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1、第八章 原生质体培养和融合,第一节 原生质体分离与纯化 原生质体是指除去全部的细胞壁后，细胞膜所包围的裸露细胞。 植物体细胞杂交是指通过原生质体融合和异核体的培养产生体细胞杂种的技术，它能使两亲本不通过有性过程进行遗传物质的重组，包括核基因和胞质基因的重组。,原生质体-指被去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活活力力的裸露植物细胞。,一、原生质体的分离 1. 供体材料 一般来说，可供分离原生质体的材料是非常广泛的，不同的植物有不同的选择，植物体的组织与器官如根、茎、叶、花、果实、种子等均可作为原生质体的供体材料。 用于植物原生质体主要来源于各种植物的叶片、愈伤组织及悬浮培养细胞。,*以叶片用以分离原
2、生质体材料: 1、是未经愈伤组织阶段，材料的遗传背景相对一致。 2、是易于制备，且时间短。 3、是若将叶片原生质体用作体细胞杂交的亲本，由于叶片中明显的叶绿体，可方便地鉴别出异核融合体。,*禾本科和豆科等，很难从叶肉细胞中分离到原生质体，以无菌悬浮细胞和愈伤组织为供体材料： 1、取材方便，培养细胞处于无菌状态，免去了在材料消毒过程中所造成的损伤及污染。 2、细胞处于旺盛的分生组织状态，有利于原生质体再生。 3、培养细胞对酶的耐受性较好。,以愈伤组织制备原生质体,以叶片制备原生质体,2. 原生质体解离 原生质体分离方法有两种， 即机械分离法和酶分离法。我国植物原生质体培养中一般采用酶分离法，材料
3、和酶液的重量比一般为1: 10。对于酶分离法，酶和稳压剂是分离原生质体的关键成分。植物的细胞壁的基本成分是纤维素、半纤维素和果胶质，为使细胞壁降解必须使用能水解纤维素、半纤维素和果胶质的酶制剂。,使用的酶主要有： 纤维素酶(Cellulase)、 果胶酶(Pectolyase)、 离析酶(Macerozyme )、 半纤维素酶(Hemicellulase) 崩溃酶(Driselase)， 其中纤维素酶和果胶酶是最必要的。,酶液中的渗透压是原生体分离的另一个因素，植物细胞去壁后，必须由合适的渗透压替代细胞壁维持的机械压力，酶液中的渗透压过低会使细胞吸涨而破裂；渗透压过高，细胞除受到渗透压力而破裂
4、外，还会损害细胞生长代谢 。,渗透压稳压剂基本上都是甘露醇，但也有采用山梨醇的。 酶液中还应适量地加入其它一些辅助成分：如pH值稳定剂、葡聚糖硫酸钾、CaCl2、KH2PO4等。葡聚糖硫酸钾。 CaCl2和KH2PO4有利于原生质体的稳定， CaCl2还兼具保护质膜的作用。除稳定酶解液pH值外，PVP还能吸附酚类物质， 抑制原生质体的老化褐变。分离出的原生质体用于培养之前， 还需纯化。,二、原生质体纯化方法 供体组织经酶解处理后得到原生质体、破碎细胞、未完全去壁细胞、多细胞团以及组织残体等组成的混合物，因此需要纯化。纯化的方法主要有漂浮法、沉降法及界面法。,*漂浮法：根据原生质体与细胞碎片的比
5、重不同，采用比原生质体相对密度大的溶液如高浓度糖或糖醇，经离心使原生质体悬浮于溶液表面，碎片、叶绿体、维管组织及具壁细胞沉降到管底，原生质体因而得以纯化。,*沉降法：利用密度不同沉降速率不同的原理，低速离心使原生质体沉于离心管底。此法方便，但不易除尽一些完整的细胞或破碎的原生质体。 *界面法利用原生质体和破碎细胞比重不同，低速离心条件下完整的原生质体漂浮于密度不同的两相分界处，碎片留在低层相中，可从两相界面收集到高纯度原生质体。,原生质体纯化(以柑桔原生质体为例，界面法),原生质体制备流程（以叶片为例）,果胶酶和 纤维素酶,原生质体分离纯化流程图,第二节 原生质体的培养 一、原生质体培养的方法
6、 1. 液体培养 培养基中不加凝固剂，仅仅用液体培养基按所需植板密度重悬原生质体后，直接植板在培养皿中即可。 液体浅层培养法是目前原生质体培养中广泛应用的方法之一。 优点：操作简便，对原生质体伤害小，有利于通气。 缺点：容易使原生质体互相粘连、聚集，导致原生质体损坏；并且难于定点观察监测单个原生质体的发育过程。,液体微滴培养 将悬浮密度为104105/ml的原生质体培养液用滴管以0.1ml左右的小滴一滴一滴接种在培养皿上,如果将培养皿翻转,则为悬滴培养。 优点:如果其中的一滴或几滴的污染,不会殃及整个实验室。 缺点:原生质体分布不均匀;液体易挥发(导致浓度变化)。,2. 固体培养法 （1） 看
