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1、第十二章 高效液相色谱法,分析化学（仪器分析部分）,12-1 高效液相色谱特点与仪器 12-1-1 流程 12-1-2 特点与应用 12-1-3 主要部件 12-2 基本原理与主要分离类型 12-3 固定相与流动相 12-3-1 液相色谱固定相 12-3-2 液相色谱流动相 12-4 影响分离的因素 12-5 离子色谱法 12-6 超临界色谱 12-6-1 超临界流体色谱的特点与原理 12-6-2 超临界流体色谱仪的结构流程 12-6-3 超临界流体色谱的应用,目 录,12-1 高效液相色谱特点与仪器 12-1-1 流程,12-1-2 特点与应用 1. 高效液相色谱法的特点,特点：高压、高效、
2、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。,2. 高效液相色谱法的应用,化合物的分离、鉴定、纯化以及定量。,溶质在液体中的扩散系数比气体中约小105倍 液体粘度比气体约大102倍 液体表面张力比气体约大104倍 液体密度比气体约大103倍 液体不可压缩,12-1-3 主要部件,(1) 高压输液泵 主要部件之一，压力：150350105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性,(2) 梯度淋洗装置,外梯度: 利用两台高压输液泵，将两
3、种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。 内梯度: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。,流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：,(3) 进样装置,(4) 高效分离柱,柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。,(5) 液相色谱检测器,a. 紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点： 灵敏度高； 线形范围高； 流通池可做的很小（1mm 10mm ，容积 8L）； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可
4、用于梯度洗脱。,b. 光电二极管阵列检测器,紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。,c. 示差折光检测器,除紫外检测器之外应用最多的检测器； 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；,通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）； 灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱； 偏转式、反射式和干涉型三种；,d. 荧光检测器,高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应； 激光诱导荧光(LIF) Laser Induced F
5、luorescence 体积小，适合毛细管柱,e. 电学和电化学检测器：,安培检测器、电导检测器、库仑检测器、介电常数检测器、极谱检测器,12-2 基本原理与主要分离类型 1. 液-固吸附色谱 liquid-solid adsorption chromatography,固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂； 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性； 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；,环境中有机氯农药残留量分析,固定相：薄壳型硅
6、胶(37 50m) 流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径) 检测器：差示折光检测器,可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。,2. 液-液分配色谱 liquid- liquid partition chromatography,固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反； 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采
7、用； 化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。 C-18柱（反相柱）。,稠环芳烃的分析,稠环芳烃多为致癌物质。,固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：20%甲醇-水 100%甲醇 线性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 温：50 C 柱 压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器,3. 离子交换色谱 ion-exchange chromatography,固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液； 基本原理：组分在固定相上发生的反复离子
8、交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长； 阳离子交换：RSO3H +M+ = RSO3 M + H + 阴离子交换：RNR4OH +X- = RNR4 X + OH- 应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。,4. 离子色谱 ion chromatography,离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一中技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。,5. 离子对色谱 ion pair chromatography,原理：将一
9、种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配； 阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子； 阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子； 反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+ X -后；在两相间分配。,固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；,原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分
