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1、第十二章 植物种质资源的离体保存,为什么要进行种质资源保存? 在植物组织或细胞的培养过程中,不断的继代培养会引起染色体和基因的变异,可能导致细胞的全能性丧失,也可能丢失一些宝贵的特殊性状;,一些观赏植物珍贵、稀有的物种以及具有抗虫、抗病、抗毒、抗不良环境潜能的地方栽培品种已经灭绝或濒于绝种。此外，随着植物育种技术的发展，高产品种单一化现象日益明显，植物遗传基础也越来越狭窄。植物种质资源保存已成为全球性关注的课题。,植物种质资源保存方式,异位保存,原位保存,资源圃,种质库,种子库,离体保存,野外保存植物种质资源需要大量的土地和人力资源， 成本高， 且易遭受各种自然灾害的侵袭。 种子库只能保存“正
2、常型”种子， 对于“顽拗型”、脱水敏感的种子和有性繁殖困难的植物则无能为力，而且种子库仅能保存基因， 而不能保存特定的基因型材料。,第一节 缓慢生长保存 通过调节培养条件，抑制保存材料生长，实现延长继代时间，减少操作和节省劳力的保存方法。影响离体保存的因素有保存时的光照、温度、湿度、季节变化，培养基中生长调节物质，种质资源的地理分布和生态类型等，可以根据具体材料采取不同的方法来延缓其生长。适合于短期保存方法。 最大优点是使保存材料维持不断生长， 取出部分材料进行鉴定或用于育种之后， 其不足部分可由余下的材料补充。,1降低培养温度 降低培养温度是植物组织培养物缓慢生长保存最常用的方法。在4的黑暗
3、条件下离体培养的草莓品种的茎培养物保持其生活力长达6年之久， 期间只需每几个月加入新鲜的培养液。葡萄和草莓茎尖培养物分别在9和4下连续保存多年， 每年仅需继代一次。 通常认为，温带植物在0 6下保存，而热带植物最适低温为1520。,2. 培养基中添加生长调节物质 常规组织培养是在培养基中添加生长素或细胞分裂素以促进外植体的生长和发育。而试管苗种质保存添加的则是生长延缓剂或生长抑制剂来抑制保存材料的生长，延长其继代周期。离体保存常用的生长调节物质有ABA、CCC、PP333、B9、MH等。 3. 降低培养环境中的氧气浓度 通过降低培养材料周围的大气压力或氧含量来保存植物组织培养材料，,生长素或细
4、胞分裂素,ABA（脱落酸）等是天然的生长抑制剂,阻碍RNA聚合酶活性，抑制DNA合成,原理：,青鲜素（MH）、CCC、B9和PP333（多效唑）等,降代氧分压，改变培养环境的气体状况，抑制外植体的细胞生理活动，延缓衰老；方法是在保存的材料上覆盖一层矿物油（石蜡、硅酮油等）或降低培养环境的氧分压；,此方法始于80年代在烟草上的研究,可利用的氧降低到60%，在6周内，培养物生长减少60%-80%,4. 提高培养基渗透压 提高培养基的渗透压可抑制培养材料的生长。最常用的方法是在培养基中加入甘露醇、醇等。这类化合物是惰性物质，不易被外植体吸收，抑制外植体生长的作用持久。其作用机理是提高培养基的渗透势负
5、值，造成水分逆境，降低细胞扩大生长所必需的膨压，使细胞吸水困难，减弱新陈代谢，延缓细胞生长，同时细胞壁酶的活性受到抑制，生长受阻，减少了养分消耗。,2-3%,蔗糖,此方法最早在木薯和马铃薯上应用,5适宜的光照强度 光因子对植物的光合作用和生长有着重要的影响。调节光照强度以达到最佳的保存效果也是种质保存经常使用的方法之一。在较弱光照条件下，培养材料由于光合作用弱，生长缓慢而利于保存。 6培养基的营养控制 植物生长发育依赖外界养分的供给，如果养分供应不足，植物生长缓慢，植株矮小。因此采用降低培养基中的养分水平也可有效地抑制细胞生长，达到保存的目的。,7合适的包扎物 试管的包扎物也对保存材料的生长有
6、影响，主要表现在不同的封口材料对试管中气体成分及其含量等的变化，培养基的风干、污染等有不同程度的影响。因此，选择合适的包扎物对保存效果的影响很大。铝箔封口保存效果最佳，保持湿度效果好，还可以防止污染，而使用棉塞时间过长容易造成污染;使用橡皮塞容易造成缺氧，使材料死亡。,Meristem,Knop培养基：无IAA，低K,切成带叶茎段,9 C,每年材料继代培养一次，保存15年,第二节 超低温保存 通常将-80以下的温度称为超低温。超低温冷冻保存一般以液氮为冷源，使温度维持在-196。生物材料在如此低温下，活细胞内的新陈代谢和生长活动几乎完全停止，处于“生机停顿”状态，因而可使植物材料在该温度下不会