7、护培养法（饲养层培养） 将原生质体与一些被X射线照射而失去分裂能力的原生质体相混合并包埋在琼脂培养基中，或者把经X 射线处理过的原生质体用一薄层琼脂培养基固定在下层，而活的原生质体在上层。这一方法能允许原生质体密度低于能正常生长的密度，因为它们可以从被处理过的原生质体那里获得一些有益的物质。,饲养层培养,X-射线杀死原生质体，与生活力正常的原生质体混合，加入0.6%琼脂，制成混合液，培养于培养皿中。,X-射线杀死原生质体，与0.6%琼脂混合，在培养皿中铺成平板，作为饲养层，再将生活力正常的原生质体与0.6%琼脂混合，培养于饲养层上。,（2） 琼脂糖包埋培养法 琼脂糖包埋培养时，一般将原生质体悬
8、浮于2原生质体培养基中，取等体积的原生质体混合液加入灭过菌的20.5%的低熔点的琼脂糖中(37)，混匀后植板。琼脂糖包埋培养的有利之处还在于对培养的原生质体可进行定点定位观察，追踪其发育过程，也便于基因操作。,固体包埋培养:原生质体纯化后，离心，用培养基稀释至一定密度，再与0.6%琼脂或低溶点琼脂糖（37C左右）混合，培养于培养皿中; 优点-可以在倒置显微镜下定点观察细胞分裂情况; 缺点-固体表面的原生质体才能分裂,内部的因通气不良而不分裂;,3. 固-液结合培养 在培养皿底部先铺一层含琼脂(或0.8%的琼脂糖) 的固体培养基，将适当密度的原生质体悬浮液加在含琼脂的培养基上。液层较浅，有利于通
9、气，而且固体培养基中的养分可以释放到液层中去，以补充培养物对养分的消耗。另外培养物中的代谢产物对原生质体的生长不利，可以为固体层所吸收，降低或消除毒害。,固-液培养：培养皿底部铺一层固体培养基，在其上进行原生质体浅层培养。固体培养基中的成分可以向液体培养中释放，培养物产生的有害物质，也可被固体部分吸收,二、原生质体培养培养基组成 原生质体培养基种类很多，通常多是由细胞培养基改良而来，培养基中需要氮、磷、钾、钙、镁、硫、铁等大量元素，以及锰、锌、铜、钴、钼等微量元素，同时还需要糖类物质作为碳源以及维生素和有机物质。为了补充内源激素的不足，促进原生质体分裂和生长，还需要添加适当种类和浓度的激素。,
10、三、原生质体培养条件 1 湿度保持是关键因子:培养基用量少,水分易挥发,导致物质浓度和渗透压变化; 2 温度和光照:温度一般保持25度左右。以暗淡散射光或黑暗条件培养; 3 培养密度:密度过高,分裂受到抑制,并逐步破碎解体;密度太低,不利于快速得到愈伤组织。一般密度为104105个/ml。 4 培养一段时间后,要求添加新的培养基,并逐步用较低渗透压的培养基替代,以适应新细胞团或愈伤组织生长。,四、影响植物原生质体分裂生长的各种因素 1植物供体材料 在决定是否从培养的原生质体中能最终获得再生植株方面，供体材料的基因型是一个重要的因素。在同一个种，甚至相同的栽培品种，常常有不同的反应。,2激素水平
11、 在原生质体的分裂分化中植物激素的作用是一个非常重要的方面，同时激素也是一个变化多样的主要成分。 不同的物种对外源激素的种类和浓度的需求是不同的。通常认为在原生质体的前期培养中，需生长素来诱导分裂，生长素与壁的形成、促进细胞分裂密切相关。 而后期的分裂分化中，则是细胞分裂素起主导的作用。,3继代培养时间 愈伤组织的长期继代培养，会使植物细胞产生一些生理代谢和遗传因素的变化，长期的继代培养也使得蛋白质降解而引起组织衰老，最后发展到无原生质体的分裂（衰退现象）。,第三节 原生质体融合 使不能通过有性过程杂交的亲本之间进行核基因的重组或胞质基因的重组。 技术体系包括诱导原生质体的融合、选择融合体或杂
12、种细胞及杂种植株的再生与鉴定。 一、原生质体融合技术 早期使用的有NaNO3法、高钙高pH法、PEG法等，后来相继发展了PEG与高Ca2+、高pH值相结合的方法(也简称PEG法)、电融合法以及聚集微束激光法。目前，广泛使用的是PEG法和电融合法。,*NaNO3方法* 1909年：Kuster证实引起亚原生质体融合 1970年：Power报道可重复控制原生质体融合 1972年：诱导原生质体融合获得首例杂种植株; 不足：异核体形成频率不高,*高pH-高钙法* 1973年：Keller和Melchers用pH10.5，CaCl2溶液在37C时，诱发烟草叶肉原生质体融合。 不足：对细胞有毒害作用。,*
