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1、植 物 细 胞 工 程,第一章 绪 论,植物细胞工程流程,第一节 植物细胞工程的有关概念 植物细胞工程是一种利用离体培养细胞进行遗传操作，实现植物品种改良的生物技术。细胞工程和基因工程是现代植物生物技术两个不可分割的组成部分。虽然基因工程也采用一些细胞工程的技术，但是细胞工程本身是一种独立的、自成体系的生物技术。,高等植物是多细胞的有机体，无法在整体水平上进行遗传操作，只有通过离体培养使植物细胞或小块的组织在离体培养条件下生长、发育和分化，再生完整植株，才可能使细胞水平上的遗传操作传递到植物体，实现植物的品种改良或种苗的快速繁殖。因此，植物细胞工程是建立在植物离体组织培养基础上的一种生物工程技

2、术。,嵌合体： 遗传学上用以指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体。免疫学上的涵义则指一个机体身上有两种或两种以上染色体组成不同的细胞系同时存在,彼此能够耐受,不产生排斥反应,相互间处在嵌合状态。,已经失去了分裂能力，处于分化成熟和分裂静止状态的细胞置于特定的培养基上时，首先发生的变化是回复到分生性状态，(包括细胞器的破坏与重建)，同时细胞内酶的种类与活性发生改变，蛋白质合成和细胞代谢过程也发生改变，最后引起基因表达的改变，细胞的性质和状态发生了扭转。由失去分裂能力的细胞回复到分生性状态并进行分裂，形成无分化的细胞团（愈伤组织）的过程称为“脱分化”。,经过脱分化的细胞如果条件合适，就可以长久保持旺

3、盛的分裂状态而不发生分化。由无分化的愈伤组织细胞再转变成为具有一定结构，执行一定生理功能的细胞团和组织，构成一个完整的植物体或植物器官的现象（或过程），叫做“再分化”。一个已分化细胞要表达出其全能性，就要经过脱分化和再分化的过程，这就是植物细胞和培养组织所要达到的目的。,植物激素在调节“细胞脱分化”和“再分化”中起到主要作用。植物对激素的反应十分敏感，培养基中生长素类和细胞分裂素类的种类、相对比例和浓度都能直接影响到细胞脱分化和再分化的过程，组培中常常是通过调节激素的种类、浓度和相对比例来达到调节脱分化和再分化的目的。,细胞经过脱分化和再分化再生出新的植物体过程中，可经过两条途径: 1、由愈伤

4、组织的部分细胞先分化产生芽（或根），再在另一种培养基上产生根（或芽），形成一个完整的植株-器官发生途径； 2、在愈伤组织中产生出一些与胚相似的结构（两极性结构），然后发育成带根苗，-体细胞胚胎发生或无性胚胎发生途径。,在离体培养条件下，植物再生是经过器官发生途径还是经过体细胞胚胎发生途径，随植物不同而不同，也随培养基的不同而变化，有时甚至同一种植物在同一条件下，既存在体细胞胚胎发生途径，也存在器官发生发生途径，这都是自然现象，是正常的，只是两种发育途径的频率随着基因型不同和培养条件的改变而差异显著。,第二节 植物细胞工程的特点 一、培养材料经济 由于植物细胞具有全能性，通过植物细胞工程技术能使

5、植物体的单个细胞、小块组织、茎段等离体材料经培养获得再生植株。这不但在生物学研究上保证了材料来源单一和遗传背景一致，有利于试验成功，而且在生产实践中，以茎尖、根、茎、叶、子叶、下胚轴、花芽、花瓣等材料进行培养时，只需要几毫米甚至不到1mm大小的材料，做到了材料经济使用。,二、培养条件可以人为控制 植物细胞工程技术含量高，所采用的植物材料完全是在人为提供的培养基和小气候环境条件下进行生长，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行组培苗的周年生产。,三、生长周期短，繁殖率高 植物细胞工程由于人为控制培养条件，而且根据培养对象的不同要求而提

6、供适宜的培养条件，因而生长快，往往个月左右为1个周期，大大缩短了生长周期。虽然植物组织培养需一定设备及能源消耗，但由于植物材料能按几何级数繁殖生产，故繁殖率高，且能及时提供规格一致的优质种苗和无病毒种苗。,四、管理方便，利于工厂化生产和自动化控制 植物细胞工程是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件，极利于高度集约化的工厂化生产，也利于生产与管理的自动化控制，具有现代农业的典型特点。它与盆栽、田间栽培等相比，省去了中耕除草、浇水施肥、防治病虫等一系列繁杂劳动，客观上省地、省力、省工，便于管理。,第三节 植物细胞工程的发展历史 植物细胞工程科学的发展与细胞的发现和