7、发生遗传性状的改变，但细胞活力和形态发生的潜能可保存。,避免细胞和组织的染色体数目因长期继代而发生的变化和离体材料在长期无性繁殖过程中可能造成的退化和病虫侵害，从而有效、安全地长期保存那些珍贵稀有的种质。 同时，它还有利于国际间进行种质交换，为遗传育种和理论研究提供较好的材料。,超低温保存的基本操作程序 1. 材料的选择和预处理 基因型、抗冻性、器官、组织和细胞的年龄、生理状态等因素对保存效果有较大的影响。因此，在进行超低温保存前，材料的选择十分重要。,一般来说，体积小、细胞质稠密、无液泡、薄壁的小分生细胞的存活率高于含大量液泡的大细胞；茎尖生长点、愈伤组织等培养物，解冻后只有具有上述特征的细
8、胞才能存活。 而较大的植物材料，如茎尖、胚或试管苗等，由于高度液泡化的细胞易受损伤，冷冻后只有分生细胞能够重新生长。,低温锻炼：可以激活植物体内的抗寒机制，如提高膜磷酸脂的不饱和程度，诱导抗冻蛋白的产生等，进而提高冷冻后的成活率。 继代培养：处于有丝分裂前后的细胞抗冻能力强，处于该时期的细胞超低温保存后具有较高的成活率。 预培养：在预培养基中加入冷冻保护剂或诱导抗寒力的物质，如蔗糖、山梨醇、聚乙二醇、丙二醇、二甲基亚砜（DMSO）、脱落酸（ABA）等，以提高材料的存活率。,2. 冰冻方法 快速冰冻法 将材料从0或预处理温度直接投入液氮，其降温速度在1000/分钟以上。这个过程可以使细胞内的水分
9、子还未来得及形成结晶中心就降到了-196的安全温度，从而避免了细胞内结冰的危险。此法适用于那些高度脱水的材料，如种子等。,慢速冰冻法 采用逐步降温的方法，以0.52/分钟的降温速度，从0降到-30，-35或-40，随即投入液氮，或者以此降温速度连续降温到-196。逐步降温过程可以使细胞内水分有充足的时间不断流到细胞外结冰，从而使细胞内水分含量减少到最低限度，达到良好的脱水效果，避免细胞内结冰。这种方法适合于液泡化程度较高的植物材料，如悬浮细胞、原生质体等。,分步冰冻法 首先用较慢的速度（0.54/分钟）使植物材料从0降至一定的预冷温度（一般为-40）并停留一段时间（一般10分钟左右），使细胞进
10、行适当的保护性脱水，然后再浸入液氮冷冻。 逐级冰冻法 植物材料经过冷冻保护剂0预处理后，逐级通过-10，-15， -23，-35，-40等，每个温度停留10 分钟左右，然后浸入液氮。,干燥冰冻法 将样品在含高浓度渗透性化合物（如甘油、糖类物质等）培养基上培养一段时间，或者经硅胶、无菌空气干燥脱水数小时，或者用褐藻酸钙液泡包裹样品，无菌风进一步干燥，然后直接投入液氮；或者用冷冻保护剂处理后吸除表面水分，密封于金箔中进行慢冻。只要脱水足够，细胞内溶液浓度即可达到较高水平因而易进入玻璃化状态。这种方法对某些植物的愈伤组织、体细胞胚、胚轴、胚、花粉、茎尖及试管苗等较合适。,3. 化冻和洗涤 目前，多数
11、研究采用快速化冻的方式， 即将保存后的外植体材料在2540的水浴中化冻12分钟，材料迅速通过冰晶生长区（-60-40)，从而避免了细胞再次结冰而造成的伤害。在一些研究中，采用室温流动空气、自来水冲洗等进行材料化冻也取得了较好的效果。化冻后的材料需立即进行洗涤， 以除去材料组织中高浓度的冷冻保护剂，避免影响材料恢复和继续生长。,4. 活性检测和恢复培养 冻后存活率的快速鉴定通常采用FAD荧光双醋酸法、TTC(氯化三苯四氮唑)还原法、Evans蓝法等。这些方法均以细胞内某些酶的活力检测为标准，不能完全表征细胞与组织的再生能力。因此冻存后材料的活力不能仅以此衡量。,5. 超低温保存后的遗传稳定性 种质资源保存的最根本的目的是保持遗传基因的稳定，控制遗传性状不发生变化。因此超低温冻存后材料的遗传特性的检测是十分必要的。,