10、子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。 全部在死体积前出峰； 可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离,6. 尺寸排斥色谱 size- exclusion chromatography,7. 亲和色谱 Affinity chromatograph,原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。,先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。,1. 液-固吸附分离固定相 种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；
11、结构类型：全多孔型和薄壳型；粒度：5-10m； 2. 液-液分配及离子对分离固定相 （1）全多孔型担体：由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用10m以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；,（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 30-40m的玻璃微球，表面附着一层厚度为1-2m的多孔硅胶。表面积小，柱容量底；,12-3 固定相与流动相 12-3-1 液相色谱固定相,（3）化学键合固定相,化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： SiOC b. 硅氧硅碳键型：SiOSi C 稳定，耐水、耐光、耐有机
12、溶剂，应用最广； c. 硅碳键型： SiC d. 硅氮键型： SiN,化学键合固定相的特点,（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快； （2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击； 耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定； （4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性； （5）有利于梯度洗脱；,存在着双重分离机制： (键合基团的覆盖率决定分离机理) 高覆盖率：分配为主； 低覆盖率：吸附为主；,3. 离子交换色谱分离固定相,结构类别： （1）薄壳型离子交换树脂 薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂； （2）离子交换键合固定相 薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团） 树脂类
13、别： （1） 阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性） （2） 阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）,4. 尺寸排斥分离固定相,（1）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构； 水为流动相。适用于常压排阻分离。 （2）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶； 非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂 （3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等； 化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。 可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。,5亲和色谱固定相,链霉亲和素+ 生物素- 5 - (A)10GTATCACGAGGCCCTATGCG-3,12-3-2
14、液相色谱流动相 1. 流动相特性,液相色谱流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况； 亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱； 若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。,2. 流动相类别,按组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂：己烷、CCl4、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分
15、离或调整出峰时间。,3. 流动相选择,在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小),4. 选择流动相时应注意的几个问题,（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。,（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或
16、损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。,（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。,（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。,12-4 影响分离的因素 1. 影响分离的因素与提高柱效的途径,在高效液相色谱中, 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，即： H = A + C u 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。,液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径。 由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。,液相色谱中，不可能
17、通过增加柱温来改善传质。恒温 改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。,2. 流速,流速大于0.5 cm/s时, Hu曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。,3. 固定相及分离柱 气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。,4. 液相制备色谱,获得高纯物质（色谱纯）的有效方法。 半制备柱（内径8mm，长度15 30cm），一次制备量.1mg；,色谱柱的柱容量（柱负荷） 对分析柱：不影响柱效时的最大进样量
18、； 对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量； 超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。 超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%为宜。,液相制备色谱的方法,收集组分时，通常有以下情况： （1）可获得良好分离，主峰 使用制备柱，超载提高效率； （2）两主成分之间的小组分； 超载，分离切分使待分离组分成为主成分（富集）后，再次分离制备。,以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析对象, 在七十年代出现、八十年代迅速发展。,传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题： (1)需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长； (2)洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。,12-5 离子色谱
