艾滋病常用实验室检测及临床意义分析PPT课件.ppt

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1、艾滋病常用实验室检测 及临床意义分析,广西疾病预防控制中心 梁富雄 2013.4,主要内容,HIV抗体检测 CD4检测 病毒载量检测 实验室安全防护,感染艾滋病毒后的自然发展过程,艾滋病感染者,艾滋病患者,窗口期,1,2,3,4,急性感染期,KINETICS OF VIRAL MARKERS DURING PRIMARY HIV-1 INFECTION,HIV RNA,HIV p24 antigen,HIV antibodies,HIV感染后血液中核酸、抗原和抗体动态变化,窗口期,暴露,天数,检测域,感染HIV后病毒载量、CD4与病程变化规律,中国HIV实验室网络 国家艾滋病参比实验室 中国C

2、DC性艾中心 艾滋病确认中心实验室 省、市 艾滋病确认实验室 省、市 艾滋病筛查中心实验室 省、市、州、县 艾滋病筛查实验室 省、市、州、县 艾滋病检测点 乡、镇,HIV实验室条件,人员:经过专门技术培训,取得培训合格证/上岗证; 环境:功能分区,符合生物安全二级要求; 仪器设备:按要求配备，满足检测要求。 实验室必须经过资质认证/验收！,HIV病原体诊断,HIV抗体检测 艾滋病病毒抗原检测（P24） HIV核酸检测 病毒分离,检测样品,血清、血浆 尿液 抗凝全血（CBC、CD4、VL) PBMC（外周血淋巴细胞）,样品的采集和处理,一、样品的采集 最常用的样品是血液，包括血清、血浆和全血(抗

3、凝血)。 唾液或尿液有时也可作为测试样品。常用样品的采集方法如下： （一）采集样品应按临床采血技术规范及检测试剂盒要求进行。 （二）采集标本时应注意安全，操作应戴双层手套。建议采用真空采血管及蝶形针具，以免直接接触血液。,（三）血清样品采集：用注射器抽静脉血35ml，室温放置1-2小时，待血液凝固或用3000rpm离心15分钟，吸出血清备用。 （四）抗凝血样品采集(免疫功能CD4/CD8测定、血液常规CBC测定、病毒载量）：用加有抗凝剂（K3EDTA）的真空采血管或试管抽取静脉血，反复轻摇，常温6小时以内送达实验室检测CD4/CD8或CBC后，再分离血浆和血细胞备用。,（五）血清或血浆样品应存

4、放于-20， 短期内（1周）进行检测的样品可存放于2-8。 （六）用于抗原和核酸检测的血浆和血细胞样品应冻存于-20以下，进行病毒 RNA检测的样品如长期（3个月以上）保存应置于-80。,二、样品的运送 （一）抗体检测实验室间传递的样品应为血清或血浆，血液常规、CD4和病毒载量等要求送抗凝血。样品应置于带盖的试管内，试管上应有明显的标记，标明样品的编号或受检者姓名、种类和采集时间。,（二）将试管放入专用带盖的容器内，容器的材料要易于消毒处理。在试管的周围应垫有缓冲吸水材料，以免碰碎。如果路程较远或气候炎热，应在2-8条件下运送。抗凝血和抗体检测样品路程短可常温送检。包装内需附有送检单。 （三）

5、特殊情况下如需对个别样品进行复测，可以用特快专递形式投寄，但必须将盛样品的试管包扎好，保证不会破碎和溢漏。,三、样品的接收 （一）含有感染性样品的包裹必须在具有处理感染源设备的实验室内由经过培训的工作人员打开，用后的包裹应进行消毒。 （二）核对标本与送检单，检查样品管有无破损和溢漏。 （三）检查样品的状况，记录有无严重溶血、微生物污染、血脂过多以及黄疸等情况。 （四）因特殊临床治疗导致自发荧光的样品不可用于荧光方法测试。,HIV抗体检测的目的,诊断 确定个体HIV感染状况，包括临床检测、自愿咨询检测、根据特殊需要进行的体检等。 血液筛查 防止输血传播HIV，包括献血员筛查和原料血浆筛查。 监测

