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1、第四讲 高效液相色谱法,一.高效液相色谱法简介 起源于20世纪60年代末至70年代初 融合了经典液相色谱和气相色谱的优点。 速度快、效率高、操作自动化 适用于蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分析。,比较高效液相色谱法 与经典液相色谱法 高速 高效液相色谱法在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。 高效 由于高效液相色谱应用了颗粒极细(几微米至几十微米直径)、规则、均匀的固定相，传质阻力小，分离效率高。 高灵敏度 由于现代高效液相色谱仪普遍配有高灵敏度检测器，使其分析灵敏度比经典色谱有较大提高。,高效液相色谱=高速液相色谱=高压液相色谱,高效液相色谱法与气相色谱法
2、比较 三方面的优点 气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的30。占有机物总数近70的高沸点、热稳定性差、分子量大的物质，主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。 气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。,二.高效液相色谱仪结构 高效液相色谱仪的结构一般可分为4个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。,高效液相色谱仪工作过程 首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器的流动相将样品同时带入色谱柱
3、进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。,1、高压输液系统 一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻尼器等组成。由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。它是高效液相色谱仪最重要的部件，,2、进祥系统 隔膜注射进样器 在色谱柱顶端装一耐压弹性隔膜，进样时用微量注射器刺穿隔膜将试样注入色谱柱。 优点：装置简单、价廉、死体积小，缺点是允许进样量小，重复性差。,高压进样阀 目前多采用六通阀进样。进样量由定量管的体积严格控制，进样准确，重复性好，适于作定量分析，更换不同体积的定量管，可调整
4、进样量。,3、色谱柱是液相色谱的心脏部件，包括柱管与固定相两部分。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长530cm，内径为45mm，凝胶色谱柱内径312mm，制备柱内径较大，可达25mm以上。,保护柱：一般在分离前备有一个前置柱，内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离柱性能不受影响。,4、检测系统包括两种基本类型的检测器。 一类是溶质性检测器。它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。 另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测
5、器的有示差折光，电导检测器等。,（检出限可达1012 g/cm3 1013 g/cm3 ），,5、附属系统 它包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分收集以及数据处理等装置。 梯度淋洗，指在分离过程中使流动相的组成随时间改变而改变。通过连续改变色谱柱中流动相的极性、离子强度或pH等因素，使被侧组分的相对保留值得以改变，提高分离效率。,四.高效液相色谱法的使用技巧 1.分离类型的选择 高效液相色谱法的各种方法都各有其自身特点和应用范围，一种方法不可能是万能的，它们往往相互补充。应根据分离分析目的；试样的性质和量多少；现有设备条件等选择最合适的方法。一般可根据试样的相对分子质量大小，溶解度及分子结
6、构等进行分离方法初步选择。,根据相对分子质量选择 相对分子质量十分低的样品，其挥发性好，适用于气相色谱，标准液相色谱类型(液固、液液、及离子交换色谱)最适合的相对分子质量范围是200-2000。对于相对分子质量大于2000的样品，则用尺寸排阻法为最佳。,根据溶解度选择 如果样品可溶于水并属于能离解物质，以采用离子交换色谱为佳； 如样品可溶于烃类(如苯或异辛烷)，则可采用液固吸附色谱； 如样品溶解于四氯化碳。则多采用常规的分配和吸附色谱分离； 如样品既溶于水又溶于异丙醇时，常用水和异丙醇的混合液作液液分配色谱的流动相，以憎水性化合物作固定相。,根据分子结构选择 （用红外光谱法简单判断样品中的官能
7、团，确定采用的方法） 酸、碱化合物用离子交换色谱； 脂肪族或芳香族用液液分配色谱、液固吸附色谱； 异构体用液固吸附色谱； 同系物不同官能团及强氢键的用液液分配色谱。,2.流动相溶剂的要求 溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。 化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。 高纯度、低粘度、与检测器匹配。,五、高效液相色谱法的计算 1.外标法 该法是应用最广泛的方法之一，其误差来源主要是进样误差，因此，分析前一定要做面积重复性（即进样重复性）实验。,外标法,公式：,优点： 1）不需所有峰都流出或被检测到 2）只对所测组分作校正 缺点： 1）进样量必须准确 2）仪器必须有良好的稳定性,2、内标法 在样品中添加内标物，通过组分与内标峰的面积比，对组分进行定量。该方法减小了进样误差对定量结果的影响。,选择内标物应注意,理化性质与待测物相近 色谱响应与待测物相近 与待测物有良好的分离，但不能相距太远 与待测物的峰面积比为0.7-1.3最好，因此要根据待测物的浓度确定内标物的添加量,内标法,公式：,优点： 1）进样量不严格要求 2）只对所测组分作校正 缺点： 1）必须在样品中加一内标组分 2）操作较为繁琐 3）选择内标物困难,