艾滋病、梅毒和乙肝检测方法介绍及选择.ppt

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1、艾滋病、梅毒、乙肝检测方法介绍及选择,湖北省疾病预防控制中心 彭庭海 2014年5月,艾滋病、梅毒、乙肝-概况,母婴传播,艾滋病：约1535% HIV阳性孕妇会发生母婴传播。90%以上儿童HIV感染者是由母亲垂直传播而感染 。 梅毒：流产、早产、死胎或马鞍鼻、先天性耳聋等。 乙肝：在我国，人群中40-50%是由母婴传播积累而成。,主 要 内 容,一.艾滋病实验室检测技术 HIV抗体检测 核酸检测 CD4+T淋巴细胞检测 二.梅毒检测技术 显微镜检查法 血清学检查法 三.乙肝检测技术 HBV免疫标志物检测 HBV-DNA,HIV抗体筛查样品,血清/血浆/全血 滤纸干血斑 唾液 尿液,筛查试剂,国

2、家食品药品监督管理局注册批准 有效期内 酶联免疫试剂应批批检合格 选择敏感性和特异性高的试剂,筛查方法,酶联免疫吸附试验（ELISA） 化学发光或免疫荧光试验：采用发光或荧光底物，用发光或荧光仪测定结果。 快速检测（RT）及其它检测试验 (1)明胶颗粒凝集试验(PA) (2)免疫渗滤试验 (3)免疫层析试验,(1)酶联免疫吸附试验（ELISA）,HIV抗体检测试剂：检测HIV-1/2抗体 HIV抗原抗体联合检测试剂：可同时检测血液中HIV-1P24抗原和HIV-1/2抗体 用酶标仪测定结果,四代艾滋病酶联免疫试剂比较,第四代,病毒裂解液 重组抗原合成肽 HIV-1 / -2 / -O anti

3、-p24 Ab,IgM / IgG 抗体 HIV-1 / -2 / -O p24 抗原,病毒裂解液 重组抗原合成肽 HIV-1 / -2 / -O anti-p24 抗体,ELISA酶联免疫吸附实验 ELISA Enzyme linked immuno sorbent assay,+ ve,- ve,阴性对照,阳性对照,阴性,阳性,质控,酶联免疫吸附试验（ELISA）,优点：准确性高、价格低廉、判断结果标准客观、结果便于记录和保存 用途：流行病学监测及临床大量标本的检测,(2)化学发光或免疫荧光试验,采用发光或荧光底物 既可检测抗体，也可联合检测抗原抗体 酶或荧光标记的HIV抗原或抗体，加发光

4、或荧光底物 用发光仪或荧光仪测定结果,全血样品 加50ul样品于样品垫中,手指血方法,静脉血方法,加一滴缓冲液,15分钟内读取结果,（3）快速检测（RT）及其它检测试验,快速检测（RT）及其它检测试验,优点:试验简便快速，适用于应急检测、门诊急诊检测。不需专门设备和人员培训,一般可在1030分钟内得出结果。 缺点:肉眼判断较主观、价格较贵、结果不易保存。,HIV抗体筛查检测流程图,HIV抗体确证试验,确证试验的试剂： 必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂。 确证样品： 可采用血清、血浆、滤纸干血斑 确证试验方法： 免疫印迹试验(WB)、条带免疫试验(LIATEK HIV)、

5、放射免疫沉淀试验(RIPA)及免疫荧光试验(IFA)。国内常用的确证试验方法是WB。,HIV抗体确证实验结果,初筛检测阳性标本,两种筛查试剂,报告阴性,阴性反应,一阴一阳,阳性反应,确证试剂,复检试验,根据具体情况进一步 检测HIV-2,报告阴性,出现HIV-2指示条带,阴性反应,不确定反应,报告HIV-1 阳性,HIV-1 阳性反应,结合流行病学资料，可以在4周后随访检测，如带型没有进展或呈阴性反应， 则报告阴性；如随访期间出现阳性反应，则报告阳性；如随访期间带型有进展， 但不满足阳性标准，应继续随访到8周。如带型没有进展或呈阴性反应则报告 阴性；满足HIV抗体阳性诊断标准则报告阳性，不满足