6、 了解不同人群HIV感染率及其变化趋势，包括各类高危人群、重点人群和一般人群。,HIV抗体检测的方法,筛查试验（包括初筛和复检）：酶联免疫吸附试验（ELISA)、化学发光试验、明胶颗粒凝聚试验（PA）、免疫渗滤试验、免疫层析试验等 确证试验：免疫印迹试验（WB)、条带免疫试验、放射免疫沉淀试验、免疫荧光试验等。,艾滋病抗体确证试验,免疫印迹法（WB）为目前最常用的HIV抗体确认方法，被公认为判断HIV感染的黄金方法。,艾滋病抗体检测试剂使用条件,HIV筛查或确认试剂必须是HIV/1+2混合型，国家卫生部批准或注册，经过国家医药监督管理局批批检合格，临床试剂评估优良，并且在有效期内。,检测要点,

7、1、严格按照试剂说明书操作，不得擅自更改。 2、注意防止交叉污染。 3、严格遵守实验室操作规程。 4、认真做好实验记录。,HIV抗体检测结果及结论,HIV抗体筛查结果阴性反应可做HIV抗体阴性报告，筛查试验呈阳性反应，可出具“HIV抗体待复查”报告，不能出HIV抗体阳性报告。筛查阳性反应或可疑阳性反应不能作最终报告通知被检测者，对个体诊断来说,只有经过确证试验，结果阳性才可做HIV抗体阳性报告。,检测程序及流程图 1、筛查检测 验收标本，用筛查试剂进行检测，如呈阴性反应，报告HIV抗体阴性；对呈阳性反应的标本，须进行重复检测。 2、重复检测 对筛查呈阳性反应的标本用原有试剂和另外一种不同原理或

8、不同厂家的试剂重复检测。,HIV抗体筛查检测流程,HIV抗体确证 1、常用的确证实验方法是免疫印迹法（WB）。 2、免疫印迹试剂有HIV-1/2混合型和单一型。一般先用HIV-1/2混合型试剂进行检测，如果呈阴性反应，则报告HIV抗体阴性，如果呈阳性反应，则报告HIV-1抗体阳性，如果不满足阳性标准，则判为HIV抗体不确定。如果出现HIV-2型的特异性指示条带，还需要用HIV-2型免疫印迹试剂再做单一的HIV-2型抗体确认试验，呈阴性反应，报告HIV-2抗体阴性；呈阳性反应的则报告HIV-2抗体血清学阳性。,HIV抗体确证检测流程,检测结果的报告和处理 HIV抗体筛查： 筛查实验呈阴性反应出具

9、HIV抗体阴性报告，如果近期有高危行为，如性乱、注射毒品等，或有急性流感样症状等情况，为排除“窗口期”的可能，建议23个月以后再做抗体检测。 筛查实验呈阳性反应，可出具“HIV抗体待复查”报告，不能出阳性报告。,HIV抗体筛查呈阳性的处理,（1）填写HIV抗体筛查阳性送检单 （2）尽可能重新采集受检者的血样。 （3）将二份血样（或仅原血样）连同HIV抗体筛查阳性送检单一并送当地艾滋病筛查中心实验室，再转送艾滋病确认实验室，或直接送确认实验室确认。 （4）筛查中心实验室应尽快进行复测。 （5）做好检测后咨询。,HIV抗体确证结果报告,1、 HIV抗体阳性应出具HIV抗体阳性确认报告，并按相关规定

10、做好咨询、保密和报告工作; 2、HIV抗体阴性应出具HIV抗体阴性确认报告，如果近期有高危行为，如性乱、注射毒品等，或有急性流感样症状等情况，为排除“窗口期”的可能，建议1个月以后再做抗体检测;,抗体确证不确定结果,HIV抗体不确定出具HIV抗体不确定确认报告，在备注中应注明“1个月后复查”。 1、随访：每1个月一次，连续2次，共2个月。 2、做好检测后咨询。,全国艾滋病检测技术规范,2009版,全国艾滋病检测技术规范,2009版,实验室记录要求,1、标本的登记 收到标本后，及时登记有关参数，包括受检者姓名或代号、试管编号、性别、年龄、职业、送检单位、人群类别、检验结果、送检日期、报告日期、备