13、聚乙二醇(PEG)* 1974年：Kao KN和Michayluk采用此法大大提高融合频率 1976年：Kao发现用高浓度Ca离子清洗PEG，比用培养基清洗产生的融合频率更高; 特点: 融合频率高; 可重复性强; 诱发融合无特异性(植物+植物;植物+动物;动物+酵母) 毒性较低,聚乙二醇(PEG)法的原理 PEG是一种带负电性的高分子化合物，在原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以使原生质体凝聚。在洗脱过程中，PEG将被洗掉，导致质膜表面电荷重排。粘连的质膜大面积紧密相连，电荷的重排队导致一个原生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正性电荷部位相连而导致融合。,示意图,*物理方法* 主要采用电融合
14、的方法:把一定密度的原生质体悬浮液置于两端装有电极的融合室 ,在不均匀交变电场的作用下,原生质体彼此靠近,接触,排成一条链,再给一个点脉冲,使原生质膜发生可逆性电击穿,从而导致融合。设备为电融合仪。,电场使原生质体表面电荷偶极 化，沿着电极排列，形成串珠,施加脉冲电场后，形成串珠的原生质体在 质膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流,原生质体融合,二、植物体细胞的杂交组合 1、根据原生质体是否同源,融合方式可分为: 自发融合-在酶解细胞壁的过程中,有些原生质体能彼此融合形成同核体,是由细胞间的胞间连丝扩展和粘连而成,无意义; 诱导融合-不同源的原生质体,在物理或化学的方法诱导下,融合成为异核体。
15、,2、植物体细胞杂交方式有： （1）对称体细胞杂交：指双方原生质体直接进行融合，双亲完整原生质体融合使所有遗传物质均匀混合和重组形成对称杂种。 （2）非对称杂种和胞质杂种：在原生质体融合前用物理射线（X、紫外线）照射其中一个亲本使部分染色体被破坏失活或完全破坏。,非对称杂交: 亲本1(细胞核+细胞质)+亲本2(少量核物质+细胞质) 细胞质杂交: 亲本1(细胞核+细胞质)+亲本2(细胞质) 目前，细胞融合非对称杂交、细胞质杂交被广泛采用,第四节 杂种细胞筛选和体细胞杂种鉴定 一、杂种细胞筛选 原生质体融合可得到几种不同类型的产物，包括原生质体同源融合产生的同核体、异源融合产生的异核体、以及未发生
16、融合的两亲本原生质体，因此要借助一些特殊方法将种细胞筛选出来进行单独培养。,1、物理选择法： 利用异核体与同核体及未融合的原生质体之间在物理特性上的差异进行选择，即利用两亲本天然的颜色差异，挑选融合后的兼具双亲颜色的异核体，如马铃薯二倍体融合时，利用子叶原生质体含较多的叶绿体，下胚轴原生质体含较少叶绿体作为标记，挑选融合细胞。,2、互补选择法： 利用天然或人工诱发的营养缺陷型及抗性细胞系对异核体进行选择。亲本原生质体由于都带有缺陷，在培养基上不能生长，只有融合的异核体能正常生长。利用转基因技术将外源抗性标记基因转移到亲本材料中进行辅助筛选也可以大大提高体细胞杂种筛选的效率。,二、体细胞杂种鉴定
17、 对筛选出来的体细胞杂种还必须做进一步的鉴定，可以从形态学、细胞学、生化及分子生物学等方面进行。 形态学鉴定-考察双亲植物,观察株高,株型,叶片大小,形状,气孔的大小与多少,花的形状,大小及颜色等;,生物化学和分子生物学鉴定-同功酶(酯酶,过氧化物酶,苹果酸脱氢酶,乙醇脱氢酶等)谱分析;叶绿体DNA,线粒体DNA,核DNA等; 抗性分析-检查是否存在双亲具有的某些抗性; 育性分析-花粉粒的大小,形状,活性,能否开花结实,有无种子等;,第五节 原生质体的植株再生 原生质体分化为再生植株通过两条途径: 1、原生质体再生的愈伤组织直接转移到分化培养基上,一步成苗。关键是选择合适的培养基和激素平衡; 2、愈伤组织在含细胞分裂素(0.52.0mg.L-1)和低浓度生长素(0.020.2)的分化培养基上形成质地较硬的胚性愈伤组织或胚状体，再转到含细胞分裂素的分化培养基上再生植株。,体细胞杂种植株再生的程序,