6、阳性判断标准可视情况 决定是否继续随访。,HIV抗体确证检测流程图,产时艾滋病抗体检测及服务流程,实验室需备有： 12种HIV-1/2抗体ELISA（化学发光）试剂 2种HIV-1/2抗体快速试剂 百度“HIV抗体试剂临床评估”,HIV抗体 母亲 HIV 抗体经胎盘进入胎儿，出生时新生儿和婴儿早期抗体阳性，不一定是感染 出生时母亲的抗体，8090% 在生后 912 个月消失，出生后 18 个月基本上全部消失 18 个月后儿童 HIV抗体仍然阳性，视为自身感染产生的抗体,18个月以下婴幼儿的HIV诊断,婴幼儿HIV感染的抗体检测,适用于： HIV感染产妇所生婴幼儿； 母亲HIV感染状态不详，儿童

7、出现HIV相关临床表现，临床怀疑HIV感染的儿童。 婴儿12个月时进行HIV抗体检测 阴性排除感染，纳入正常儿童保健； 阳性者继续追踪随访，至18个月再次进行HIV抗体检测，结果阴性排除感染。,艾滋病病毒感染产妇所生儿童,阳,阴,用另一种不同原理或不同厂家 生产的筛查试剂再次检测,12个月进行HIV抗体筛查试验,确证试验,18个月时再进行HIV抗体筛查试验,报告HIV抗体检测结果阴性,艾滋病感染产妇所生儿童HIV抗体检测流程,阳性,阴性,阴性,阳性,用另一种不同原理或不同厂 家生产的筛查试剂再次检测,阴性,阴性,阳性,报告HIV抗体检测结果阳性,提供咨询，继续 随访，4周后再次 进行确证试验,

8、不确定,阳性,18个月以下婴幼儿的HIV诊断,核酸检测 HIV 前病毒 DNA（HIV DNA） 检测已整合到外周血液中血细胞基因组上的 HIV DNA 基于 PCR 技术 高特异度(98%)和高灵敏度 (99%),18个月以下婴幼儿的HIV诊断,HIV 病毒载量（HIV RNA） 用来监测已知的HIV 感染病人的病毒载量试验； 真阳性的结果通常 100,000 拷贝/毫升, 而假阳性结果 1,000拷贝/毫升 RT-PCR、NASBA、CDNA、荧光定量PCR,婴幼儿HIV感染的核酸检测,可检测HIV RNA也可检测HIV DNA 首选检测HIV DNA HIV DNA检测不受母亲围产期抗逆

9、转录病毒治疗和人乳汁中抗逆转录病毒药物以及婴幼儿预防性抗逆转录病毒治疗的干扰 考虑母亲血液污染因素，不推荐使用脐带血进行HIV核酸检测 。,婴儿的早期诊断,HIV感染母亲所生小于 18个月龄的婴儿，不同时间的两次HIV核酸检测均为阳性即可作出诊断。 18个月龄以上儿童诊断与成人相同：有急性HIV感染综合症或流行病学史，且不同时间的两次HIV核酸检测结果均为阳性，即可诊断。,HIV感染产妇所生婴儿,婴儿满3个月，再次采集 血标本，送检,尽快采集第二份血标本，送检,出生后6周采集第一份血标本（可制备成 滤纸片干血斑（DBS），或EDTA抗凝全血），送检,继续随访,报告阳性,艾滋病感染产妇所生儿童H