11、注 ( 必要时记录通信地址 )等。 2、实验原始记录表 应按实验要求，设计操作的原始记录表，标明空白对照、阳性对照、阴性对照、外部对照以及待检样品的位置，便于指导实验人员加样。要注明试剂盒来源、测定方法、批号、有效期、操作人员和复核人员姓名及检测日期。,3、HIV 阳性标本的保存记录 记录HIV阳性标本的储存量、储存温度、储存起始时间以及标本保管人姓名。 4、文件存档 实验原始记录表、打印数据、检测记录表、标本登记、标本保存记录以及仪器设备维修和校准记录等都应该妥善存档保存15年以上。最好同时使用计算机保存各种文件和记录。,HIV感染产妇所生儿童HIV抗体 检测策略及流程,适用范围 HIV感染

12、产妇所生婴幼儿；已满18个月的婴幼儿，其母亲HIV感染状态不详，儿童出现HIV相关临床表现，临床怀疑HIV感染的儿童。,HIV感染产妇所生儿童HIV抗体 检测策略及流程,检测程序及结果报告 婴儿满12个月进行第一次HIV抗体检测。使用两种不同原理或不同厂家筛查试剂进行抗体检测，两种筛查试剂检测结果均为阴性反应，报告“HIV抗体阴性（）”，可排除感染。检测结果出现阳性反应（一种为阴性反应一种为阳性反应或两种均呈阳性反应），不能排除感染，应继续追踪随访，至儿童满18个月时再次进行HIV抗体检测。,HIV感染产妇所生儿童HIV抗体 检测策略及流程,检测程序及结果报告 婴儿满18个月时应再次进行HIV

13、抗体检测。使用两种不同原理或不同厂家筛查试剂进行抗体检测。两种筛查试剂的检测结果均为阴性反应，报告“HIV抗体阴性（）”，可排除感染。检测出现阳性反应（一种为阴性反应一种为阳性反应或两种均呈阳性反应），进一步进行确证试验，根据确证试验的结果判断是否感染HIV 。,HIV感染产妇所生儿童HIV抗体 检测策略及流程,检测程序及结果报告 在发放检测报告的同时上报疫情； 做好检测后咨询。,全国艾滋病检测技术规范,2009版,免疫功能（CD4/CD8）的检测,T淋巴细胞分类,在T淋巴细胞分类中，CD4代表T辅助细胞而CD8代表T抑制细胞和T杀伤细胞。CD4+T淋巴细胞是HIV感染的主要靶细胞，也是免疫反

14、应的中心细胞；CD8+T淋巴细胞是免疫反应的效应细胞。,T淋巴细胞分类,正常人的CD4+T淋巴细胞约占总的T淋巴细胞的65%，CD8+T淋巴细胞约占35%。人体感染了HIV后，涉及的主要病理过程就是免疫系统的损害，主要表现为：CD4+T淋巴细胞的丢失，绝对数量的减少，同时CD8+T淋巴细胞数量增加，CD4和CD8的比例失调。因此CD4+T淋巴细胞计数作为直接测定免疫功能的方法，是提供HIV感染病人免疫系统损害状况最明确的指标。,CD4+T淋巴细胞正常值,CD4：410-1590/mm3 CD8：190-1140/mm3 CD4/CD8：1,CD4+T淋巴细胞计数意义,是艾滋病疾病分期、确定诊断

15、、制定抗病毒治疗和预防机会性感染方案的标准实验室指标，也是与病毒载量相配合预测疾病进程的可靠指标。,CD4+T淋巴细胞检测意义,1、用于HIV感染者的疾病分期：凡CD4+T淋巴细胞200/mm3或CD4+T淋巴细胞的百分比14%的HIV感染者可归入艾滋病。,CD4+T淋巴细胞检测意义,2、判断HIV感染者的临床合并症（各种机会性感染与CD4+T淋巴细胞的相关性），如CD4+T淋巴细胞200/ mm3时，很容易发生卡氏肺囊虫肺炎；而巨细胞病毒感染和鸟分支杆菌感染常发生于CD4+T淋巴细胞50/mm3的病人，极少见于CD4+T淋巴细胞100/mm3的病人。,CD4+T淋巴细胞检测意义,3、 帮助确

