定的。,小结,掌握：片段重叠法确定肽段在多肽链中顺序； 熟记：组成蛋白质的各种氨基酸以及缩写符号； 熟悉：分析多肽链的N-末端和C-末端残基的方法；,蛋白质分子的构象又称空间结构、立体结构、高级结构、三维构象等，是指蛋白质分子中原子和基团在三维空间上的排列、分布及肽链的走向。 蛋白质的分子构象取决于一级结构，是蛋白质生物学功能或活性所必需的。 蛋白

17、质的构象可分为二、三、四级结构。,蛋白质的二级结构,蛋白质的二级结构,定义 是指肽链的主链骨架中若干肽单位，各自沿一定的轴盘旋或折叠形成的有规则的构象，以氢键为主要的次级键。 蛋白质的二级结构中不涉及氨基酸残基侧链的构象。,主链：是由氨基酸的羧基与氨基形成的肽键部分规则的重复排列而成。 侧链：R基部分。,两肽键平面的交接点为-碳,以肽键为平面连接成多肽长链,注意：-碳上面接有各种大小不等的基团,肽单位（peptide unit）：肽键与相邻的两个C组成的基团,其中肽键具有部分双键性质，不能自由旋转。,肽单位是刚性平面，其上面6个原子处于同一平面，称为 肽平面。,肽链主链上只有两个碳原子 连接单

18、键可旋转。,肽单位中与C-N相连的氢和氧原子与两个碳原子呈反向分布。,肽链中的肽平面,蛋白质空间结构单元,-折叠 (- pleated sheet),-转角(- turn),环(loop),无规则卷曲（random coil）,Ribbon model of the bacterial catabolite gene activator protein (CAP),-螺旋 (- helix),肽键平面对多肽链构象的限制,肽平面的相叠形成螺旋,-螺旋(-helix),指蛋白质分子中多个肽平面通过氨基酸-碳原子的旋转，使多肽链的主骨架沿中心轴盘曲成稳定的-螺旋构象。,右手-螺旋，螺距为0.54nm

19、，每圈含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸残基之间的距离为0.15nm; 稳定因素：链内氢键，每隔三个氨基酸残基形成一个氢键，氢键取向与主轴基本平行。 R基团在外侧，其大小、形状及电荷等均影响-螺旋的稳定性和形成。,0.54 nm,-螺旋结构特征,肽链伸展使肽键平面之间折叠成锯齿状； -折叠借相邻主链之间的氢键维系。 肽链中氨基酸残基的R侧链分布在片层的上下。, -折叠的结构特征,-折叠有两种类型。一种为顺式，肽链的N-端在同侧。另一种为反式，即相邻两条肽链的方向相反。一般反式较为稳定。,-转角（-turn）,在-转角部分，由四个连续的氨基酸残基组成； 弯曲处的第一个氨基酸残基的 -C=O 和第四

20、个残基的N-H 之间形成氢键，产生一个不很稳定的环状结构。 这类结构主要存在于球状蛋白分子中。,无规卷曲（random coil）,指多肽链主链部分形成的无规律构象。 一种蛋白质往往具有多种不同类型的二级结构构象，只是不同蛋白质各占多少不同而已。,核糖核酸酶的分子结构,基序,基序（motif）又称为超二级结构、模体或模序：多肽链内顺序上相邻的二级结构常在空间中相互接近，相互作用而形成有规则的二级结构聚集体。 超二级结构在结构的组织层次上高于二级结构，但没有完整的结构域。 常见的有：，,结构域（domain）,三级结构层次上的局部折叠区。 结构域：在较大的蛋白质分子中，多肽链上相邻的基序（超二级

21、结构）紧密联系，进一步折叠成一个或多个相对独立的致密的三维实体。 具有独特的空间构象，与分子整体以共价键相连，并承担特定的生物学功能。 蛋白质分子可以有多个相同或不同的结构域；不同的蛋白质分子可以有相同的结构域。,丙酮酸激酶的结构域,蛋白质的三级结构(Tertiary Structure),具有二级结构、超二级结构及结构域的一条多肽链上，序列上相隔较远的AA残基侧链相互作用，在空间进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维结构。 指在一条多肽链上所有原子和基团在三维空间的整体排布。 大多数蛋白质的三级结构为球状或近似球状。 大多数的亲水的侧链分布于球形结构的表面，而疏水的侧链链分布