7、随后提出的细胞学说有不可分割的历史渊源。 1、1665年英国Robert Hooke第一个发现细胞。 2、19世纪上半叶德国动物学家Schwann提出了有关细胞理论。植物学家Schleiden对此作出了最后的结论，提出细胞学说，它包括两个基本方面：细胞是生物有机体的基本单位；细胞（特别是植物细胞）又是生理上、发育上具有潜在全能性的功能单位。,3、Trecul(1853)观察到许多树被剥皮后形成愈伤组织。通过愈伤组织切片分析表明，除形成层外，髓射线、韧皮部和最幼嫩的木质部成分也可以作为组织培养的材料。 4、Yachting(1878)观察到一种有趣的称为“极性”的现象，这是一种与植物组织发育有关

8、的特征。在对插条的经典实验中，Yachting注意到茎上部总是产生芽，而茎基部产生愈伤组织或根。,5、1902年德国著名植物学家Haberlandt根据细胞学说，提出了高等植物的器官和组织可以不断分割直至单个细胞的观点，这种单个细胞是具有潜在全能性的单位。虽然他的实验在当时未获得成功，但提出了诱导培养细胞分裂的必要条件 。 6、1904年，Hanning最先在含有无机盐及含有有机成分的培养基上成功的培养出了萝卜和辣椒的胚，发现离体的胚可以在培养基上充分发育，并有提早发育成苗的现象。,7、 1922年，Knudson采用胚培养获得了大量的兰花幼苗，克服了兰花种子发育的困难。同年，Robbins培

9、养了长度为1.453.75cm的豌豆等作物的茎尖，结果形成了一批绿的叶和根。 8、1925年Laibach通过培养亚麻种间杂交的幼胚，成功的获得了杂种幼苗。,9、1933年，我国李继侗等曾在银杏离体培养时，发现了3mm以上大小的胚在培养基上即可正常生长，其胚乳提取物促进银杏离体胚的生长。这一发现对以后人们使用植物胚乳汁液、幼嫩种子及果实提取液等天然生长物质促进培养物的生长有着启蒙作用。,10、1934年，美国植物生理学家White通过对番茄根尖的组织培养，建立了第一个有活跃生长的无性繁殖系，并能进行继代培养。利用根系培养物，研究了光照、温度、pH值和培养基组成对根生成的影响。到这时，有关离体根

10、的培养实验才获得了真正的成功。,11、1937年，法国的Gautheret、Nobecourt培养块根和树木形成层使其生长。White、autheret和Nobecourt确立的植物组织培养的基本方法，成为以后各种植物组织培养的技术基础。 12、1941年，Overbeek等在基本培养基上附加椰乳（CM），使曼陀罗（Datura stramonium）的心形时期幼胚能够离体培养至成熟。 13、1942年，Lammerts进行了杏、油桃和桃的杂种胚培养，提高了杂种的萌发率。,14、1943年，White提出了植物细胞“全能性”学说并出版了植物组织培养手册，使植物组织培养成为一门新兴学科。 15、

11、1944年，Morel进行了葡萄茎尖组织培养的尝试，获得了愈伤组织和根。,16、1948年，Skoog和崔徵发现腺嘌呤或腺苷可以解除生长素（IAA）对芽形成的抑制作用，从而诱导烟草的茎段形成芽，确立了腺嘌呤与生长素的比例是控制芽和根分化的主要条件之一，建立了器官形成的概念，导致以后激动素（KT）的发现及利用激动素和生长素的配比关系控制植物器官分化工作的开展。,17、1955年，Skoog及其同事在鲱鱼精子的提取物中发现了激动素，它对促进芽的形成活性比腺嘌呤高出了约3万倍。 18、1957年，Skoog和Miller发现了生长素和激动素之间的不同比例的配合对生长和分化的作用，即激动素/生长素之比