10、IV感染早期诊断检测流程,呈阴性反应,呈阳性反应,呈阳性反应,呈阴性反应,呈阳性反应,尽快再次采集血样，送检,报告阴性,呈阳性反应,呈阴性反应,呈阴性反应,婴幼儿HIV感染的核酸检测,需要注意： 不同时间“婴儿HIV感染早期诊断”检测均呈阴性反应的喂哺母乳的儿童，应在完全停止喂哺母乳后的6周和3个月（若6周时检测结果为阳性可尽快）再次采血进行核酸定性检测。儿童满18个月后则可直接进行抗体检测。,婴幼儿HIV感染的核酸检测方法,HIV-DNA 1） Roche Amplicor HIV-1 DNA PCR, version 1.5试剂盒 2）IN-HOUSE（国内开展，2009年检测技术规范）,

11、Amplicor HIV-1 DNA简介,样本： 滤纸片干血斑、EDTA抗凝全血 方法学：PCR-ELISA 结果类型：定性 靶物质：感染宿主细胞中的pro-viral HIV-1 DNA,滤纸片干血斑,将全血滴在特定的滤纸片上制备。 它主要应用于临床医学中新生儿先天性缺陷疾病的早期筛查。如：苯丙酮尿症，先天性甲状腺机能低下，维生素缺乏和一些感染性疾病的检测。,滤纸片干血斑用于婴儿HIV诊断,样本量非常小， (20 l to 200l)特别适宜采集婴儿样本。 容易收集: 指尖血、后跟血。能提取全血，血浆、血清。 短期运输可在常温下长期可贮存在20C 样本可在常温下运输: 不需要干冰 DBS 可

12、作为一种无感染性材料运输（在美国）,滤纸片的选择,Whatman 903滤纸片（可用于HIV抗体、HIV前病毒DNA和HIV RNA检测 ） FTA标准卡滤纸片 （可用于HIV前病毒DNA检测 ）,采集样本所需要的材料,血样本采集卡 片(滤纸片)； 可密封的塑料袋； 湿度指示卡； 干燥剂（1-2g/袋）；,怎样采集末梢血DBS,应用通用的安全防护措施； 清晰准确地在卡片上标记识别码； 完成针刺指尖程序； 均一地使每个印圈饱和地吸附血液；,两个充分吸附血液 的印圈比五个不完全吸附 的印圈要好,怎样采集抗凝静脉血DBS,静脉血充分与EDTA混合； 最好采集后立即制备干血斑； 血浆与血细胞分层的全血

13、在制备干血斑前，应轻柔地上下颠倒采血管（避免血细胞破裂），使血液混匀后制备；,用移液枪加代滤芯枪头移取75-80ul血液； 枪头对准印圈的中心缓慢将血液滴于滤纸上； 避免有气泡；,怎样干燥DBS,避免触摸或涂抹血斑； 室温空气中水平干燥（至少4个小时）； 避免阳光直晒； 在干燥过程中不允许加热，叠加或将DBS接触其他表面；,在包装前充分干燥DBS,滤纸片干血斑的包装与运输,将完全干燥的滤纸片干血斑样本用塑料袋进行独立包装，或者用秤量纸隔开，以避免样本之间的污染。 已独立包装好的样本一起放入密封塑料袋中 ，加入几包干燥剂,加入湿度指示卡。 将包装好的滤纸片干血斑，连同相应的文件（如采样/送样单等

14、）放入大信封中。 密封后可邮寄运输。,放入密封袋,加入干燥剂,加入湿度指示卡,标记袋中内容物,核酸检测,2次检测阳性可早期诊断HIV感染，如果不具备条件，也可用HIV病毒载量法来代替，2次检测阳性也可诊断HIV感染，18个月龄以后再做抗体检测确认。,HIV核酸定量检测,通过SFDA审批的试剂盒、方法 NASBA EasyQ Amplicor Taqman bDNA340 440 M2000 PG,CD4+T淋巴细胞检测,CD4+T淋巴细胞计数,广泛应用于HIV感染者的临床管理中，协助判断感染者的预后、指导实施抗病毒治疗和疗效观察以及药物预防机会性感染等方面。,CD4+T淋巴细胞检测,对于免疫功