22、于球形结构的内部，形成疏水的核心。,溶菌酶分子三级结构,维系三级结构的化学键主要是非共价键：氢键、离子键、疏水键和范德华力。,蛋白质的四级结构(Quaternary Structure)：二个或二个以上的亚基之间相互作用，彼此以非共价键相连而形成更复杂的构象。,蛋白质的四级结构,1.蛋白亚基,具有一、二、三级结构的多肽链，称为亚基或亚单位(subunit)，四级结构的实质是亚基在空间排列的方式。 2-10个亚基组成具有四级结构的蛋白质为寡聚体(oligomer)，多于10个称为多聚体（polymer）。 单独亚基无生物学功能，当亚基聚合成为具有完整四级结构的蛋白质后才有功能。,2.亚基间的结合

23、力,维持亚基之间的化学键主要是疏水键。 亚基间的疏水基团为了避开水相而相互作用形成疏水键，导致亚基聚合。 此外，氢键、离子键、范德华力、二硫键等在维持蛋白质的四级结构也起一定的作用。,血红蛋白(hemoglobin)四级结构,蛋白质的分子结构小结,四级结构,三级结构,结构域,超二级结构,二级结构,蛋白质的一级结构,20种氨基酸,第四节 蛋白质的结构与功能,一级结构是空间结构的基础，并且决定高级结构，而高级结构决定它的生物学功能。,在蛋白质的一级结构中，有少数氨基酸残基参与功能活性部位的构成或处于特定构象的关键部位，这部分残基对于蛋白质正常发挥功能至关重要。,一、蛋白质一级结构与功能的关系,一级

24、结构不同，生物学功能各异： 如催产素和加压素均为9肽，仅第3、第8两个氨基酸残基不同，但功能迥异。 一级结构中关键部分相同，其功能也相同：如不同动物来源的同种激素（胰岛素）。 表明：一些蛋白质或多肽的生物功能并不要求分子的完整性。这就启示我们不必合成完整蛋白质，只需合成关键部分即可。,一级结构中关键部分变化，其生物活性也改变。 所以选择性的基因突变或化学修饰可以得到自然界中不存在而功能更优的多肽，这对新药研究有重要意义。,一级结构的变化与疾病的关系 基因突变会导致蛋白质一级结构发生改变，使蛋白功能降低或丧失，甚至引起疾病。,镰刀形红细胞,正常红细胞,-链N端氨基酸排列顺序 1 2 3 4 5

25、6 7 8 Hb-A（正常人） Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys Hb-S（患 者） Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys,镰刀形红细胞贫血病,由基因突变所导致的一级结构改变而影响高级结构与功能所引起的疾病，称为“分子病”。,二、蛋白质的空间构象与功能,蛋白质特定的空间构象是表现蛋白质功能所必需的。 构象破坏，功能丧失，如蛋白质变性。,1.蛋白质前体的活化 酶原的激活，蛋白质前体的活化（改变一级结构以产生有活性的特定构象） 如：胰岛素原 胰岛素 + C肽 （一条多肽链） （两条多肽链）,猪胰岛素原激活形成胰岛素示意图,2.蛋白质的变构效应

26、（allosteric effect）：一级结构不变，空间构象发生一定变化，导致生物学功能改变。 如血红蛋白的变构效应和输氧功能、变构酶。,当血红蛋白的一个亚基与氧分子结合以后，可引起其他亚基的构象发生改变，对氧的亲和力增加，从而导致整个分子的氧结合力迅速增高，使血红蛋白的氧饱和曲线呈“S”形。,协同效应 一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。 如果是促进作用就是正协同效应（positive cooperativity） 如果是抑制作用就是负协同效应（negative cooperativity）,3.蛋白质构象的改变与疾病（疯牛病-朊病毒）,蛋白质立体结构的改变导致朊病毒发生 正常PrP 螺旋很多，异常PrP -折叠很多。,蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。,蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。,这类疾病包括：人纹状脊髓变性病、老年痴呆症、疯牛病、亨廷顿舞蹈病等。 神经系统的错误折叠导致了大量错误折叠蛋白质在神经系统的聚集，而影响了神经系统的功能。,Thanks,