山东省艾滋病检测实验室操作规范(白).ppt

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1、1,艾滋病检测实验室操作规范,济宁市疾病预防控制中心 白传记,2,目录,一.管理依据 二.制定相应规章制度、安全守则、SOP 三.实验室检测要求（检测样本的管理、检测方法、试剂、结果的判读、报告、质量控制,3,一、管理依据,法规： 病原微生物实验室生物安全管理条例 全国艾滋病检测工作管理办法 标准：实验室生物安全通用要求 规范：生物安全实验室建筑技术规范 全国艾滋病检测技术规范 导则：实验室生物安全手册（WHO） 医学实验室生物安全要求（ISO15190）,4,实验室分级,1、艾滋病参比实验室 2、艾滋病检测确证实验室 （1）艾滋病确证中心实验室 （2）艾滋病确证实验室 3、艾滋病检测筛查实验

2、室 （1）艾滋病筛查中心实验室 （2）艾滋病筛查实验室 （3）艾滋病检测点,见全国艾滋病检测工作管理办法,5,艾滋病筛查实验室职能,1、开展艾滋病病毒抗体的筛查实验，根据需要可开展其他艾滋病检测工作。 2、负责将艾滋病病毒抗体筛查呈阳性反应的样品送当地艾滋病筛查中心实验室。 3、定期汇总艾滋病检测资料，并上报当地艾滋病筛查中心实验室。 4、对自愿咨询检测工作提供技术支持。,6,艾滋病病人的确诊需要三级实验室完成,因为艾滋病是一种不能彻底治愈的传染病，它的感染常与多性伴和吸毒等行为紧密相关。感染者不仅要面对HIV感染带来的身心痛苦，可能还要面对歧视，或是道德上的评判，对日常工作和生活造成严重影响

3、。因此，对一个人做出艾滋病的诊断要十分慎重。实验室检测结果是做出感染HIV诊断的惟一依据，所以，艾滋病的检测与其他大多数传染病的检测不同。其检测方法和结果报告要严格按照国家规定的程序进行，以维护受检者的合法权利。,7,目前我省实验室数,截止到2007年8月底我省共有艾滋病检测实验室497个 （1）艾滋病确证中心实验室 1个 （2）艾滋病确证实验室 2个 （3）艾滋病筛查中心实验室 18个 （4）艾滋病筛查实验室 477个,8,497个艾滋病检测实验室在各市分布,9,497个艾滋病检测实验室系统分布,10,人员、建筑、设备要求,（一）艾滋病筛查中心实验室及艾滋病筛查实验室。 1、人员条件 至少由

4、3名医技人员组成，其中具有中级卫生技术职称人员至少1名。负责筛查试验的技术人员需具有2年以上从事病毒性疾病血清学检测工作经验，接受过省级以上艾滋病检测技术培训，并获得培训证书。 2、建筑条件 实验室或检测区域应分为清洁区、半污染区和污染区，应符合二级生物安全实验室（BSL-2）要求。 3、仪器设备条件 至少包括酶标读数仪、洗板机、普通冰箱、水浴箱（或温箱）、离心机、加样器（仪）、消毒与污物处理设备、实验室恒温设备、安全防护用品和生物安全柜。,见全国艾滋病检测工作管理办法附件,11,二.规章制度、安全守则、SOP,实验室管理制度 实验室生物安全守则 标准操作程序（SOP） 样品接受，登记和处理

5、检测方法和步骤 仪器使用维护和校准 实验中的质量控制 结果解释与报告 保密程序 检测数据的记录与保存 追踪和处理 实验室的清理和消毒 实验室安全防护 实验室应急突发事故处理制度,12,13,14,编写要求,1.SOP 是书面质量体系中的一个很重要的部分。SOP是指导完成检测工作的一整套书面操作指南，因而每个实验室应就本实验室所有重要工作制定相应的SOP。 2.每一个检测项目都应该制定一份SOP，其中包含有详细的操作程序，例如实验室实验条件(温度等)、仪器的使用和维护、试剂、质控品、校准品的使用等(设备和试剂盒说明书作为附录)，以避免或减少因不同的操作者所引起的误差。 3.SOP由各岗位工作人员