15、能相对较好，CD4+T淋巴细胞计数350/mm3的艾滋病感染孕产妇，采用预防性抗病毒用药方案； 对于CD4+T淋巴细胞计数350/mm3的艾滋病感染孕产妇，采用治疗性抗病毒用药方案。,常规CD4+T淋巴细胞检测的方法和程序,流式细胞仪检测方法 双平台方法 单平台方法 样品：EDTA、枸橼酸（ACD）或肝素抗凝全血 运送条件： 室温（1825）保存和运输样品 避免极端温度（结冰或大于37） 高温季节，需用隔热容器盛装样品，并将其置于有冰袋和吸热物质的容器中。,常规CD4+T淋巴细胞检测的方法和程序,48小时内染色，染色后6小时内分析； 如采血后24小时内染色，可在染色后24小时内分析； 利用CD

16、45单克隆抗体设淋巴细胞门，可检测放置72小时的样品； 在血球分析仪生产商允许的样品采集时间范围内检测。,FACSCalibur流式细胞仪,二、梅毒检测技术 显微镜检查法 血清学检查法 梅毒特异性抗原血清学检测 梅毒非特异性抗原血清学检测,各期梅毒的取材部位和检查方法,临床表现 取材部位 检查方法 一期梅毒 溃疡、淋巴结 暗视野检查 血液 血清学检查 二期梅毒 皮损、淋巴结 暗视野检查 血液 血清学检查 三期梅毒 血液、脑脊液 血清学检查 隐性梅毒 血液 血清学检查 胎传梅毒 皮损、胎盘 暗视野检查 血液 血清学检查,（一)、显微镜检查法,1.暗视野显微镜检查 2.直接免疫荧光试验（DFA）

17、3.渡银染色检查,1.暗视野显微镜检查,暗视野显微镜下，典型的梅毒螺旋体呈白色发光, 其螺旋较密而均匀。运动规律，运动性较强，其运动方式包括旋转式，围绕其长轴旋转；蛇行式, 全身弯曲如蛇行；伸缩其螺旋间距离而移动。观察其运动形式有助于与其他螺旋体相鉴别。 未检出螺旋体不能排除梅毒的诊断，阴性结果可能说明：螺旋体数量不足(单次暗视野显微镜检查阳性率小于50%)。患者已接受抗生素或杀灭梅毒螺旋体的药物治疗。损害接近自然消退。损害不是梅毒。,2.直接免疫荧光试验（DFA),在荧光显微镜下可见到发苹果绿色的梅毒螺旋体。 临床意义与暗视野显微镜检测相同。 DFA的特异性及敏感性均大于暗视野显微镜检测。,

18、3.梅毒螺旋体渡银染色检查,梅毒螺旋体具有亲银性，显微镜下可见到染成棕色的梅毒螺旋体。临床意义基本同暗视野显微镜检查法。,(二)、血清学检查法,血清学检查是辅助诊断梅毒的重要手段。 当人体感染梅毒螺旋体后410周左右，血清中可产生一定数量的抗类脂质抗原的非特异性反应素（主要是IgM、IgG）和抗梅毒螺旋体抗原的特异性抗体（主要是IgM、IgG）。这些抗体均可用免疫学方法进行检测。,梅毒血清学检测方法,1.非梅毒螺旋体抗原血清试验,1.1 性病研究实验室试验（Venereal Disease Research Laboratory test，VDRL） 1.2 快速血浆反应素环状卡片试验（Rap