16、定抗HIV药物治疗及机会性感染预防性治疗的适应症，例如，当CD4+T淋巴细胞200/ mm3时，应给予抗卡氏肺囊虫肺炎的预防性治疗； 4、抗HIV药物疗效的重要判断指标。,成人及青少年艾滋病分期标准（美国CDC.1993）,CD4200/ul和/或出现艾滋病指征性症状（如卡氏肺囊虫肺炎等）时，就可定义为进入艾滋病期。如表中A3，B3，C1-3期。,CD4+、CD8+T细胞检测绝对计数方法,单平台法： 应用流式细胞仪、绝对计数管及相应软件，可直接得出CD4+、CD8+T细胞值，操作简单，结果准确，目前广泛应用。 多重平台法： 包括白细胞计数、白细胞中的淋巴细胞百分比及淋巴细胞中的CD4+T/CD

17、8+T细胞百分比等三项实验室检测技术，操作及计算较复杂，结果准确性不如单平台法。,CD4检测样品要求,抗凝血 新鲜、不溶血、无脂肪血 按要求常温送检 信息满足要求,样品的采集,1、合适抗凝管：有2ml、 4ml、 10ml不同容量管； 2、抗凝剂：用于流式细胞仪免疫表型检测的抗凝剂（K2EDTA，K3EDTA）； 3、采血管上注明样品编号等信息； 4、按管的容量采集； 5、采血后立即握住试管两端，垂直轻柔颠倒混匀数次，防止血液凝固； 6、填写相应的送样单，信息满足要求，编号与采血管一致。,样品的运输,1、包装应符合国家病原微生物实验室生物安全管理条例防泄漏、防污染，运输样品至检测实验室； 2、

18、要求室温条件（1825）保存和运输样品，避免极端温度（结冰或大于37 ），高温季节，需用隔热容器盛装样品，并将其置于有冰袋和吸热物质的容器中 3、样品采集后6小时送达实验室检测效果最好。,样品的接收,1、专人接收样品，检查样品质量、数量并核对标识，送检单需记录样品详细资料； 2、溶血、凝血、严重脂血、结冰、量不足、管裂有渗漏的样品视为不合格样品； 3、超过检测允许时间的样品接收但不能用于CD4检测；,样品检测要求、报告及结果录入,建议实验室及时检测； 一般要求24小时内染色，染色后6小时内分析； 两天内出报告，报告及时反馈到治疗点； 治疗点及时将检测结果录入国家治疗信息系统。,CD4实验室网络

19、,全区目前共有25个CD4检测实验室，分布14个市级CDC，3家医院和9个县级CDC，去年自治区卫生厅新招标采购多台流式细胞仪，将陆续配备到疫情较为严重的县级CDC和抗病毒治疗点。,CD4实验室网络,1、自治区CDC 11、贵港市CDC 2、百色市CDC 12、钦州市CDC 3、崇左市CDC 13、防城港市CDC 4、河池市CDC 14、北海市CDC 5、桂林市CDC 15、贺州市人民医院 6、南宁市CDC 16、广西龙潭医院 7、柳州市CDC 17、南宁市四医院 8、来宾市CDC 18、灵山县CDC 9、梧州市CDC 19、鹿寨县 10、玉林市CDC 20、平南县CDC ,病毒载量检测,1、

