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1、,High Performance Liquid Chromatography （HPLC）,高效液相色谱技术与应用,主要内容,酸性和碱性样品 酸碱平衡与反相保留 缓冲液的选择 pKa与化合物结构的关系 离子样品反相分离的优化 选择性的控制 离子对色谱 保留机制 初始实验 控制保留值范围和选择性 离子交换色谱 离子交换色谱 保留机制 方法建立 硅胶柱,酸性样品和碱性样品,为方便讨论，我们定义“离子溶质”为在通常pH范围内含有一个或一个以上酸性或碱性官能团的有机分子。 在HPLC分离条件下，离子电荷随pH发生变化的化合物简单地称作酸或碱。 在反相色谱（RPC）中， 疏水化合物样品的保留值较大。当
2、某种酸（HA）或碱（B）发生解离，其疏水性将会大大减弱。因此在RPC中的保留值k可能下降1020倍。,几乎所有与pH相关的保留值变化均发生于pKa值1.5单位的pH值范围内,缓冲液的选择,最好先调节缓冲剂的pH，再加入有机溶剂。 选择具体缓冲剂时，应切记的几种因素： 缓冲容量 UV吸收度 其它性质：溶解度、稳定性、与样品和/或色谱柱的相互作用、挥发性、对HPLC系统的腐蚀等,缓冲容量,缓冲容量由pH、缓冲剂pKa及其浓度决定 与样品化合物的情况类似，缓冲剂发生解离的pH范围为pKa1.5。只有在此pH范围内缓冲剂才能有效地控制pH值。 1050mM浓度的缓冲剂对RPC分离一般足够,pKa与化合
3、物结构的关系,若不知样品组分的pKa值，可以通过样品的分子结构估计出。,较好的流动相pH,样品中最常见的酸或碱取代基-NH2、-N(CH3)2等、碱性杂环和羧酸（-COOH）基团。 与pH有关的保留值变化最可能发生于pH36的范围内，不包括烷基胺化合物。 无论已知还是未知样品，开始RPC方法建立时最好选用pH微小改变不影响分离的流动相（pH3）,哪种HPLC法对离子样品最合适,RPC具有简单、应用范围广和较好的柱性能等特点，通常是首先的分离模式。 若分离不够理想，还可考虑在流动相中加入离子对试剂。 在离子对试剂浓度由零变至最大值时，会有RPCIPC保留值的连续变化。所以起初的RPC实验有助于后
4、面IPC分离条件的优化选择。 对特殊分离目的，可以考虑从离子对或离子交换色谱开始。,优化离子样品的相分离,离子样品反相分离的方法建立与中性样品有些相似，主要差异为需用： 经pH缓冲的流动相 硅羟基效应最小的反相柱 当首次开始HPLC方法建立时，并不知道合适的分离是否需要改变pH，所以初始实验的流动相pH3最好。 下一步通过调节流动相强度（%B），以使样品具有合适的保留值范围0.5k20。 离子样品不大可能被强保留，很可能获得较宽的k值范围。因此方法建立的最佳方案是初始运行用梯度洗脱。 梯度选用宽范围（如5%100%B），必须注意避免高%B时析出缓冲盐 调整峰间距，即尽量扩大样品的分离度或降价保
5、留值范围，以便进行等度分离。 最后改变柱条件以最好地兼顾分离度、运行时间和柱压,选择性的控制,改变pH是改变分离选择性的最有效方式 pH值变化常常可导致离子化合物k值发生10倍或更大的变化。 其它可有效改变峰间距的条件是%B、溶剂类型（甲醇、乙腈、THF）、温度、柱类型（C8、C18、苯基、氰基）与缓冲剂浓度。,离子对色谱,离子对和反相HPLC共享有多种特征 两种分离使用的色谱柱和流动相大致相似，主要区别是离子对色谱（IPC）的流动相中加入了离子对试剂。 逻辑上，IPC是需进一步改善的RPC分离的一种补充方法,保留的基础,离子对试剂的浓度 通过改变被固定相吸收的离子对试剂的多少，有可能将保留过
6、程由反相连续地改变为离子交换色谱,当色谱柱吸收的离子对试剂量增大，离子交换保留机制为主，而反相保留机制为次要,初始实验,特殊离子对试剂的选择(强疏水性或弱疏水性)依赖于流动相强度%B,特殊问题,人工峰 尽可能相近地匹配样品溶剂和流动相的组成，增大进样浓度、减小进样体积 缓慢的色谱柱平衡 阴离子试剂（如磺酸盐）用50-80%的甲醇水作清洗剂易于除去。季铵试剂需用50%的甲醇缓冲剂进行清洗。在用新流动相检查保留值重现性之前，应至少用20倍体积的清洗溶剂进行清洗。 较差的峰形 硅羟基 温度,离子交换色谱,离子交换色谱（IEC）可用于包括生物来源的混合物（氨基酸、低聚核苷酸、肽、蛋白质、核酸）、无机盐
7、和一些金属有机化合物 因为IEC与离子对HPLC保留机制的相似性，许多可用IEC的分离也用IPC也可解决。 用IEC原因： 检测限 制备分离 多步分离,保留的基础,对于带电荷z的样品离子和一价的反离子，反离子浓度对其保留值的影响可总结为：,与固定相共价相连的荷电基团决定用于离子交换的色谱柱的特性：阴离子交换柱带正电荷，阳离子柱带负电荷。阳离子柱用于阳离子的分离，如质子化碱；阴离子柱用于阴离子的或酸性样品的分离,固定相用R（阳离子交换剂）或R（阴离子交换剂）表示，样品用X（阳离子）或X（阴离子）表示，IEC的保留过程：,pH影响,IEC一般用于酸性或碱性样品。 阴离子交换色谱分离酸时，pH增大导
8、致样品解离增多，保留值增大，而降低pH在阳离子交换HPLC中有利于碱的保留。（与RPC保留相反） 改变pH通常是改变选择性的良好办法,盐或缓冲剂类型,阴离子交换色谱中，不同置换剂的相对强度顺序为：,阳离子交换色谱中转换剂强度顺序为：,有机溶剂,与RPC相同，流动相中加入有机溶剂会导致保留值下降,色谱柱类型,离子交换柱可分为4种：弱、强阳离子交换剂（WCX、SCX）与弱、强阴离子交换剂（WAX、SAX） 强离子交换剂带有的离子基团在通常pH范围（2pH12）解离不改变。弱离子交换剂在一定的pH范围将失去电荷及样品的保留能力。 离子交换色谱大多数的应用使用强离子交换剂,方法的建立,通常很少使用离子交换色谱同时分离样品阴离子和阳离子 对于酸性或阴离子化合物，用强阴离子交换柱。 对于碱性或阳离子化合物，用强阳离子交换柱 pH6用于阴离子交换，pH6用于阳离子交换 若已知样品的pKa值，阴离子交换时，要求pHpKa，而对于阳离子交换，则要求pHpKa 缓冲剂浓度应比较低，如25mM，以避免与样品离子竞争保留 选择B溶剂 通过以下几种手段改善分离 增加温度 加入甲醇 在能降低柱上电荷的pH下，用弱离子交换剂,硅胶柱,“原”硅胶色谱柱用于IEC分离强碱性化合物（pKa8）。流动相为90%甲醇/（硝酸铵缓冲液pH910），通过改变离子强度或pH来调节保留值。,