19、id plasma reagin circle card test，RPR） 1.3 甲苯胺红试验（Toluidine red unheated serum test，TRUST） 方法简便、快速，敏感性和特异性较好。对一期梅毒的敏感性为7487，二期梅毒达100，三期梅毒3494。特异性9699。,非梅毒螺旋体抗原血清试验临床意义,适用于各期梅毒的诊断。早期梅毒经治疗后血清滴度可下降或转阴，故可用于疗效观察、判愈、判定复发或再感染。也适用于人群的筛查、产前检查及健康体检等。 VDRL试验适用于神经梅毒的脑脊液检查, 特异性高，但敏感性低。 可在某些传染病及胶原病时出现假阳性反应，因此对阳性反

20、应应结合临床进行鉴别，或做梅毒螺旋体抗原血清试验以进一步证实之。,2.梅毒螺旋体抗原血清试验,采用梅毒螺旋体作抗原，为特异性抗原，检测血清中抗梅毒螺旋体IgG或IgM抗体。 敏感性和特异性均较高。一期梅毒的敏感性为70100，二期梅毒达100，三期梅毒9598，特异性94100。,梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验（TPPA）,原理 TPPA试验用梅毒螺旋体致敏明胶颗粒，此致敏颗粒与人血清中的抗梅毒螺旋体抗体结合，产生可见的凝集反应。明胶颗粒为玫瑰红色，便于肉眼观察结果。,梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验（TP-ELISA）,原理 用经纯化及超声裂解处理的梅毒螺旋体为抗原包被固相板条 加入待检血清和辣根过氧

21、化酶标记的抗人IgG抗体，利用酶免疫法检测患者血清中的抗梅毒螺旋体特异性抗体。 采用特异的梅毒螺旋体重组蛋白作为抗原，使试验更加敏感、特异。,梅毒IgM抗体血清学试验,梅毒特异性IgM抗体是梅毒感染最早期产生的抗体。 IgM分子量较大不能通过胎盘屏障。因此在新生儿血中检测到IgM抗体表明有先天感染。 如在患者的脑脊液检测到IgM抗体表明有活动性神经梅毒。 血液中或脑脊液中出现抗梅毒IgM抗体均表示需要治疗。,梅毒螺旋体抗原血清试验临床意义,梅毒螺旋体抗原血清试验多用作证实试验，特别是隐性梅毒及一些非螺旋体抗原血清试验阴性而又怀疑为梅毒的患者。但不能用于观察疗效、判断复发及再感染。 梅毒螺旋体抗

22、原血清试验偶可出现生物学假阳性反应。,梅毒血清学试验的合理应用,非梅毒螺旋体试验阳性可能表示：现症感染、接受或未接受过治疗的近期感染、生物学假阳性结果。在一般人群中的假阳性率是1-3%。大部分假阳性血清抗体滴度1:4，但低滴度不能排除梅毒，可出现在潜伏或晚期梅毒病人中。 梅毒螺旋体试验阳性可表示：现症感染、接受或未接受过治疗的近期感染、既往感染。,梅毒血清学试验的结果解释,梅毒感染产妇所生儿童随访及 先天梅毒感染状态监测图,承担母婴阻断梅毒检测工作的实验室需备有,非梅毒螺旋体抗原血清试剂（TRUST或RPR） 梅毒螺旋体抗原血清试剂（TPPA或TP-ELISA、TP-RT） 有条件可备TP-IgM,诊断、监测 方法,HBV血清学试验 EIA检测HBsAg、Immunoblot assay,HBV-DNA定性试验 PCR,HBV-DNA定量试验PCR、bDNA,ALT,肝活检,基因分型,三.乙肝检测技术 诊断乙肝感染者和现患病人的最佳实验室方法,HBV血清学标志物检测(ELISA) 可重复，经济，经FDA认可 HBsAg/抗HBs HBeAg/抗HBe 抗HBc 化学发光法 RT,HBsAg在感染HBV两周后即可阳性， HBsAg阳性反映现症HBV感染。 HBV-DNA 定量检测 是病毒复制水平最可靠与直接的证据，与传染性和疾病进展密切相关。,谢 谢！ email:,