20、辅助诊断,某些非典型的抗体反应，特别是不确定反应时，RNA的测定可提供非常有用的证据。 单纯使用RNA测定不能完全确定感染与否，但当RNA测定出现较高拷贝数的阳性结果时（1000）提示感染发生的可能性非常大。,2、窗口期辅助诊断,在窗口期抗原峰出现前后通常出现一个病毒载量的高峰，通常此高峰高于发病时的血浆病毒水平，早期病毒RNA测定具有特殊的意义。 目前国际上正在尝试使用这种检测对采供血样品进行多个样品混合后的RNA检测以降低窗口期传播的残余危险度。,3、病程监控,由于HIV感染发生后病毒载量的变化具有一定规律，并且这种变化与疾病的进程有着密切的相关性。 通常在感染后无症状期内发生的临床症状很

21、难与AIDS发病时的症状区别，病毒载量测定可以帮助医生判断一个刚发生的症状是否与HIV感染有关。,4、指导治疗方案及疗效测定,并非在任何情况下感染者都应该进行抗病毒治疗，这不但是经济上的原因，更重要的是在于抗病毒药物的副作用和疗效。通常在病毒载量达到一定水平后（如35000-50000拷贝/毫升）才具有良好的效果。 只有通过治疗后病毒水平的检测才能确定治疗是否有效，通常治疗后病毒水平降低50%才被认为临床有效。,1000 800 600 400 200,6 5 4 3 2,0 20 40 60 week,HAART,STI,HIV-1 plasma RNA CD4+ T cell count,

22、HIV-1 plasma RNA,CD4+ T cell count,5、预测疾病进程,HIV疾病进程与病毒载量的关系十分密切，观察感染者病毒RNA水平可大致预测其发病的可能。如右图所示，病毒载量与6年发病率的关系为： 30000时则为80%。,两种方法检测病毒载量,（一）RT-PCR （二）NASBA EasyQ,病毒载量检测样品要求,血浆 样品量约1毫升 样品要求保存低温保存（-20以下） 冷冻运输,实验室网络,自治区CDC确证中心实验室 柳州市CDC确证实验室 梧州市CDC确证实验室 贺州市CDC确证实验室 龙潭医院确证实验室 桂林市CDC确证实验室,3.12105,低于最低检测限（40

23、0拷贝/毫升）,高于最高检测限（7.5105拷贝/毫升）,RT-PCR病毒载量结果的报告三种情况,具体的一个数值（该值在400- 7.5105拷贝/毫升） 低于最低检测限（400拷贝/毫升） 高于最高检测限（7.5105拷贝/毫升）,1.6105,低于最低检测限（50拷贝/毫升）,高于最高检测限（3.0106拷贝/毫升）,NASBA EASYQ病毒载量结果报告的三种情况,具体的一个数值（该值在50 3.0106拷贝/毫升） 低于最低检测限（50拷贝/毫升） 高于最高检测限（3.0106拷贝/毫升）,注意事项,1、不同检测方法的结果不能直接比较，必须转化为国际单位 RT-PCR:1IU/ml=0

24、.51copies/ml NASBA EASYQ:1IU/ml=1copies/ml,注意事项,2、检测结果低于最低检测限不能排除HIV感染 3、病毒载量结果低于1000copies/ml不进行耐药检测，只有大于1000copies/ml的病人才做耐药检测。,艾滋病检测实验室安全防护,一、建立安全制度 （一）实验室的设备、建筑和设施的安全性应通过专家的评审。 （二）建立安全标准操作程序，该程序应适用于现有的实验条件，并与实验室其他规章制度一致。 （三）无论是否发生意外事故，每年都要对安全标准操作程序及其实施情况进行检查。 （四）制定意外事故处理预案。建立意外事故的登记和报告制度。,二、人员管理

25、和培训 （一）人员管理 1、实验室主任应了解所有工作人员。在安排工作区域时，要根据人员的工作种类和所涉及的生物材料，对实验室环境做安全检查。 2、新调入人员、外来合作、进修和学习的人员在进入实验室之前必须经过实验室主任的批准。非实验室人员和物品不得进入实验室。 3、严格执行实验室工作人员年度采血检测HIV抗体和备案制度，工作人员血清应长期保留。,（二）培训 1、所有工作人员必须经过HIV检测技术和实验室安全培训，包括上岗培训和复训，并接受实验室管理人员的监督。实验室的安全责任人要对工作和环境的安全负责，所有工作人员都有责任保护自己和他人的安全。 2、必须告知新上岗人员实验室工作的潜在危险，进行