12、高时易形成芽，比例低时则形成根。,19、1958年， 美国植物学家Stewar等用胡萝卜韧皮部细胞进行培养， 终于获得了完整植株， 并且该植株能够开花结实。这首次证实了Haberlandt在50多年前关于细胞全能性的预言。,20、1965年VasiL等分别成功地进行了烟草单细胞的离体培养和植株再生，以及Takebe等（1971年）首次利用原生质体培养获得了再生植株。以上事实一次又一次地证实了植物细胞的全能性，同时也为组织培养工作应用于作物改良开辟了广阔地前景。Cuha等（1964年）利用曼佗罗花药培养首次获得了单倍体植株，由此证明性细胞也具有全能性。之后，人们先后在烟草、水稻、小麦和玉米等重要

13、作物上取得成功。花药和花粉培养地成功，导致了一个植物育种学的分支单倍体育种的诞生。,我国植物快速繁殖和无病毒种苗生产的研究始于20世纪70年代。目前， 马铃薯无毒种薯和甘蔗无毒种苗已在生产上大面积种植， 兰花、香石竹、月季、菊花、唐菖蒲、百合、重瓣玉簪、橡皮树、草莓、茶花、桉树、杨树、苹果、柑桔、枣树、醋栗、葡萄、木薯、香蕉、巴戟天、大蒜、金线莲、枸杞、半夏、红花、银杏等已进行规模化生产或中间试验。,利用组织培养技术进行植物快速繁殖及无毒种苗生产， 不仅能够获得显著的经济效益， 同时能够挽救珍稀濒危物种和帮助解决药用植物野生资源短缺问题。花药培养方面， 我国从1970 年开始， 至今已利用花粉

14、或花药培育出40多种植物的单倍体植株， 其中小麦、黑麦、小冰麦、玉米、橡胶树、杨树、辣椒、甜菜、白菜、油菜、柑桔、甘蔗、大豆和苹果等单倍体植株为我国首创。,培养结球甘蓝和大白菜的杂种胚， 获得了种间杂种。西北植物研究所得到了节节草和普通小麦的属间杂种。大麦+小麦、大麦+提莫菲维小麦、小麦+冰草等也都通过胚培养获得了杂种。同时， 烟草属间杂种、水稻品种间杂种也都已经得到。中国科学院植物研究所和北京市农林科学院合作， 通过胚胎培养育成的早熟桃新品种“ 京早3 号”， 成熟期比一般早熟桃提前1520d。此外， 龙眼、荔枝的焦核胚胎培养研究， 为果树选育优良焦核品种开辟了新途径。,原生质体培养方面，

15、20世纪80年代以来原生质体培养及融合的研究发展迅速。利用酶可从各种组织中将细胞分离并去除细胞壁获得原生质体，并在技术上发展到可使不同种植物的原生质体相互融合形成融合细胞，进而培育成新的杂种植物。,另外，组织培养技术在药用植物培养、突变体选育及种质资源保存等方面也有了新的进展。有研究表明， 全世界有75%的人口以植物作为治疗、预防疾病的药物来源。仅20世纪90年代以来， 植物药用有效成分的国际专利就达50多项， 其中大多为抗病毒、抗癌化合物。,如从长春花中提取的抗癌生物碱长春新碱， 用于治疗白血病时， 售价高达6000美元/g。例如， 白芷悬浮培养中生成的次生代谢物imperatorin是治疗

16、头痛的主要药效成分；从薯芋愈伤组织和悬浮细胞产生的diosgennin用于合成甾体药物；紫杉醇红豆杉细胞培养物为最新抗癌药物，目前，已达到商业化生产水平。,通过离体培养筛选植物突变体是生物技术研究中一个较新的领域。筛选植物的有益突变体对提高作物抗逆性和改良作物品质有重要作用；并能为植物遗传工程研究提供各种带有遗传标记的受体突变体细胞; 同时对于研究植物体内一些生理生化机理亦有重要意义。,人工种子研究方面， 我国人工种子的研究始于“七五”期间， 并于1987年被列入了“ 863 高技术研究发展计划”。采用液氮超低温保存技术能保持很高的存活率， 并且能再生出新植株和保持原来的遗传特性。如用其建立茎

17、尖分生组织培养物的超低温保存种质库时， 不仅可防止种质的遗传变异和退化， 而且可长期保存无病毒的原种。,20世纪80年代以后，植物基因工程迅猛发展，目的基因的分离与克隆、转化手段的创新、检测方法的改进以及转基因的表达与遗传稳定性的研究等各方面都有许多新的突破。，并在棉花、大豆、玉米、小麦、大麦和烟草等植物中成功获得转基因植株，尤其是使转基因作物抗虫棉、玉米和抗除草剂大豆等在生产上得到成功应用。,第四节 植物细胞工程发展趋势 一、研究比例稳定增长 近年来植物组织培养技术发展十分迅速，其发展的水平和程度最突出地表现在相关研究的数量。在中国期刊网， 胡选萍（2008）采用“组织培养”作为篇名精确搜索