19、法,1. 离子色谱法原理,离子交换原理，与传统离子交换的不同点： 采用交换容量非常低的特制离子交换树脂为固定相； 细颗粒柱填料，高柱效；采用高压输液泵；,低浓度淋洗液或本底电导抑制（在分离柱后，采用抑制柱来消除淋洗液的高本底电导）； 可采用电导检测器，快速分离分析微量无机离子混合物； 各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。,2. 离子色谱具有以下优点,（1）分析速度快 可在数分钟内完成一个试样的分析；,（2）分离能力高 在适宜的条件下，可使常见的各种阴离子混合物分离；例：使用双柱法，在十几分钟内，可使七种阴离子完全分离。,（3）分离混合阴离子的最有效方法 （4）耐腐蚀，仪器流路采用全塑件，
20、玻璃柱,抑制型：抑制柱型、连续抑制型 分离柱中离子交换树脂的交换容量通常在0.010.05毫摩尔/克干树脂。,非抑制型: 当进一步降低分离柱中树脂的交换容量(0.0070.07毫摩尔/克干树脂),使用低浓度、低电离度的有机弱酸及弱酸盐作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸盐等。检测器可直接与分离柱相连，不需抑制柱。,3. 离子色谱装置,离子色谱连续抑制装置图,4 离子色谱的应用,阴离子分析: 双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3250mm), 流动相：0.003molL-1 NaHCO3 / 0.0024 molL-1 Na2CO3，流量138 mL/hr。 七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离，各组
21、分含量在350 ppm。,1.概述 超临界流体：在高于临界压力与临界温度时，物质的一种状态。性质介于液体和气体之间。 超临界流体色谱(SFC)，80年代快速发展，具有液相、气相色谱不具有的优点:,（1）可处理高沸点、不挥发试样； （2）比LC有更高的柱效和分离效率。,12-6 超临界色谱 Supercritical Fluid Chromatograph 12-6-1 超临界流体色谱的特点与原理,2. 超临界流体性质,（1）性质介于液体和气体之间; 具有气体的低黏度、液体的高密度，扩散系数位于两者之间。 （2）可通过改变超临界流体的密度（程序改变）调节组分分离（类似于气相色谱的程序升温，液相色
22、谱中的梯度淋洗）。 超临界流体的密度与压力有关。,3.原理,SFC的流动相：超临界流体；CO2、N2O、NH3 SFC的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物；可使用液相色谱的柱填料。填充柱SFC和毛细管柱SFC； 分离机理：吸附与脱附。组分在两相间的分配系数不同而被分离； 通过调节流动相的压力（调节流动相的密度），调整组分保留值；,压力效应：,SFC的柱压降大（比毛细管色谱大30倍），对分离有影响（柱前端与柱尾端分配系数相差很大，产生压力效应）； 超临界流体的密度受压力在临界压力处最大，超过该点，影响小，超过临界压力20%，柱压降对分离的影响小； 压力效应：在SFC中
23、，压力变化对容量因子产生显著影响，超流体的密度随压力增加而增加，密度增加提高溶剂效率，淋洗时间缩短。 CO2流动相，当压力改变：7.09.0106 Pa，则： C16H34的保留时间 25min 5min。,程 序 升 压,HPLC与SFC 比较,1.结构流程,12-6-2 超临界流体色谱仪的结构流程,2.主要部件,（1）SFC的高压泵 无脉冲的注射泵；通过电子压力传感器和流量检测器，计算机控制流动相的密度和流量； （2）SFC的色谱柱和固定相 可以采用液相色谱柱和交联毛细管柱； SFC的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物；专用的毛细管柱SFC；,（3）流动相 SF
24、C的流动相：超临界流体；CO2、N2O、NH3。CO2应用最广泛；无色、无味、无毒、易得、对各类有机物溶解性好，在紫外光区无吸收；缺点：极性太弱；可加少量甲醇等改性； （4）检测器 可采用液相色谱检测器，也可采用气相色谱的FID检测器,1.聚苯醚低聚物的分析 色谱柱：10m 63m i.d. 毛细管柱， 固定相：键合二甲基聚硅氧烷； 流动相：CO2 ；柱温：120 C； 程序升压；,12-6-3 超临界流体色谱的应用,2.甘油三酸酯的分析,四种组分仅双键数目和位置不同，难分离； 色谱柱：DB-225 SFC毛细管柱； 流动相： CO2 ；从15MPa程序升压到27MPa；2.5hr完全分离。,
25、附 录 分子信标核酸探针的合成与纯化,分子信标是个呈发夹结构、设计十分巧妙的短链DNA分子。由于它特殊的结构，自从1996年被首次合成出来以后，它已经被非常广泛地应用于PCR定量、基因分型、基因芯片、活细胞内mRNA分析以及蛋白质（酶）研究等领域。,步骤： 采用固相合成法合成核酸探针； 利用HPLC对粗产物进行纯化； 利用基质辅助激光解析飞行时间质谱仪对产物进行表证； 对产物进行杂交实验来验证其性能。,采用固相合成法合成核酸探针,POLYGEN 10 column DNA合成仪,利用HPLC对粗产物进行纯化,Equilibration,Sample application,Elution,Re
26、generation,KTA purifier高效液相色谱仪,色 谱 图,保留时间为26.13min处的第一个峰，推测其为FAM-oligo DNA，保留时间为33.07min处的第二个峰，推测其为目标产物。,谱图解析出的分子量为11014.17Da，严格计算出的分子量11018.896 Da，相差4.726 Da。分子量为5521.679 Da的是双质子产物，为目标产物。分子量为10882.048 Da的是在质谱过程中损失掉一个A碱基的目标产物。,质 谱 图（ultraflex MALDI-TOF/TOF）,HITACHI Fluorescence Spectrophotometer F-2
27、500,Features Capable of delivering sensitivity two times higher than the conventional model. (S/N ratio: 450 or better) Equipped with a multi-step slit of 2.5 to 20 nm, making it applicable to a variety of samples. Incorporates flexible software features such as versatile quantitative analysis function, data export function for Excel, print preview function, etc. Easy to control with a mouse in an icon-based operating environment.,分 子 信 标 的 特 性,