6、起草，实验室负责人审定。实验人员在操作时应该严格按照SOP进行，实验室主管人员应该督查实验人员执行SOP。必要时，SOP中的内容，如说明书或相关内容，应该在实验室主管人员的领导下进行修订. 4.每年至少修订一次。修订后的SOP按审批程序批准后使用。,15,实验室应有的纪录,1.工作人员培训纪录 2.健康监护档案 3.实验室出入登记（外来人员） 4.仪器使用、维护、校准纪录 5.实验室温度、湿度纪录 6.各种试验的原始纪录 7.样本接收、保存纪录 8.试剂使用纪录 9.废弃物处理纪录 10.质量控制纪录,16,档案管理,原始记录包括实验原始记录表、打印数据、膜反应条带或其照片、检测记录表、标本登

7、记记录、标本保存记录以及仪器设备维修和校准记录等重要记录都应该妥善存档保存15年以上。推荐同时使用计算机保存各种文件和记录。内含病人姓名的所有工作记录一定要保密。 参见规范第8页,17,三、实验室检测要求,1.检测样本的管理 2.检测方法 3.试剂选择和使用 4.试验结果的判定、结果报告 5.质量控制,18,1、检测样本的管理,制定标准操作程序（SOP），并严格按照要求去做,样品采集、运输和保存,样品的采集,19,采集病原微生物样本应当具备下列条件,(一)具有与采集病原微生物样本所需要的生物安全防护水平相适应的设备； (二)具有掌握相关专业知识和操作技能的工作人员； (三)具有有效的防止病原微

8、生物扩散和感染的措施； (四)具有保证病原微生物样本质量的技术方法和手段。 采集高致病性病原微生物样本的工作人员在采集过程中应当防止病原微生物扩散和感染，并对样本的来源、采集过程和方法等作详细记录。,病原微生物实验室生物安全管理条例,20,采血针,21,1. 血清、血浆 2.标本采集时应尽量避免溶血、长菌 3.抗凝不完全的标本因纤维蛋白元的干扰而造 成假阳性 4.冰箱中保存时间过长易导致血清IgG聚合 5.避免交叉污染,标本的采集和保存,22,针头处理,针头收集器,正确的取针头方式,23,错误的取针头方式,24,采集样本的注意事项,保障工作人员、病人和环境的安全 保证样品的质量（避免溶血、及时

9、分离血清、合理的存放） 样本的正确标示（编号与登记表一致） 职业暴露的预防,25,样本的保存,分离血清 即时检测的样品（1-2天内），可存放于2-8冰箱，最长时间一周。 如需长期保存，应将分离的血清或血浆存放于-20冰箱内。 选择合适的冻存管。,26,样品的运送,中华人民共和国卫生部令 第45号 可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定已于2005年11月24日经卫生部部务会议讨论通过，现予以发布，自2006年2月1日起施行。 部长 高强 二五年十二月二十八日,27,样品包装,采用提出的三级包装系统。 第一层容器：装样品，要求防渗漏。样品应置于带盖的试管内，试管上应有明显的标

10、记，标明样品的编号或受检者姓名、种类和采集时间。在试管的周围应垫有缓冲吸水材料，以免碰碎。 第二层容器：要求耐受性好、防渗漏、容纳并保护第一层容器，可装多个第一层容器。将试管装入专用带盖的容器内，容器的材料要易于消毒处理。 第三层容器：放在一个运输用外层包装内，应易于消毒。外面要贴标签（数量，收、发件人）。,28,第一层容器,第二层容器,第三层容器,29,安全运送： 无损坏，不倾倒，无泄漏。 及时运送：按时送到，不失时效 必要条件：保证适宜温度，不受污染， 无失误：无地址人名不清，造成错送或延误。,感染性样本的运输要求,30,感染性样本的运输要求,严格按照可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）

11、种或样本运输管理规定 和全国艾滋病检测技术规范的要求运送。 阳性样本填写HIV抗体复检化验单，用微机打印。送检单项目必须填写完全、规范。 除特殊需要外，一般不能用全血。,31,可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输包装标识,1.高致病性病原微生物危险标签,2.高致病性病原微生物运输登记表,3.外包装放置方向标识,32,2、HIV实验室检测方法分类,一.抗体检测 (IgG, IgM,IgA) 初筛实验 ELISA(EIA) 第四代 胶体金/硒 层析、渗滤 明胶颗粒凝集 凝集法 确认实验 蛋白印迹(Western Blot, WB) 免疫荧光(IFA) 二. 抗原检测 (P24) 三.