18、，结果发现在所有组织培养的相关研究中植物的组织培养占有绝对优势(91.95%)。,二、研究领域大幅扩展 随着植物组织培养技术在国内的兴起和发展，该技术的应用和研究迅速渗入到相关的部门和领域。胡选萍（2008）通过对国内已发表权威核心期刊论文系统搜索，并将其根据所属领域进行系统划分。结果发现，目前植物组织培养的应用和研究主要涉及到花卉、药用植物、农林蔬菜和理论研究4个方面。,三、研究种类的丰富度增加 在我国，20世纪50、60年代植物组织培养技术在我国基本上还属于新兴产业。罗士韦等以银色橡胶菊和人参作为研究对象进行初步的尝试和探索。到70年代，虽然植物组织培养在国内逐步启动和发展，但是所涉及的植

19、物种类仍然较少，研究的物种丰富度相对较低。80、90 年代所涉及的植物种类就有300多种。,四、研究技术的结合度增强 在早期阶段(20 世纪5070 年代)，植物组织培养还基本上处于孤立的探索阶段。 70 年代，逐渐出现植物组织培养与细胞学、遗传学逐步结合的例子。,80年代，植物组织培养技术与其他学科技术的结合已经相对比较普遍，具体表现在同位素示踪技术、计算机咨询系统、扫描电镜技术、液氮保存技术、生物化学技术等手段在植物组织培养领域中的应用，尤其是与各种生物化学技术手段(如同功酶、等电点聚焦电泳、放射免疫测定等）在植物组织培养中得到了普遍应用。,90年代，植物组织培养技术已经与各种新的研究技术

20、手段广泛结合，具体表现为同电镜技术、高压液相色谱、激光诱变技术、辐射诱变技术、生化同工酶谱技术、染色体显微技术、超低温保存技术等的交叉融合，其中以各种生化技术特别是色谱技术的密切结合为主要表现形式。90 年代末，植物组织培养技术已经开始表现出与遗传转化手段相融合的基本态势。,21 世纪，虽然植物组织培养技术与其他学科技术结合的总案例数目变化不大，但是所结合的技术类型发生了巨大的变化。具体内容有全息技术、生物反应器技术、辐射诱变技术、遗传转化技术、基因工程手段、分子标记技术、高效液相色谱技术、太空诱变技术、分子标记辅助选择育种技术等。 由此可见，21世纪最明显、最突出的特点是植物组织培养技术与分

21、子手段密切结合并快速发展。,五、研究的定量化程度加深 定性与定量研究历来是科学研究的2种基本定位方向。 20世纪5070年代，植物组织培养技术刚刚起步，所以定量试验技术基本还没有涉足该领域。 80 年代开始，定量技术初步应用于植物组织培养的研究之中，并快速成为研究的一个重要方面。研究的数量不但迅速增加，而且研究的水平不断提升。,六、研究向两极化发展 随着生物科学逐步朝着宏观和微观两极发展，植物组织培养技术作为生物科学中不可缺少的一员，其发展方向也表现出两极化的趋势。20世纪50、60年代，植物组织培养技术刚刚起步，主要定位点在相对比较粗放、宏观角度，探索组织培养的基本机理，发展和完善基本理论。

22、70年代已有学者尝试从细胞水平上研究植物组织培养。,80年代，植物组织培养的研究内容不再局限于选择和寻找合适的培养条件，以诱导外植体表现出全能性，最终形成完整植株，而是逐步从生理、生化水平研究植物组织培养的机理，其中以植物组培过程中特殊次生代谢产物、过氧化酶等类似同功酶研究相对较多。,进入90年代，微观研究以生理生化水平为主并逐步向分子水平过渡。21世纪，虽然细胞、生理、生化水平的研究依然存在，但是植物组织培养在微观方面已经显示出新的特点，即植物组织培养技术与各种分子技术的密切结合，并从分子水平去探索植物组织培养的机理。,第五节 植物细胞工程的应用 通过植物生物技术改良作物是20世纪70年代以