26、安全教育，直至有能力后方可单独工作。,三、安全保障措施 （一）个人保健 1、高标准的个人保健对于减少感染的危险性很重要。皮肤受损、患病都会增加感染的危险。皮肤的伤口和擦伤都应以防水敷料覆盖。 2、进实验室前要摘除首饰，修剪长的带刺的指甲，以免刺破手套。 3、进入实验室应穿隔离衣，戴手套。如果接触物传染危险性大，则应戴双层手套和防护眼镜。 4、脱去隔离衣，离开实验室前必须洗手。 5、严禁在艾滋病检测实验室内进食、饮水、吸烟和化妆。,（二）带入和带出实验室的物品 1、对所有带入实验室的物品都应进行检查。含有测试样品的包裹应在安全柜或其他适当的装置内打开。 2、将HIV测试样品转送其他实验室时，应防

27、止对人员和环境的污染。护送样品的人应明确接收地点和接收人，实验室负责人或其指定的人员应及时确认样本已送达指定的实验室，被转入安全位置并得到妥善处理。 3、污染或可能造成污染的材料在带出实验室前应进行消毒。,（三）减少利器的使用 1、尽量避免在实验室使用针头、刀片等利器，如果必须使用在处理或清洗时，应采取措施防止刺伤或划伤，并应对用过的物品进行消毒处理。 2、最好不使用玻璃制品。 3、尽量使用安全针具采血，如蝶形真空针，自毁性针具等，以降低直接接触血液和刺伤的危险性。.应将用过的针头直接放入坚固的容器内，消毒后废弃。,（四）HIV消毒方法 实验室常用物品的消毒方法如下： 1、废弃物缸：10%（v

28、/v）次氯酸钠（含10，000 mg/L有效氯）。 2、生物安全柜工作台面和仪器表面：70%乙醇。 3、溢出物：10%次氯酸钠。,4、生物安全柜和实验室：甲醛蒸气熏蒸。生物安全柜：25ml福尔马林（40%w/v甲醛）和等量水混合后放在一个蒸发皿中使其在密封的生物安全柜中蒸发，保持至少6小时，最好过夜。实验室：福尔马林和水加热沸腾，其体积根据实验室的大小而定。 5、污染的台面和器具：37%甲醛水溶液，也可以用过氧化氢或过氧乙酸。,四、实验室事故处理 （一）紧急处理措施 发生意外事故时，应立即进行紧急处理，根据具体情况采用相应的方法。 1、皮肤针刺伤或切割伤：立即用肥皂和大量流水冲洗，尽可能挤出损

29、伤处的血液，用70%乙醇或其他消毒剂消毒伤口。 2、皮肤污染：用水和肥皂冲洗污染部位，并用适当的消毒剂浸泡，如70%乙醇或其他皮肤消毒剂。,3、粘膜污染：用大量流水或生理盐水彻底冲洗 污染部位。 4、衣物污染：尽快脱掉污染的衣物，进行消毒处理。 5、污染物泼溅：发生小范围污染物泼溅事故时，应立即进行消毒处理。发生大范围污染物泼溅事故时，应立即通知实验室主管领导和安全负责人到达事故现场查清情况，确定消毒的程序。,（二）事故登记： 主要内容有： 1、事故发生的时间、地点及详细经过。 2、暴露方式；受伤部位、伤口深浅、暴露程度；污染物种类（培养液、血液或其他体液）以及其中含有HIV的情况。 3、处理方法和经过，包括专家或领导赴现场指导和处理的情况。 4、是否采用暴露后药物预防，如果是，应详细记录用药情况、包括首次用药时间、服药方案和毒副作用。 5、随访检测的日期、项目和结果。,（三）报告和检测 1、发生重大事故时，在紧急处理的同时要立即向主管领导报告。同时抽血检测HIV抗体，暴露一年内要定期检测。 2、发生小型事故时可在紧急处理后立即将事故情况和处理方法报告主管领导，检测同前。,谢谢！,