12、 核酸检测 (RNA, DNA) 四. 病毒分离,33,抗体检测,抗体检测 诊断的金标准：HIV特异性抗体检测 EIA（高敏感性）+ WB（高特异性）诊断的准 确率大于99%，假阳性率约为0.0006%，造成错误诊断的机会几乎是0。 抗体检测唯一的问题是窗口期可以出现假阴性,34,实验前试剂准备,1.观察外包装，内主份有无漏液，注意效期等。 2.仔细阅读说明书，严格按照试剂说明书进行操作。 3.操作前将试剂在室温下平衡30-60分钟，保证酶等液体的初始反应温度及活性剂的溶解。 4.核对样本编号 5.检查孵育温度 6.检查洗板机管道的畅通及程序 7.一次性手套、隔离衣、口罩等 8.消毒物品 9.

13、污物桶、缸 10.做好试验原始记录,35,36,加样过程应注意的问题,1.血清或血浆标本分离不好即进行加样。 2.漏加样品或加样量不足。 3. 加液器的校正。 4.手工操作中，加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长。,37,温育过程中出现的问题及解决办法,1.温箱温育时未贴封片或加盖，使标本或稀释液蒸发，吸附于孔壁，难于清洗彻底； 2.温育时间人为延长，导致非特异性结合，难以清洗彻底。 3.温育时温度不符合说明书的规定范围。,1.按规定加盖封板膜。 2.按说明步骤严格控制温育时间。 3. 严格控制温育仪器（水浴箱、孵箱、全自动酶免）的温度，建议在仪器内放置测量工具（全自动酶免除外）。,38

14、,洗板过程中易出现的几点情况,1.采用手工洗板,孔与孔之间液体容易交叉，切不可随意洗板。 2.采用洗板机洗板时，洗液注入孔中量不足，导致洗板不彻底，造成本底高。 3.由于血液中纤维蛋白原 ，造成洗板针堵塞，抽吸不完全，造成洗板不畅，导致洗板效果差，直接影响本底。 4.反应板过多，不能保证及时洗板，造成洗板等待时间过长，影响结果。 5.洗板前先将孔内液体甩出包被板。,39,显色过程中易出现的问题,1.显色剂配制后放置时间过长或使用已经变色失效的显色剂； 2. 用排枪加A、B混合液时，加样槽不够干净，造成花板 。 3.不同厂家试剂的显色液混用。,40,终止和读数时的注意事项,1加完终止后30分钟内

15、读取数据。 2读板时板底如果不清洁，就会导致所读的数据不准确，所以在读数前尽量保证酶标板的底部是清洁的。,41,初筛试剂的选择,1 、初筛检测的宗旨是避免漏检。 2、筛查试剂必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、批批检合格、临床评估质量优良、在有效期内的试剂。目前常用的筛查试剂有酶联免疫、颗粒凝集和其它快速诊断试剂。采供血机构进行血液筛查应采用HIV-1/2混合型酶联免疫试剂。自采自供血的单位必须进行HIV抗体检测，在尚未建立艾滋病筛查实验室的偏远地区可由经过培训的技术人员在规定的场所用快速试剂进行血液筛查。,42,2007年山东HIV抗体诊断试剂临床质量评估（ELISA）结果,43,200

16、7年山东HIV抗体诊断试剂临床质量评估 （快速）结果,44,ELISA和PA对强阳性样品的滴度测定,所用ELISA试剂为生物梅里埃HIV 试剂盒, 其Cut off值为0.150,45,ELISA和雅培测定对比,所用ELISA试剂为丽珠HIV 试剂盒, 其Cut off值为0.230,46,结果判定,药品生产质量管理规范（GMP）新生物制品审批办法于1999年3月26日经国家药品监督管理局局务会审议通过，现予发布。本规定自1999年5月1日起施行。CUT OFF值的确定：正常人标本测定人数应在400人份以上，所得数据经统计学处理。 通常是阴性对照均值+常数 严格按照说明书要求判定结果,47,报

17、告,1.对HIV抗体筛查试验，呈阴性反应者可出具“HIV抗体阴性”报告。 2.对初筛试验呈阳性反应者不能出阳性报告，可出具“HIV抗体待复查”报告。,见全国艾滋病检测技术规范附表1,48,临床由于HIV检测导致的医疗纠纷,1，阳性结果未确认就报告给被检验者。但确认为阴性。 2，使用不规范试剂的检测结果被告知。 3，使用低质量试剂，造成阳性漏检，但病人手术输血后发现HIV。 4，检测HIV的记录未有详细规范记录。在“举证倒置”中陷于不利地位。,49,示例1,50,示例2:王 女 21岁,51,4、质量控制,实验室内部质量控制 样品接收-处理-检测-报告 样品保存 实验外对照质控品的应用 质控图