23、后农业科学中最重要的发展之一，对了解、操作、修饰和保护农作物种质具有潜在价值。20世纪70年代以后，随着生物技术和分子生物学的发展，植物生物技术备受重视，并开始应用于作物品种改良。,一、快速繁殖 目前林木组织培养应用最多、最广泛和最有效的一个方面。采用植物组织培养方法可以使试管苗具有很快的繁殖速度。由于试管苗所具有的生产性能及主要的经济指标与采用其它无性繁殖方法所繁殖幼苗差异不大，且该技术具有不受季节和气候的限制，周年均可进行，要求空间较小，节省劳力。,二、幼穗、幼胚、胚珠和子房以及试管受精克服远缘杂交不育性与扩大遗传变异范围在许多作物远缘杂交育种中都得到广泛应用 幼胚培养作为解决种间、属间等

24、远缘杂交中杂种胚停止发育的手段已在许多作物的远缘杂交育种中广为应用。离体幼胚培养可用于杂种育种。早在20世纪20年代，Laibach（1925）通过培养亚麻种间杂交时形成的幼胚成功地获得了杂种，从而开创了植物胚胎培养的应用。,三、花药、花粉培养育成单倍体植株 利用花药、花粉培养育培育成功的植物很多，如小麦、大麦、水稻、橡胶等。利用花药、花粉培养（简称花培）育成的单倍体植株，经过染色体加倍，可在短期内育成遗传变异稳定的株系，有利于缩短育种年限。,四、远缘杂交 原生质体融合产生体细胞杂种，在烟草属植株物种间细胞融合获得成功。通常在受精时可以看到细胞融合，雌雄配子体融合而形成合子，但在远缘植物及无亲

25、缘关系的植物间，甚至动植物间，这种生殖细胞的融合困难很大，甚至完全不可能，然而通过体细胞进行融合就可能实现。烟草属植物种间细胞融合已获成功。,五、组织培养用于无病毒植物体的培育脱毒 长期以来，人们已意识到病毒对农作物造成的严重危害，并探讨了各种解决办法，但收效甚微。随着植物组织培养技术的不断发展和完善，人们已将这一技术应用到植物脱病毒的生产实践中，并取得了十分理想的效果。目前，通过植物组织培养过程生产的果树、蔬菜、花卉等脱病毒苗，已在国内外的农业生产上得到普遍应用。,六、植物次生代谢产物生产 利用组织或细胞大规模培养生产人类所需要的有机化合物，如蛋白质、脂肪、糖类、药物、香料、生物碱及其他活性

26、化合物已成为可能。目前，已有20多种植物组织培养物，其中的有效物质高于原植物。,七、在基因转化方面的应用 基因转化是有目的地将外源基因或DNA导入植物细胞内，使之整合、表达并遗传。植物组织培养是外源基因导入植物细胞的关键技术，通过组织培养技术可以建立一个良好的植物转化系统，目前通常使用的再生系统有愈伤组织再生系统、直接分化再生系统、原生质体再生系统、胚状体再生系统和生殖细胞受体系统等，根据不同的植物材料选择不同的再生系统。,八、体细胞无性系变异在作物品种改良中的应用 无论是植物愈伤组织培养还是细胞培养，培养细胞内的遗传物质均处在不稳定状态，容易受培养条件的影响而产生体细胞无性系变异，从中可以筛

27、选出有利用价值的突变体，进一步选择育成新品系或品种，达到作物品种遗传改良的目的。,九、培养细胞突变体 变异是生物界的普遍现象，在植物组织培养过程中，由于培养过程本身或通过结合物理、化学诱变技术，培养的愈伤组织、悬浮培养细胞和原生质体可以产生很多的遗传变异。组织培养过程中离体组织和细胞在一定的诱导条件下，可产生远高于自然突变的体细胞突变频率，为林木的遗传改良提供了重要的选择来源。,十、种质资源保存 世界自然保护联盟（IUCN）在1978年出版德植物红皮书一书中指出：在全世界分布的约25万种维管束植物中，估计约有2万2.5万种（占整个区系成分的10%）处于很稀少或受严重威胁的状况。因此面对世界种质资源日益枯竭，大量有用基因损失的现状，植物种质保存已引起科学家和各国政府极大重视。,十一、培育人工种子 人工种子模拟了天然种子的基本构造，将植物离体培养中产生的体细胞胚或能发育成完整植株的分生组织（芽、愈伤组织、胚状体等）包埋在含有营养物质和具有保护功能的外壳内，形成在适宜条件下能够能够像天然种子一样正常生长发芽出苗的颗粒体。因此，可用于那些难以制种的优良杂交种的种子繁育和固定杂种优势。,