18、标准操作程序 设备/环境质控 数据质控,52,内、外部对照质控血清,1、内部对照质控血清是指每个试剂盒内厂方提供的一套阴性和阳性对照（弱阳性对照） 2、是为了监控实验的重复性和试剂盒的稳定性而由实验室自己制备的对照。 3、理想的外部对照应该包括阳性对照、弱阳性对照、临界值对照和阴性对照。在每次实验时应设置一个单一浓度水平的质控品即弱阳性对照。这个弱阳性对照的值以设定在该试剂盒Cut-off值的23倍为宜。,53,外部对照质控血清的来源和选择,1）通过向有关机构购买获得 2）通过实验室制备获得 ( 比较经济的方法 ),54,制备外部对照的方法,1. 阳性血清 2. 阴性血清（稀释血清） 3. 临

19、界值对照的OD/CO+23倍 4. 重复20次结果绘制质控图 5. 外部对照3000rpm15min去除沉淀，用0.2m 生物滤膜过滤除菌后，56加热30min灭活处理，分装，-20保存备用。,55,外部对照质控血清的保存,1）外部对照血清或血浆的一次制备量应该足够本实验室一年使用 2）外部对照血清应该均一、无菌 3）外部对照血清标定后应该等量分装，每个分装的量应足够一周使用 4）外部对照应该分类作好标记 5）外部对照血清应该存放在70 ，如无条件则存放在非自动除霜的20 冰箱 6）外部对照血清一旦融解以后应该存放在 28 ，一周后必须弃去，不能重新冻存。,56,20次外部对照的OD值,57,

20、建立质控图参数, 算术平均值( x )代表一组OD值数的平均值。 标准差(s) ;是描述样品与均数之间离散程度的一个指标，是与对照质控血清S/CO值均值有关的预期范围。 变异系数(cv);是反映各次S/CO值相对于均值离散程度的一个指标，可以用来衡量检测的重复性或精密度.变异系数(cv)小于20，表示外部对照处于稳定状态。,58,59,质控图的判定和分析,告警（12S）：当质控物的测定值超出 +2s范围时，系统处于告警状态，应予注意，是否可以继续检测需要进一步观察。若将12S做失控标准，有较高的假失控概率，所以一般不采用。 失控（13S）：当质控物的测定值超出 +3s范围时，系统处于失控状态，

21、本次实验结果不能被接受，可能是系统误差或外部对照滴度下降造成。,60,位移,如果几个连续质控对照值 (3-5次) 都落在均值(中心线)的一边则称之为位移，通常表示存在大的变化 ( 失控 )。 引起位移的原因有使用新批号的试剂盒、使用新试剂、实验员的更换、孵育温度的改变、仪器 ( 移液器 ) 故障等。,61,趋势,当几个连续质控对照值(5-7个)几乎按一个方向分布时称之为趋势(失控)，通常由参数的缓慢改变引起，如试剂失效和移液器逐渐不准确等。 发生趋势的最常见的原因是试剂(如酶标记物)或对照的失效。,62,定期分析和总结,1、每月定期召开质控分析会，讨论本月的质量控制情况。 2、要在常规条件下建

22、立质控图参数，用S/CO比值绘制质控图。 3、采用自制的质控物，是一种经济的方法，关键是要确保质控物的性质稳定; 4、使用新批次的外部对照质控物时，必须重新绘制质控图。,63,5、建议长期和稳定地使用一种质量好的试剂盒，更换不同厂家的试剂盒后，必须重新绘制质控图。改用新批号试剂盒也应重新制作质控图。 6、发现质控结果失控，应填写报告单，上交质量负责人，分析原因并决定是否发出检测报告。,64,张贴在实验室门上的生物危害警告标志 实验室生物安全手册（第三版）WHO2004,65,实验室标示,66,实验室标示,67,洗眼器,68,紧急喷林和洗眼装置,69,防护面罩、防护镜,70,一次性防护用品,71,生物安全手册和作业指导书,72,近期工作,对到期的艾滋病筛查实验室进行考核,73,谢谢,